Biology

Enkeltcelle proteomisk forberedelse til massespektrometrianalyse ved hjælp af frysevarmelysis og en isobarisk bærer

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802

Aleksandra A. Petelski*¹, Nikolai Slavov^1,2,3, Harrison Specht*¹

¹Department of Bioengineering, Northeastern University, ²Barnett Institute, Northeastern University, ³Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

Summary

I denne protokol beskriver vi, hvordan man forbereder pattedyrceller til enkeltcelleproteomanalyse via massespektrometri ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser og udstyr med muligheder for både manuel og automatisk pipettering.

Abstract

Enkeltcellet proteomanalyse kræver følsomme, kvantitativt nøjagtige, bredt tilgængelige og robuste metoder. For at opfylde disse krav blev Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) -protokollen udviklet som en andengenerationsmetode til kvantificering af hundreder til tusinder af proteiner fra begrænsede prøver ned til niveauet for en enkelt celle. Eksperimenter ved hjælp af denne metode har opnået kvantificering af over 3.000 proteiner på tværs af 1.500 enkeltpattedyrceller (500-1.000 proteiner pr. Celle) på 10 dages massespektrometerinstrumenttid. SCoPE2 udnytter en frysevarmecyklus til cellelyse, hvilket undgår behovet for oprydning af enkeltceller og dermed reducerer prøvetab, samtidig med at prøveforberedelsen fremskyndes og automatiseringen forenkles. Derudover bruger metoden en isobarisk bærer, som hjælper proteinidentifikation og reducerer prøvetab.

Denne videoprotokol giver detaljeret vejledning for at muliggøre vedtagelse af automatiseret enkeltcelleproteinanalyse ved kun at bruge udstyr og reagenser, der er bredt tilgængelige. Vi demonstrerer kritiske trin i proceduren for forberedelse af enkeltceller til proteomisk analyse, fra høst op til injektion til væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse. Derudover styres seerne gennem principperne for eksperimentelt design med den isobariske bærer, kvalitetskontrol for både isobariske bærer- og enkeltcellepræparater og repræsentative resultater med en diskussion af begrænsninger i tilgangen.

Introduction

Enkeltcelleanalyse bruges i vid udstrækning til at studere niveauet af heterogenitet inden for biologiske systemer, som ellers ikke ville kunne skelnes ved bulkmålinger ^1,2,3. En sådan cellulær mangfoldighed kan have funktionelle konsekvenser, der kan fremme forståelsen af integrerede biologiske processer, fra kræftcelleterapeutisk resistens ^4,5,6 til celle-til-celle heterogenitet i diabetes 7,8,9,10. Mange undersøgelser har fokuseret på måling af nukleinsyrer i enkeltceller ved at måle genetiske eller transkriptomiske niveauer og har muliggjort klassificering af celletyper og tilstande. Sådanne fremskridt i nukleinsyrerummet kan imidlertid ikke udfylde vidensgabet i post-transkriptionel regulering¹¹, hvilket driver behovet for tilsvarende proteinmålinger med høj kapacitet i enkeltceller^12,13,14,15.

Vi har udviklet SCoPE2^16,17 for at imødekomme efterspørgslen efter streng og robust enkeltcelleproteomik af pattedyrsystemer. Det er en multiplekset metode, der giver mulighed for øget gennemstrømning ved at mærke og analysere mange celler parallelt¹⁸, i modsætning til etiketfrie mthods, der analyserer en celle ad gangen^19,20. Prøveforberedelsesmetoden, massespektrometrimetoden og efterfølgende dataanalysetrin muliggør nøjagtig kvantificering af hundreder til tusinder af proteiner pr. Enkelt celle. Denne metode gør massespektrometrianalyse af enkeltceller mulig gennem den isobariske bærer²¹, en lille bulkprøve af celler (normalt 25-200), der biologisk ligner den enkeltcellede population af interesse. Dette bærermateriale multiplekseres i et sæt med en referencekanal af samme materiale og enkeltceller ved brug af tandemmassemærker (TMT-etiketter). Bærekanalen reducerer prøvetab til overfladearealer og tilvejebringer ionens rygradsfragmenter til vellykket peptididentifikation. Referencekanalen, som fremstilles i bulk og efterfølgende fortyndes ned til 5-10 celleækvivalenter for hvert enkeltcellesæt, hjælper med at kontrollere teknisk variabilitet i analysen. Specifikt giver referencen mulighed for normalisering af variabilitet forårsaget af LC-MS / MS-relaterede effekter, såsom ionprøvetagning og ioniseringseffektivitet. Normalt er reference- og bærerkanalerne lavet fra den samme cellepopulation.

Denne prøveforberedelsesprotokol er en andengenerationsmetode, der bygger på SCoPE-MS²² ved hjælp af flere synergistiske forbedringer. Forbedringerne omfatter en cellelysemetode, der undgår prøveoprydning, hvilket er et almindeligt trin i MS proteomics-præparater. Det bruger mPOP (minimal ProteOmic prøveforberedelse)²³, som er en fryse-varmelysemetode. Denne metode muliggjorde lysis af enkeltceller i mindre mængder og i multiwell-plader snarere end i hætteglas, hvilket lettede en højere gennemstrømningshastighed og automatisering af termiske cyklister. Alt i alt har denne metode sænket omkostningerne pr. Enkeltcelle og øget kvantitativ nøjagtighed sammenlignet med SCoPE-MS^16,24.

Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder enkeltceller til proteomisk analyse, herunder hvordan man forbereder bærer- og referencekanalerne ved hjælp af TMTpro 18-plex isobariske etiketter. Pattedyrceller, der er i encellesuspension, og som kan isoleres i 384-brøndplader, er sandsynligvis modtagelige for denne protokol. Også inkluderet er repræsentative resultater af vellykkede enkeltcellesæt, der viser flere kvalitetskontrolplots genereret af en R Shiny-app, DO-MS²⁵. Andre offentliggjorte softwareværktøjer 26,27 og eksperimentelle retningslinjer ^17,21 har forbedret vedtagelsen af denne protokol. Vi håber, at denne visuelle guide yderligere vil hjælpe forskere med at udføre enkeltcelleproteomiske eksperimenter.

Protocol

BEMÆRK: I denne protokol er stuetemperatur (RT) 18-22 °C.

1. Generering af bære- og referencemateriale

Celle isolering
1. Saml celler af interesse i cellesuspensioner i iskold 1x PBS.
  BEMÆRK: Hvis det er muligt, bør bærer- og referencematerialet fremstilles ud fra den eller de cellepopulationer, der er valgt til undersøgelse på enkeltcelleniveau. Et tilsvarende antal celler fra de forskellige forsøgsbetingelser (såsom stimulerede og ustimulerede immunceller) bør udgøre bæreren og referencen. I situationer, hvor et stort nok antal af disse celler ikke kan høstes, bør en passende cellepopulation vælges baseret på biologisk lighed.
2. Ved hjælp af et hæmocytometer eller andre midler til celletælling (såsom FACS) tælles antallet af celler i suspensionen.
3. Spin ned og resuspender 22.000 celler af hver celletype i 11 μL HPLC-vand separat i PCR-rør (standard 250 μL PCR-rør).
  BEMÆRK: Antallet af celler, der anbefales her, er tilstrækkeligt til bærerne og referencer til antallet af sæt, der kan fremstilles ud fra en 384-brøndplade fuld af enkeltceller. Celleinputtet i dette trin og reagensmængderne i efterfølgende trin kan skaleres proportionalt for et større antal sæt. Hastigheden af spinning ned er afhængig af laboratoriets cellekulturpraksis. Et typisk spin down: 300 × g i 5 min.
4. Prøverne overføres til en -80 °C fryser i mindst 30 min.
  PAUSEPUNKT: Prøver kan forblive frosne i flere måneder uden konsekvenser for enkeltcelledata.
Celle lysis
1. PCR-røret med cellerne opvarmes til 90 °C i 10 minutter (med termisk cyklerlåg indstillet til 105 °C), og lad derefter rørene køle af til 12 °C lige efter opvarmningscyklussen.
2. Hvirvel røret kort, og drej derefter ned i en bench-top PCR-rørspinner ved RT for at opsamle al væsken i bunden af røret.
3. I en vandbad sonikator sonikeres rørene i 5 minutter, og læg dem derefter på is ved RT.
Trypsin fordøjelse
1. Der tilsættes 2,2 μL af masterblandingen (se tabel 1 for komponenterne) til hvert prøverør, mens det er på is.
  FORSIGTIG: Trypsin kan forårsage hud-, åndedræts- og øjenirritation. Sørg for at bære personlige værnemidler. Håndter under en kemisk røghætte.
2. Hvirvel rørene kort for at blande og spinde ned i en bench-top PCR-rørspinner ved RT for at opsamle al væske i bunden af hvert rør.
3. Prøverne opvarmes ved 37 °C i 3 timer (med låget til den termiske cyklist indstillet til 52 °C).
TMT-mærkning reaktion
1. Spin ned prøverne efter fordøjelsen i en bench-top PCR-rørspinner på RT.
2. Hver prøve opdeles i to lige store mængder på 6,6 μL hver, således at hvert rør indeholder 11.000 celler.
3. Til rørene beregnet til bæreren tilsættes 3,3 μL TMT-etiket 126, der er blevet resuspenderet i en koncentration på 85 mM.
4. Til rørene beregnet til referencen tilsættes 3,3 μL TMT-etiket 127N, der er blevet resuspenueret i en koncentration på 85 mM.
5. Hvirvel rørene kort og drej ned i en bench-top PCR-rørspinner ved RT for at opsamle væsken i bunden.
6. Lad rørene stå ved RT i 1 time.
Slukning af TMT-mærkningsreaktion
1. Der tilsættes 1,65 μL 0,5 % hydroxylamin til hvert rør.
  FORSIGTIG: Hydroxylamin kan forårsage hudirritation. Sørg for at bære personlige værnemidler.
2. Hvirvel rørene kort og drej ned i en bench-top PCR-rørspinner ved RT for at opsamle væsken i bunden.
3. Lad rørene stå ved RT i 30 min.
Kombination af transportør og reference
1. Hvis prøver, der udgør bæreren, er blevet mærket separat, blandes dem i lige store forhold.
2. Hvis prøver, der udgør referencen, er blevet mærket separat, blandes dem i lige store forhold.
3. Bæreren blandes og referencen, således at bærerens endelige koncentration er 100-200 celler/μL, og referencekoncentrationen er 5-10 celler/μL.
4. Vurder kvaliteten af bærer- og referencematerialerne, inden de kombineres med enkeltcellesæt.
  BEMÆRK: Kvalitetskontrol af transportøren og referencematerialet kan udføres ved forskellige metoder, men det anbefales at bruge DO-MS-softwaren, der er tilgængelig på do-ms.slavovlab.net¹⁷. Kritiske målinger af kvalitet inkluderer miskleergangshastighed (<25%, en metrik beregnet som antallet af med sikkerhed identificerede peptider med en savnet spaltning divideret med antallet af selvsikkert identificerede peptider i alt) og mærkningseffektivitet (>99%, en metrik beregnet som antallet af mærkningssteder, nemlig peptidet N-terminalen og Lysin, med en etiket divideret med det samlede antal mærkningssteder).
  PAUSEPUNKT: Bæreren og referencematerialerne kan opbevares ved -80 °C, indtil det er nødvendigt.

Komponent	Bland koncentration	Endelig koncentration pr. rør
Trypsin Guld	50 ng/μL	8,33 ng/μL
TEAB, pH = 8,5	500 mM	83,33 mio. kr.
Benzonase nuklease	1.2 enheder	0,2 enheder

Tabel 1: Reagensmængde af mastermix. De endelige koncentrationer af reagenser, der er nødvendige for trypsinfordøjelsen, er anført.

2. SCoPE2 prøveforberedelse

Celle isolering
1. Suppler vand af HPLC-kvalitet med 25 fmol pr. peptid pr. μL af en syntetisk peptidopløsning.
  BEMÆRK: Waters MassPrep peptidopløsning er et eksempel på, hvad der kan bruges. Den består af syv peptider, der ikke ioniserer særlig godt. Dette er et centralt aspekt af denne løsning: disse peptider forstyrrer ikke nøjagtig massespektrometrikvantificering af enkeltceller. Enhver stærkt oprenset blanding af nogle få peptider, der sandsynligvis ikke er i prøverne af interesse, vil være passende.
2. Tilsæt 1 μL af denne blanding til hver brønd i en 384-brøndplade ved hjælp af en væskedispenseringsrobot eller manuel pipette.
3. Forsegl pladen og drej den ned i en bænkpladespinner ved RT for at opsamle væsken i bunden.
  PAUSEPUNKT: Plader med denne opløsning kan opbevares ved -80 °C, indtil det er nødvendigt.
4. Få en suspension af ikke-fikserede celler, der er opdelt.
  BEMÆRK: Hvordan nøjagtigt cellesuspensionen opnås, er baseret på celletypen af interesse. Her er brede eksempler:
  1. Suspensionsceller: Drej cellerne ned i en pellet, og fjern cellekulturmediet.
  2. Klæbende celler: Fjern cellerne fra skålen eller kolben gennem trypsinisering eller skrabning. Drej dem derefter ned for at fjerne cellekulturmediet.
5. Cellesuspensionen vaskes to gange med 1x iskold PBS. Lad cellerne være suspenderet i 1x PBS efter den anden vask.
6. Hvis pladen med 384 brønde var frosset, tøs den op ved RT. Drej den ned for at sikre, at al væske er i bunden af brøndene.
7. Brug en cellesorterer eller andre tilgængelige midler, såsom manuel håndplukning, til at distribuere enkeltceller i respektive brønde.
  BEMÆRK: Tilføj enkelte celler til brønde, mens nogle brønde er tomme for negative og positive kontroller (se diskussion). Når du bruger flowcytometri, skal du bruge den lavest mulige strømningshastighed for flowcytometeret. Lavere strømningshastighed menes at være blidere til cellehåndtering. Derudover skal dysestørrelsen være passende til brug med cellerne af interesse. Det anbefales at samarbejde med en flowcytometrifacilitet.
8. Tilføj positive kontroller af 2-5 celleækvivalenter lysat til udvalgte brønde, der pipetteres manuelt eller med væskehåndteringsrobotter.
9. Forsegl og drej pladen ned med sorterede celler i en bænkpladespinner ved RT for at opsamle væsken i bunden. Pladen fryses ved -80 °C så hurtigt som muligt.
  PAUSEPUNKT: Plader med sorterede enkeltceller kan opbevares ved -80 °C, indtil det er nødvendigt.
Celle lysis
1. Tag 384-brøndpladen med de sorterede enkeltceller og læg den i den termiske cyklist så hurtigt som muligt.
2. Pladen opvarmes til 90 °C i 10 minutter (med lågtemperaturen indstillet til 105 °C), og lad derefter pladen køle af til 12 °C.
3. Drej pladen kort ned i en bænkpladespinner på RT.
4. I en vandbad sonikator sonikeres pladen i 5 minutter ved RT, og læg den derefter på is.
Trypsin fordøjelse
1. Der fremstilles 100 μL masterblanding (se tabel 1 for komponenter) pr. 384-brøndplade.
2. Til hver brønd i 384-brøndspladen tilsættes 0,2 μL af masterblandingen fremstillet i trin 2.3.1 ved hjælp af en væskehåndterer.
  BEMÆRK: Brug større volumener, hvis der anvendes manuel pipettering, og sørg for, at de endelige koncentrationer af reagenser stadig er de samme pr. Brønd.
3. Forsegl pladen, hvirvelen i 5 s, og drej ned i en bænkpladespinner ved RT.
4. Pladen med 384 brønde opvarmes ved 37 °C (med lågtemperaturen indstillet til 52 °C) i 3 timer.
TMT-mærkning reaktion
1. Tag de 85 mM lagre af TMT-etiketter (128N til 135N) ud af -80 ° C fryseren. Varm rørene op til stuetemperatur, inden du åbner dem.
2. Fortynd etiketterne til 22 mM i vandfri acetonitril.
  FORSIGTIG: Acetonitril er en brandfarlig væske. Det kan irritere hud, øjne, luftveje og centralnervesystem. Sørg for at bære personlige værnemidler. Håndter under en kemisk røghætte.
3. Ved hjælp af denne mærkningsstrategi tilsættes 0,5 μL fortyndede TMT-etiketter til hver brønd på 384-brøndpladen. Brug enten en væskedispenseringsrobot (hvis du bruger en væskehåndterer, skal du sørge for at bruge tilknyttet udstyr, der er egnet til organiske opløsningsmidler) eller en manuel pipette.
  BEMÆRK: Se tabel 2 for mærkningsstrategien. Se tabel 3 for et eksempel på pladelayout.
4. Forsegl pladen, hvirvelen i 5 s, og drej ned i en bænkpladespinner ved RT.
5. Lad mærkningsreaktionen fortsætte ved RT i 1 time.
Slukning af TMT-mærkningsreaktion
1. Til hver brønd i 384-brøndspladen tilsættes 0,2 μL 0,5% hydroxylamin (fortyndet i HPLC-vand) ved hjælp af en væskehåndterer.
  BEMÆRK: Brug større volumener, hvis der anvendes manuel pipettering, og sørg for, at de endelige koncentrationer af reagenser stadig er de samme pr. Brønd.
2. Forsegl pladen, hvirvelen i 5 s, og drej ned i en bænkpladespinner ved RT.
3. Hold pladen ved RT i 30 min.
Forberedelse til LC-MS/MS-analyse: kombination af enkeltceller og kontrolbrønde med bærer/referencemateriale
1. Det kombinerede bærestof/referencemateriale fjernes fra fryseren -80 °C.
2. For hvert sæt pipetteres 1 μL bærer og referencemateriale i den første brønd, der vil være en del af et enkelt sæt. Pipetter det komplette volumen af den første brønd til den efterfølgende brønd. Fortsæt med at pipettere det komplette volumen fra en celle til den næste, indtil alle brønde, der skal inkluderes i et enkelt sæt, er blevet kombineret i den sidste brønd.
  BEMÆRK: Bærer- og referencematerialet skal være i en koncentration på henholdsvis 200- og 5-celleækvivalenter, men som tidligere diskuteret²¹ kan disse mængder variere. Hvert sæt, som beskrevet i mærkningsstrategien (se tabel 2), skal indeholde bærer, reference og op til 12 eller 14 enkeltcelle- eller kontrolprøver, når der anvendes henholdsvis TMTpro-16plex eller TMTpro-18plex (se trin 2.4.3).
3. For hvert sæt tilsættes 5 μL 50% acetonitril (fortyndet i HPLC-kvalitetsvand) til den første enkeltcellebrønd, der skal inkluderes i hvert sæt. Pipet det komplette volumen fra den første brønd til den efterfølgende brønd. Fortsæt med at pipettere det komplette volumen fra en celle til den næste, indtil alle brønde, der skal inkluderes i et enkelt sæt, er blevet kombineret i den sidste brønd.
  BEMÆRK: Dette vasketrin kan hjælpe med prøvegendannelse fra brøndene.
4. Overfør hvert sæt til deres individuelle autosamplerglasindsatser.
  BEMÆRK: Disse sæt kan også kombineres til enkeltbrønde på en 384-brøndplade og placeres direkte i autosampleren til injektion²⁸.
5. Når alle sæt er kombineret og anbragt i glasindsatser, tørres prøverne.
  PAUSEPUNKT: Tørrede sæt kan opbevares ved -80 °C i mindst 1 uge, før de kører på et massespektrometer.
6. Før LC-MS/MS-analyse tilsættes 1,2 μL 0,1% myresyre (fortyndet i HPLC-vand) til hvert sæt for at resuspendere de mærkede peptider.
  FORSIGTIG: Myresyre er en brandfarlig væske. Det kan forårsage alvorlig øjenskade eller hudforbrændinger. Sørg for at bære personlige værnemidler. Håndtag i et godt ventileret område.
7. Anbring autosamplerindsatserne i glas autosampler hætteglas og luk hver prøve med en hætte.
8. Hvirvel hvert hætteglas i 5 s for at sikre, at resuspension er komplet, og drej derefter ned i en hætteglasspinner ved RT.
9. Sørg for, at hvert eksempel er i bunden af indsatsen i stedet for at blive sprøjtet på siderne.
10. Anbring hætteglassene i autosamplerbakken.
11. For hvert sæt injiceres 1 μL til LC-MS/MS-analyse.

Etiket	126	127N	127C	128N	128C	129N	129C	130N	130C	....	135N
Prøvetype	Transportør	Henvisning	Tom	Tom	SC/Kontrol	SC/Kontrol	SC/Kontrol	SC/Kontrol	SC/Kontrol	....	SC/Kontrol

Tabel 2: Eksempel på SCoPE2 TMTpro-18plex mærkningsordning. Transportøren og referencen er normalt mærket i de to første TMT-etiketter. Derefter springes de næste to etiketter over på grund af potentiel isotopforurening, der ville gøre kvantificeringen mindre nøjagtig. De andre etiketter, der er tilbage, er til enkelte celler eller kontrolelementer.

128C

129N

129C

130N

130C

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

128C

129N

129C

130N

130C

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

Jeg

Tabel 3: Eksempel på pladelayout til mærkning ved hjælp af TMTpro-16plex. Ved hjælp af et 384-brønds pladeformat (eller ethvert andet pladeformat) er det vigtigt at randomisere de brønde, hvor celler er sorteret i. Et andet pladelayout vil blive brugt til TMTpro-18plex.

Representative Results

Positive resultater fra protokollen indebærer verifikation af, at en række kritiske trin i protokollen er blevet udført med succes; disse omfatter forberedelse af bæreren, enkeltcelleisolering, lysis, fordøjelse, stregkodemærkning og MS-parameteroptimering. DO-MS-plots gør det nemt at vurdere færdiggørelsen af hvert kritisk trin i protokollen. En vellykket forberedt bærer, som normalt svarer til 25 og 200 celler i mængde (pr. Sæt), er godt fordøjet og godt mærket. Afbildninger fra DO-MS gør det muligt at kvantificere prøvens intensitet (for at estimere mængden), fordøjelseseffektiviteten (ideelt <25% fejlklevages) og mærkningseffektiviteten (skal være >99%). Mest kritisk kan bærerprøver, der ikke er fuldstændigt mærket, tillade krydsreaktion med stregkoderne beregnet til enkeltceller og tilføje et falsk signal til kvantificeringen af enkeltcellepeptider.

Negative kontrolbrønde omfatter alle eksperimentelle reagenser, men mangler en celle. Dette gør det ikke kun muligt at vurdere baggrundsstøj, men også celleisoleringseffektiviteten ved at give et repræsentativt signal om en tom brønd. DO-MS-rapporten tilbyder plots til at vurdere det målte signal fra kontrolbrønden sammen med enkeltcellebrøndene for at bestemme succesen med celleisolering og baggrundsstøj. Derudover kan kvantitetskvaliteten vurderes ved hjælp af SCoPE2-rørledningen (tilgængelig på GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) eller SCP Bioconductor-pakken²⁹.

Fordøjelse og mærkningseffektivitet af de enkelte celler analyseres muligvis ikke direkte som med bæreren, men DO-MS giver igen plots, der tillader estimering af fordøjelsen og mærkningseffektiviteten. Ved at inkludere en kontrol af 100-200 celler sammen med forberedelsen af de enkelte celler (dvs. modtagelse af alle de samme reagenstilsætninger) kan fordøjelses- og mærkningseffektiviteten vurderes for denne kontrol og antages at blive delt af de enkelte celler, der er fremstillet sammen med. Dårlig fordøjelse vil blive indikeret ved et højt forhold mellem intensiteten af miscleavede peptider og deres fuldstændigt spaltede modstykker (figur 1).

En anden faktor, der skal overvejes i sættene, er brøkdelen af manglende data og medianreporterens ionintensitet i hver TMT-kanal (figur 2). Når enkeltceller er forberedt med succes, er mængden af manglende data pr. celle og positiv kontrol meget lavere end i negative kontrolprøver. Ligeledes er medianintensiteten af forstadier meget højere i enkeltceller og positive kontroller end for negative kontroller. Optimeringen af MS-parametre er blevet diskuteret udførligt andetsteds²¹, og optimale parametre kan bestemmes ved hjælp af værktøjer som DO-MS eller SCP Companion^25,27.

Figur 1: Kvalitetskontrol af bærerforberedelse. DO-MS-plots, der viser (A) mærkningseffektivitet af en vellykket forberedt bærer på steder med mærkning med TMT: den primære amin på sidekæden af lysin og peptidet N-terminalen og (B) fordøjelseseffektiviteten ved aminosyrerester af tryptisk spaltning. Forkortelse: TMT = tandem masse tag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Kvalitetskontrol af enkeltcellepræparat. DO-MS-plot, der viser (A) brøkdelen af manglende data i enkeltceller (C5-10), kontroller (C13,16), bærer (C1) og reference (C2) og (B) intensiteten af enkeltceller og kontroller. Tags 127C, 128N, 131C, 132N, 133N og 133C, som svarer til C3, C4, C11, C12 og C15, er ubrugte i dette særlige sæt. Den positive kontrol består af cellulært materiale behandlet til peptider i bulk og derefter fortyndet til et niveau på 2-5 celler / μL før mærkning. Den negative kontrol består af en brønd udsat for alle forberedende trin, der anvendes til enkeltceller, bare uden tilsætning af en enkelt celle. Forkortelse: TMT = tandem masse tag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

En af nøglerne til vellykket forberedelse og analyse af enkeltceller af SCoPE2 er forberedelsen af bærer- og referencekanalerne. Den foreslåede bærerstørrelse er 100 til 200 celler; Antallet af celler, der er nødvendige for et bestemt enkeltcelleeksperiment, kan dog bestemmes ud fra principper som diskuteret andetsteds²¹. For den foreslåede størrelse er der brug for mindst ~ 11.275 celler pr. 384-brøndplade, hvilket giver mulighed for en 200-cellebærer og 5-cellereference i hvert sæt. Det kan være en fordel at isolere flere celler, hvis de ønskede cellepopulationer ikke er en begrænsende faktor, for blot at have ekstra materiale i tilfælde af fejl (som det blev gjort i denne protokol, isolering af 22.000 celler i stedet for 11.275 celler). Den mængde bærer og reference, der er nødvendig for antallet af ønskede plader, skal fremstilles i en enkelt batch for at minimere enhver batch-til-batch-variation, der kan medføre, at peptididentifikation eller kvantificering afviger mellem batcher.

Før du isolerer enkeltceller i brønde af en 384-brøndplade, er det vigtigt at overveje designet af pladelayoutet. Inden for hver 384-brøndplade anbefales det at implementere både positive og negative kontroller. Negative kontroller er brønde, hvor der ikke tilsættes celler, men gennemgår de samme reagenstilsætninger og procedurer som enkeltcellebrøndene. Positive kontroller er brønde, hvor cellelysat fortyndet til 2-5 celler / μL tilsættes i stedet for enkeltceller. Dette er især vigtigt at implementere, når enkeltcelleisoleringsmetoder ikke er velvaliderede. Hver plade med 384 brønde skal ideelt set have en randomiseret fordeling af enkeltceller og kontroller (f.eks. ikke have negative eller positive kontroller i kun en række). Hver plade skal have en lige fordeling af alle cellepopulationer af interesse i stedet for at isolere en celletype i en plade og en anden celletype i en anden plade. Dette vil undgå at binde batcheffekter med celletyper af interesse. Derudover, hvis der er behov for mere end en 384-brøndplade til analyse, anbefales det at isolere celler i en enkelt session i stedet for at sprede isolationstrinnet over flere dage, hvis det er muligt.

Lysis af både enkeltceller og bærer/reference finder sted i vand gennem en fryse-varmecyklus²³. Det forventes, at de fleste proteaser er blevet denatureret i løbet af dette trin. Trypsin tilsættes derefter umiddelbart efter denatureringstrinnet i en høj koncentration, mange størrelsesordener større i koncentration end selv de mest rigelige cellulære proteaser. Ved massehandling vil de fleste produkter af proteaseaktivitet skyldes trypsin.

Reduktion / alkylering af cysteinrester udføres ikke i denne protokol før trypsinfordøjelsen. Cysteinholdige peptider repræsenterer ca. 10% af tryptiske peptider fra det humane proteom. Vi observerer færre cysteinholdige peptider ved hjælp af en tilgang uden reduktion / alkylering. Disse trin bruger reagenser, der er uforenelige med mærkning af TMT (NHS-ester kemi) umiddelbart efter fordøjelsen.

I denne TMT-mærkningsstrategi er bæreren og referencerne mærket med henholdsvis 126 og 127N, mens enkeltcelle- og kontrolbrønde er mærket med 128C til 135N. De to etiketter efter referencen, 127C og 128N, anvendes ikke på grund af isotopisk krydskontaminering som følge af bærer- og referencekanalerne, som klart er meget mere rigelige i peptidmateriale end de enkelte celler. I alt er der 12 TMT-kanaler pr. sæt, der kan bruges til mærkning af enkeltceller eller kontrolbrønde med TMTpro-16plex eller 14 TMT-kanaler pr. sæt med TMTpro-18plex.

De kritiske trin i protokollen til at udføre enkeltcelleproteomiske målinger ved hjælp af denne protokol inkluderer forberedelse af bæreren, enkeltcelleisolering, lysis, fordøjelse, stregkodemærkning og korrekte massespektrometriparametre. Disse trin er blevet skitseret i dette dokument og er blevet udførligt beskrevet andetsteds 17,21,25. Hvert trin har et tilsvarende plot eller sæt plots i DO-MS, der giver nem kvalitetskontrol. For eksempel, i tilfælde af vellykket oprettelse af transportøren, tillader plots, der viser antallet af identificerede peptider, mærkningseffektiviteten og procentdelen af miscleavagehastighed, verifikation af dens vellykkede forberedelse. Repræsentative DO-MS-rapporter er inkluderet i denne publikation og kan ses på http://scope2.slavovlab.net/ for de originale data¹⁶. Disse DO-MS-rapporter giver mulighed for at vurdere optimering af metoden i retninger, der endnu ikke er undersøgt af forfatterne, såsom længere LC-gradienter, forskellige fordøjelsesenzymer eller alternative kemiske stregkoder.

I øjeblikket begrænser den serielle analyse af peptider ved dataafhængige erhvervelsesalgoritmer antallet af peptider, der kan analyseres i en LC-kørsel af en rimelig længde. Dette skyldes til dels de længere påfyldningstider, der kræves for en vellykket erhvervelse af nok ioner til pålidelig enkeltcellekvantificering²¹. En iboende begrænsning for at bruge bæreren er manglen på direkte vurdering af fordøjelsen og mærkningseffektiviteten af de enkelte celler. I øjeblikket er en løsning på denne begrænsning at udføre kvalitetskontrol på en større prøve, der behandles sammen med de enkelte celler.

Vi foreslog en række muligheder for at forbedre enkeltcelleproteomik, såsom opbygning af massespektrometre med flere analysatorer. Den nuværende metode gør det muligt at kvantificere tusindvis af proteiner fra enkelte pattedyrceller med en hastighed på ca. 100 celler om dagen med kommercielt tilgængelige reagenser og udstyr. SCoPE2, anden generation af SCoPE-MS-tilgangen, forbedrede sin forgænger betydeligt med hensyn til antallet af celler, der kan analyseres pr. tidsenhed, antallet af proteiner, der kan analyseres pr. tidsenhed, den tid, der er nødvendig til prøveforberedelse, tilgængeligheden af reagenser og udstyr og de samlede omkostninger ved forberedelse og analyse pr. enkelt celle. Membranbundne proteiner er tilgængelige ved hjælp af frysevarmelysis og proteasefordøjelse, som vist i sammenligning med urinstoflyse²³. Metoden identificerer mange proteiner fra den øverste tredjedel af proteomet med hensyn til overflod¹⁶. Hvis den modificerede proteoform er i den øverste tredjedel af proteomet, og det modificerede peptid er egnet til massespektrometrianalyse (ioniserer godt, har en masseforskel fra umodificeret peptid), vil det mere sandsynligt være modtageligt for denne protokol. Denne metode kan anvendes frugtbart i biologiske systemer, hvor der er meningsfuld heterogenitet blandt celler, såsom i differentiering, ældning eller immunologiske reaktioner (dvs. fagocytose).

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende efteråret 2021 NSF I-Corps Program (Northeastern University site) -prisen, der har finansieret denne publikation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plate, standard PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB1384	Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	A955-1	This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%	Sigma Aldrich	271004-100ML	This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils	Thermo Fisher Scientific	AB0626
Autosampler vial screw thread caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)	MTC Bio	C2595	This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease	Sigma Aldrich	E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade	Thermo Fisher Scientific	85178	Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol	Sigma Aldrich	467804-50ML	Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips	Formulatrix	MCLVPR2	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips	Formulatrix	MCLVS12	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler	Formulatrix		Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling	Formulatrix	232400
MassPREP peptide mixture	Waters	186002337	Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)	USA Scientific	2621-0016	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips	USA Scientific	1402-3900	If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)	Benchmark Scientific	Model C2000	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)	Biorad	1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg	Thermo Fisher Scientific	A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5	Sigma Aldrich	T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade	Promega	V5280	This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)	VWR	Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)	VWR	97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	W6-1	All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .