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Biology

फ्रीज-हीट लाइसिस और एक आइसोबेरिक वाहक का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए एकल-सेल प्रोटिओमिक्स तैयारी

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802
Automatic Translation
*1, 1,2,3, *1
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन करते हैं कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से एकल-सेल प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए स्तनधारी कोशिकाओं को कैसे तैयार किया जाए, जिसमें मैनुअल और स्वचालित दोनों पाइपिंग के विकल्प हैं।

Abstract

एकल-कोशिका प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए संवेदनशील, मात्रात्मक रूप से सटीक, व्यापक रूप से सुलभ और मजबूत तरीकों की आवश्यकता होती है। इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, सिंगल-सेल प्रोटिओमिक्स (एससीओपीई 2) प्रोटोकॉल को एक एकल कोशिका के स्तर तक सीमित नमूनों से सैकड़ों से हजारों प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए दूसरी पीढ़ी की विधि के रूप में विकसित किया गया था। इस विधि का उपयोग करने वाले प्रयोगों ने 10 दिनों के मास स्पेक्ट्रोमीटर उपकरण समय में 1,500 एकल स्तनधारी कोशिकाओं (500-1,000 प्रोटीन प्रति सेल) में 3,000 से अधिक प्रोटीन की मात्रा प्राप्त की है। एससीओपीई 2 सेल लाइसिस के लिए एक फ्रीज-हीट चक्र का लाभ उठाता है, एकल कोशिकाओं की सफाई की आवश्यकता को कम करता है और परिणामस्वरूप नमूना नुकसान को कम करता है, जबकि नमूना तैयार करने और इसके स्वचालन को सरल बनाता है। इसके अतिरिक्त, विधि एक आइसोबेरिक वाहक का उपयोग करती है, जो प्रोटीन की पहचान में सहायता करती है और नमूना हानि को कम करती है।

यह वीडियो प्रोटोकॉल केवल उपकरण और अभिकर्मकों का उपयोग करके स्वचालित एकल-सेल प्रोटीन विश्लेषण को अपनाने में सक्षम करने के लिए विस्तृत मार्गदर्शन प्रदान करता है जो व्यापक रूप से सुलभ हैं। हम प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एकल कोशिकाओं को तैयार करने की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों का प्रदर्शन करते हैं, कटाई से इंजेक्शन तक तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) विश्लेषण तक। इसके अतिरिक्त, दर्शकों को आइसोबेरिक वाहक के साथ प्रयोगात्मक डिजाइन के सिद्धांतों के माध्यम से निर्देशित किया जाता है, आइसोबेरिक वाहक और एकल-सेल तैयारी दोनों के लिए गुणवत्ता नियंत्रण, और दृष्टिकोण की सीमाओं की चर्चा के साथ प्रतिनिधि परिणाम।

Introduction

एकल-कोशिका विश्लेषण का व्यापक रूप से जैविक प्रणालियों के भीतर विषमता के स्तर का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है जो अन्यथा थोक माप 1,2,3 द्वारा अस्पष्ट होगा। इस तरह की सेलुलर विविधता के कार्यात्मक परिणाम हो सकते हैं जो कैंसर सेल चिकित्सीय प्रतिरोध 4,5,6 से लेकर मधुमेह 7,8,9,10 में सेल-टू-सेल विषमता तक अभिन्न जैविक प्रक्रियाओं की समझ को आगे बढ़ा सकते हैं। कई जांचों ने आनुवंशिक या ट्रांसक्रिप्टोमिक स्तरों को मापकर एकल कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड को मापने पर ध्यान केंद्रित किया है और सेल प्रकारों और राज्यों के वर्गीकरण को सक्षम किया है। हालांकि, न्यूक्लिक एसिड स्पेस में इस तरह की प्रगति पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन 11 के ज्ञान अंतर को नहीं भर सकती है, जिससे एकल कोशिकाओं 12,13,14,15 में समान उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन माप की आवश्यकता होती है।

हमने स्तनधारी प्रणालियों के कठोर और मजबूत एकल-कोशिका प्रोटिओमिक्स की मांग को पूरा करने के लिए एससीओपीई 2 16,17 विकसित किया है। यह एक मल्टीप्लेक्स विधि है, जो समानांतर18 में कई कोशिकाओं को लेबल और विश्लेषण करके थ्रूपुट में वृद्धि की अनुमति देती है, लेबल-मुक्त एमथोड्स के विपरीत जो19,20 समय में एक सेल का विश्लेषण करते हैं। नमूना तैयार करने की पद्धति, मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण, और बाद में डेटा विश्लेषण चरण प्रति एकल सेल सैकड़ों से हजारों प्रोटीनों की सटीक मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देते हैं। यह विधि आइसोबेरिक वाहक21 के माध्यम से एकल कोशिकाओं के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण को संभव बनाती है, कोशिकाओं का एक छोटा थोक नमूना (आमतौर पर 25-200) जो जैविक रूप से एकल-कोशिका आबादी के समान है। इस वाहक सामग्री को टेंडम मास टैग (टीएमटी लेबल) के उपयोग के माध्यम से एक ही सामग्री और एकल कोशिकाओं के संदर्भ चैनल के साथ एक सेट में मल्टीप्लेक्स किया जाता है। वाहक चैनल सतह क्षेत्रों में नमूना हानि को कम करता है और सफल पेप्टाइड पहचान के लिए आयन रीढ़ के टुकड़े प्रदान करता है। संदर्भ चैनल, जो थोक में तैयार किया जाता है और बाद में प्रत्येक एकल-सेल सेट के लिए 5-10 सेल समकक्षों तक पतला हो जाता है, विश्लेषण में तकनीकी परिवर्तनशीलता को नियंत्रित करने में मदद करता है। विशेष रूप से, संदर्भ एलसी-एमएस / एमएस से संबंधित प्रभावों के कारण परिवर्तनशीलता के सामान्यीकरण की अनुमति देता है, जैसे आयन नमूनाकरण और आयनीकरण क्षमता। आमतौर पर, संदर्भ और वाहक चैनल एक ही सेल आबादी से बने होते हैं।

यह नमूना तैयारी प्रोटोकॉल कई सहक्रियात्मक सुधारों द्वारा एससीओपीई-एमएस22 पर निर्माण करने वाली दूसरी पीढ़ी की विधि है। सुधारों में एक सेल लाइसिस विधि शामिल है जो नमूना सफाई से बचती है, जो एमएस प्रोटिओमिक्स तैयारी का एक सामान्य कदम है। यह एमपीओपी (न्यूनतम प्रोटिओमिक नमूना तैयारी) 23 का उपयोग करता है, जो एक फ्रीज-हीट लाइसिस विधि है। इस विधि ने शीशियों के बजाय छोटी मात्रा में और मल्टीवेल प्लेटों में एकल कोशिकाओं के लाइसिस को सक्षम किया, जिससे थर्मल साइकिलर्स द्वारा उच्च थ्रूपुट दर और स्वचालन की सुविधा मिली। कुल मिलाकर, इस विधि ने एससीओपीई-एमएस16,24 की तुलना में प्रति एकल सेल लागत को कम किया है और मात्रात्मक सटीकता में वृद्धि की है।

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एकल कोशिकाओं को कैसे तैयार किया जाए, जिसमें टीएमटीप्रो 18-प्लेक्स आइसोबेरिक लेबल का उपयोग करके वाहक और संदर्भ चैनल कैसे तैयार किए जाएं। स्तनधारी कोशिकाएं जो एकल-कोशिका निलंबन में हैं और जिन्हें 384-वेल प्लेटों में अलग किया जा सकता है, संभवतः इस प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी हैं। इसके अलावा सफल एकल-सेल सेट के प्रतिनिधि परिणाम भी शामिल हैं, जो आर शाइनी ऐप, डीओ-एमएस25 द्वारा उत्पन्न कई गुणवत्ता नियंत्रण भूखंडों को प्रदर्शित करते हैं। अन्य प्रकाशित सॉफ्टवेयर उपकरण26,27 और प्रयोगात्मक दिशानिर्देश17,21 ने इस प्रोटोकॉल को अपनाने में सुधार किया है। हमें उम्मीद है कि यह दृश्य मार्गदर्शिका शोधकर्ताओं को एकल-सेल प्रोटिओमिक्स प्रयोगों को करने में मदद करेगी।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में, कमरे का तापमान (आरटी) 18-22 डिग्री सेल्सियस है।

1. वाहक और संदर्भ सामग्री उत्पादन

  1. सेल अलगाव
    1. बर्फ-ठंडा 1x PBS में सेल निलंबन में रुचि की कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
      नोट: यदि संभव हो, तो वाहक और संदर्भ सामग्री को एकल-कोशिका स्तर पर अध्ययन करने के लिए चुनी गई सेल आबादी (ओं) से तैयार किया जाना चाहिए। विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों (जैसे उत्तेजित और उत्तेजित प्रतिरक्षा कोशिकाओं) से कोशिकाओं की समान संख्या को वाहक और संदर्भ का गठन करना चाहिए। उन स्थितियों में जहां इन कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या को काटा नहीं जा सकता है, जैविक समानता के आधार पर एक उपयुक्त सेल आबादी का चयन किया जाना चाहिए।
    2. हेमोसाइटोमीटर या सेल गिनती के अन्य साधनों (जैसे एफएसीएस) का उपयोग करके, निलंबन में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    3. प्रत्येक सेल प्रकार की 22,000 कोशिकाओं को 11 μL HPLC-ग्रेड पानी में अलग-अलग पीसीआर ट्यूबों (मानक 250 μL पीसीआर ट्यूब) में स्पिन करें और पुन: निलंबित करें।
      नोट: यहां दी गई कोशिकाओं की संख्या वाहक और उन सेटों की संख्या के लिए पर्याप्त है जिन्हें एकल कोशिकाओं से भरे 384-वेल प्लेट से तैयार किया जा सकता है। इस चरण में सेल इनपुट और बाद के चरणों में अभिकर्मक मात्रा को अधिक संख्या में सेटों के लिए आनुपातिक रूप से बढ़ाया जा सकता है। घूमने की गति प्रयोगशाला की सेल संस्कृति प्रथाओं पर निर्भर है। एक विशिष्ट स्पिन डाउन: 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम ।
    4. नमूने को कम से कम 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।
      पॉज पॉइंट: नमूने कई महीनों तक जमे हुए रह सकते हैं, जिसमें एकल-सेल डेटा के लिए कोई परिणाम नहीं हो सकता है।
  2. सेल लाइसिस
    1. कोशिकाओं के साथ पीसीआर ट्यूब को 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें (थर्मल साइकिलर ढक्कन 105 डिग्री सेल्सियस पर सेट के साथ), और फिर हीटिंग चक्र के ठीक बाद ट्यूबों को 12 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    2. ट्यूब को थोड़ी देर के लिए वोर्टेक्स करें, और फिर ट्यूब के तल पर सभी तरल एकत्र करने के लिए आरटी में एक बेंच-टॉप पीसीआर ट्यूब स्पिनर में घूमते हैं।
    3. एक पानी स्नान सोनिकेटर में, ट्यूबों को 5 मिनट के लिए सोनिकेट करें, फिर उन्हें आरटी पर बर्फ पर रखें।
  3. ट्रिप्सिन पाचन
    1. बर्फ पर रहते हुए प्रत्येक नमूना ट्यूब में मास्टर मिश्रण का 2.2 μL जोड़ें (घटकों के लिए तालिका 1 देखें)।
      सावधानी: ट्रिप्सिन त्वचा, श्वसन और आंखों में जलन पैदा कर सकता है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना सुनिश्चित करें। एक रासायनिक फ्यूम हुड के नीचे संभालें।
    2. प्रत्येक ट्यूब के तल पर सभी तरल एकत्र करने के लिए आरटी में बेंच-टॉप पीसीआर ट्यूब स्पिनर में ट्यूबों को संक्षेप में मिलाने और स्पिन करने के लिए कॉर्टेक्स।
    3. नमूने को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें (थर्मल साइक्लर ढक्कन को 52 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया है)।
  4. टीएमटी लेबलिंग प्रतिक्रिया
    1. आरटी में बेंच-टॉप पीसीआर ट्यूब स्पिनर में पाचन के बाद नमूनों को स्पिन करें।
    2. प्रत्येक नमूने को 6.6 μL के दो समान संस्करणों में विभाजित करें, ताकि प्रत्येक ट्यूब में 11,000 कोशिकाएं हों।
    3. वाहक के लिए बनी ट्यूबों में, टीएमटी लेबल 126 के 3.3 μL जोड़ें जिसे 85 mM की एकाग्रता पर फिर से निलंबित किया गया है।
    4. संदर्भ के लिए ट्यूबों में, टीएमटी लेबल 127 एन के 3.3 μL जोड़ें जिसे 85 mM की एकाग्रता पर फिर से निलंबित किया गया है।
    5. ट्यूबों को थोड़ी देर के लिए घुमाएं और नीचे तरल एकत्र करने के लिए आरटी में बेंच-टॉप पीसीआर ट्यूब स्पिनर में घूमते हैं।
    6. ट्यूबों को 1 घंटे के लिए आरटी पर छोड़ दें।
  5. टीएमटी लेबलिंग प्रतिक्रिया का शमन
    1. प्रत्येक ट्यूब में 0.5% हाइड्रॉक्सिलमाइन का 1.65 μL जोड़ें।
      सावधानी: हाइड्रॉक्सिलमाइन त्वचा में जलन पैदा कर सकता है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना सुनिश्चित करें।
    2. ट्यूबों को थोड़ी देर के लिए घुमाएं और नीचे तरल एकत्र करने के लिए आरटी में बेंच-टॉप पीसीआर ट्यूब स्पिनर में घूमते हैं।
    3. ट्यूबों को 30 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें।
  6. वाहक और संदर्भ का संयोजन
    1. यदि वाहक का गठन करने वाले नमूने अलग से लेबल किए गए हैं, तो उन्हें समान अनुपात में मिलाएं।
    2. यदि संदर्भ का गठन करने वाले नमूने अलग से लेबल किए गए हैं, तो उन्हें समान अनुपात में मिलाएं।
    3. वाहक और संदर्भ को मिलाएं ताकि वाहक की अंतिम एकाग्रता 100-200 कोशिकाओं / μL हो, और संदर्भ एकाग्रता 5-10 कोशिकाएं /
    4. एकल-सेल सेट के साथ संयोजन करने से पहले वाहक और संदर्भ सामग्री की गुणवत्ता का आकलन करें।
      नोट: वाहक और संदर्भ सामग्री का गुणवत्ता नियंत्रण विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है, लेकिन do-ms.slavovlab.net17 पर उपलब्ध डीओ-एमएस सॉफ्टवेयर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। गुणवत्ता के महत्वपूर्ण मापों में मिसलीवेज दर (<25%), एक मीट्रिक जो आत्मविश्वास से पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या के साथ आत्मविश्वास से पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या के रूप में गणना की जाती है, जो कुल मिलाकर आत्मविश्वास से पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या से विभाजित होती है) और लेबलिंग दक्षता (>99%), लेबलिंग साइटों की संख्या के रूप में गणना की जाने वाली मीट्रिक, अर्थात् पेप्टाइड एन-टर्मिनस और लाइसिन, लेबलिंग साइटों की कुल संख्या से विभाजित लेबल के साथ)।
      ठहराव बिंदु: वाहक और संदर्भ सामग्री को आवश्यकतानुसार -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
घटक मिश्रण एकाग्रता प्रति ट्यूब अंतिम सांद्रता
ट्रिप्सिन गोल्ड 50 ng/μL 8.33 ng/μL
टीईएबी, पीएच = 8.5 500 mM 83.33 mM
बेंजोनेस न्यूक्लियस 1.2 इकाइयाँ 0.2 इकाइयाँ

तालिका 1: मास्टर मिश्रण की अभिकर्मक मात्रा। ट्रिप्सिन पाचन के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की अंतिम सांद्रता सूचीबद्ध हैं।

2. SCoPE2 नमूना तैयारी

  1. सेल अलगाव
    1. सिंथेटिक पेप्टाइड समाधान के प्रति μL 25 fmol प्रति पेप्टाइड के साथ HPLC-ग्रेड पानी को पूरक करें।
      नोट: वाटर्स मासप्रेप पेप्टाइड समाधान एक उदाहरण है जिसका उपयोग किया जा सकता है। यह सात पेप्टाइड्स से बना है जो बहुत अच्छी तरह से आयनित नहीं होते हैं। यह इस समाधान का एक महत्वपूर्ण पहलू है: ये पेप्टाइड्स एकल कोशिकाओं के सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मात्रा में हस्तक्षेप नहीं करते हैं। रुचि के नमूनों में होने की संभावना नहीं है, कुछ पेप्टाइड्स का कोई भी अत्यधिक शुद्ध मिश्रण उपयुक्त होगा।
    2. तरल-वितरण रोबोट या मैनुअल पिपेट का उपयोग करके 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण का 1 μL जोड़ें।
    3. प्लेट को सील करें और इसे आरटी में बेंच-टॉप प्लेट स्पिनर में नीचे घुमाएं ताकि नीचे तरल एकत्र किया जा सके।
      पॉज पॉइंट: इस समाधान के साथ प्लेटों को आवश्यकता होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. अलग-अलग अनिर्धारित कोशिकाओं का निलंबन प्राप्त करें.
      नोट: सेल निलंबन वास्तव में कैसे प्राप्त किया जाता है यह सेल प्रकार की रुचि पर आधारित है। यहाँ व्यापक उदाहरण हैं:
      1. निलंबन कोशिकाएं: कोशिकाओं को एक गोली में घुमाएं, और सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें।
      2. अनुयायी कोशिकाएं: ट्रिप्सिनाइजेशन या स्क्रैपिंग के माध्यम से डिश या फ्लास्क से कोशिकाओं को हटा दें। फिर, सेल संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए उन्हें नीचे घुमाएं।
    5. सेल निलंबन को 1x बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोएं। दूसरे धोने के बाद कोशिकाओं को 1x PBS में निलंबित छोड़ दें।
    6. यदि 384-वेल प्लेट जमी हुई थी, तो इसे आरटी पर पिघलाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए इसे नीचे घुमाएं कि सभी तरल कुओं के तल पर हैं।
    7. संबंधित कुओं में एकल कोशिकाओं को वितरित करने के लिए सेल सॉर्टर या अन्य उपलब्ध साधनों, जैसे कि मैनुअल हैंडपिकिंग का उपयोग करें।
      नोट: नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के लिए कुछ कुओं को खाली छोड़ते हुए कुओं में एकल कोशिकाओं को जोड़ें (चर्चा देखें)। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करते समय, प्रवाह साइटोमीटर के लिए सबसे कम संभव प्रवाह दर का उपयोग करें। सेल हैंडलिंग के लिए कम प्रवाह दर को सौम्य माना जाता है। इसके अतिरिक्त, नोजल आकार रुचि की कोशिकाओं के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त होना चाहिए। फ्लो साइटोमेट्री सुविधा के साथ सहयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    8. मैन्युअल रूप से या तरल हैंडलिंग रोबोट के साथ चयनित कुओं में 2-5 सेल समकक्ष लाइसेट के सकारात्मक नियंत्रण जोड़ें।
    9. नीचे तरल एकत्र करने के लिए आरटी में बेंच-टॉप प्लेट स्पिनर में क्रमबद्ध कोशिकाओं के साथ प्लेट को सील और स्पिन करें। प्लेट को जल्द से जल्द -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
      पॉज पॉइंट: क्रमबद्ध एकल कोशिकाओं वाली प्लेटों को आवश्यकतानुसार -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. सेल लाइसिस
    1. क्रमबद्ध एकल कोशिकाओं के साथ 384-वेल प्लेट लें और इसे जितनी जल्दी हो सके थर्मल साइक्लर में डालें।
    2. प्लेट को 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें (ढक्कन तापमान 105 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें), और फिर प्लेट को 12 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    3. आरटी में बेंच-टॉप प्लेट स्पिनर में प्लेट को थोड़ी देर के लिए स्पिन करें।
    4. एक पानी स्नान सोनिकेटर में, आरटी पर 5 मिनट के लिए प्लेट को सोनिकेट करें, फिर इसे बर्फ पर रखें।
  3. ट्रिप्सिन पाचन
    1. प्रति 384-वेल प्लेट में मास्टर मिक्स का 100 μL (घटकों के लिए तालिका 1 देखें) तैयार करें।
    2. 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में, तरल हैंडलर का उपयोग करके चरण 2.3.1 में तैयार मास्टर मिश्रण का 0.2 μL जोड़ें।
      नोट: यदि मैन्युअल पिपेटिंग का उपयोग किया जाता है, तो बड़ी मात्रा का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि अभिकर्मकों की अंतिम सांद्रता अभी भी समान है।
    3. प्लेट को सील करें, 5 सेकंड के लिए भंवर, और आरटी में बेंच-टॉप प्लेट स्पिनर में स्पिन करें।
    4. 3 घंटे के लिए 384-वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस (ढक्कन तापमान 52 डिग्री सेल्सियस पर सेट) पर गर्म करें।
  4. टीएमटी लेबलिंग प्रतिक्रिया
    1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से टीएमटी लेबल (128 एन से 135 एन) के 85 एमएम स्टॉक लें। ट्यूबों को खोलने से पहले कमरे के तापमान पर गर्म करें।
    2. निर्जल एसिटोनिट्राइल में लेबल को 22 एमएम तक पतला करें।
      चेतावनी: एसिटोनिट्राइल एक ज्वलनशील तरल है। यह त्वचा, आंखों, श्वसन पथ और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को परेशान कर सकता है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना सुनिश्चित करें। एक रासायनिक फ्यूम हुड के नीचे संभालें।
    3. इस लेबलिंग रणनीति का उपयोग करके, 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला टीएमटी लेबल के 0.5 μL जोड़ें। या तो एक तरल-वितरण रोबोट का उपयोग करें (यदि तरल हैंडलर का उपयोग कर रहे हैं, तो संबंधित उपकरणों का उपयोग करना सुनिश्चित करें जो कार्बनिक सॉल्वैंट्स के लिए उपयुक्त हैं) या एक मैनुअल पिपेट।
      नोट: लेबलिंग रणनीति के लिए तालिका 2 देखें। उदाहरण प्लेट लेआउट के लिए तालिका 3 देखें.
    4. प्लेट को सील करें, 5 सेकंड के लिए भंवर, और आरटी में बेंच-टॉप प्लेट स्पिनर में स्पिन करें।
    5. लेबलिंग प्रतिक्रिया को 1 घंटे के लिए आरटी पर आगे बढ़ने दें।
  5. टीएमटी लेबलिंग प्रतिक्रिया का शमन
    1. 384-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में, तरल हैंडलर का उपयोग करके 0.5% हाइड्रॉक्सिलमाइन (एचपीएलसी-ग्रेड पानी में पतला) का 0.2 μL जोड़ें।
      नोट: यदि मैन्युअल पिपेटिंग का उपयोग किया जाता है, तो बड़ी मात्रा का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि अभिकर्मकों की अंतिम सांद्रता अभी भी समान है।
    2. प्लेट को सील करें, 5 सेकंड के लिए भंवर, और आरटी में बेंच-टॉप प्लेट स्पिनर में स्पिन करें।
    3. प्लेट को 30 मिनट के लिए आरटी पर रखें।
  6. एमएस विश्लेषण के लिए तैयारी: वाहक / संदर्भ सामग्री के साथ एकल कोशिकाओं और नियंत्रण कुओं का संयोजन
    1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से संयुक्त वाहक / संदर्भ सामग्री को हटा दें।
    2. प्रत्येक सेट के लिए, पहले कुएं में वाहक और संदर्भ सामग्री का 1 μL पिपेट जो एक एकल सेट का हिस्सा होगा। पिपेट पहले कुएं से बाद के कुएं की पूरी मात्रा को मापें। एक सेल से दूसरे सेल में पूरी मात्रा को पाइप करना जारी रखें जब तक कि एक ही सेट में शामिल किए जाने वाले सभी कुओं को अंतिम कुएं में जोड़ नहीं दिया जाता है।
      नोट: वाहक और संदर्भ सामग्री क्रमशः 200- और 5-सेल समकक्षों की एकाग्रता पर होनी चाहिए, लेकिन जैसा कि पहले चर्चा की गईहै 21, ये मात्राएं भिन्न हो सकती हैं। प्रत्येक सेट, जैसा कि लेबलिंग रणनीति में उल्लिखित है ( तालिका 2 देखें), क्रमशः टीएमटीप्रो -16प्लेक्स या टीएमटीप्रो -18प्लेक्स का उपयोग करते समय वाहक, संदर्भ और 12 या 14 एकल-सेल या नियंत्रण नमूने शामिल होने चाहिए (चरण 2.4.3 देखें)।
    3. प्रत्येक सेट के लिए, प्रत्येक सेट में शामिल होने वाले पहले एकल-सेल कुएं में 50% एसिटोनिट्राइल (एचपीएलसी-ग्रेड पानी में पतला) के 5 μL जोड़ें। पहले कुएं से बाद के कुएं तक की पूरी मात्रा का पता लगाएं। एक सेल से दूसरे सेल में पूरी मात्रा को पाइप करना जारी रखें जब तक कि एक ही सेट में शामिल किए जाने वाले सभी कुओं को अंतिम कुएं में जोड़ नहीं दिया जाता है।
      नोट: यह धोने का कदम कुओं से नमूना वसूली में मदद कर सकता है।
    4. प्रत्येक सेट को उनके व्यक्तिगत ऑटोसैंपलर ग्लास इंसर्ट में स्थानांतरित करें।
      नोट: इन सेटों को 384-वेल प्लेट के एकल कुओं में भी जोड़ा जा सकता है और इंजेक्शन28 के लिए सीधे ऑटोसैंपलर में रखा जा सकता है।
    5. एक बार जब सभी सेट संयुक्त हो जाते हैं और ग्लास इंसर्ट में रखे जाते हैं, तो नमूने को सुखाएं।
      पॉज़ पॉइंट: सूखे सेट को मास स्पेक्ट्रोमीटर पर चलने से पहले कम से कम 1 सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    6. एमएस विश्लेषण से पहले, लेबल पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करने के लिए प्रत्येक सेट में 0.1% फॉर्मिक एसिड (एचपीएलसी-ग्रेड पानी में पतला) का 1.2 μL जोड़ें।
      चेतावनी: फॉर्मिक एसिड एक ज्वलनशील तरल है। यह गंभीर आंखों की क्षति या त्वचा के जलने का कारण बन सकता है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना सुनिश्चित करें। एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में संभालें।
    7. ऑटोसैंपलर को ग्लास ऑटोसैंपलर शीशियों में डालें और प्रत्येक नमूने को एक टोपी के साथ बंद करें।
    8. प्रत्येक शीशी को 5 सेकंड के लिए वोर्टेक्स यह सुनिश्चित करने के लिए कि रिस्पेंशन पूरा हो गया है, और फिर आरटी में एक शीशी स्पिनर में स्पिन करें।
    9. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना साइड पर छिड़कने के बजाय इंसर्ट के निचले भाग में है।
    10. ऑटोसैंपलर ट्रे में शीशियों को रखें।
    11. प्रत्येक सेट के लिए, एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए 1 μL इंजेक्ट करें।
लेबल 126 127N 127C 128N 128C 129N 129C 130N 130C .... 135N
नमूना प्रकार वाहक संदर्भ खाली खाली SC/नियंत्रण SC/नियंत्रण SC/नियंत्रण SC/नियंत्रण SC/नियंत्रण .... SC/नियंत्रण

तालिका 2: उदाहरण SCoPE2 TMTpro-18plex लेबलिंग योजना। वाहक और संदर्भ आमतौर पर पहले दो टीएमटी लेबल में लेबल किए जाते हैं। फिर, अगले दो लेबल संभावित आइसोटोपिक संदूषण के कारण छोड़ दिए जाते हैं जो मात्रा को कम सटीक बना देगा। शेष अन्य लेबल एकल कोशिकाओं या नियंत्रणों के लिए हैं।

128C 129N 129C 130N 130C 131N 131C 132N 132C 133N 133C 134N 128C 129N 129C 130N 130C 131N 131C 132N 132C 133N 133C 134N
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
एक अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
B अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति +
C अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति -
D अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
E अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
F अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
G अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
H अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
मैं अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
J - अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
K अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति - - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
L अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति
M अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
N + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
O अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति
P अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति + अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति - अनुसूचित जाति

तालिका 3: टीएमटीप्रो -16प्लेक्स का उपयोग करके लेबलिंग के लिए उदाहरण प्लेट लेआउट। 384-वेल प्लेट प्रारूप (या किसी अन्य प्लेट प्रारूप) का उपयोग करके, उन कुओं को यादृच्छिक बनाना महत्वपूर्ण है जिनमें कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया जाता है। टीएमटीप्रो -18प्लेक्स के लिए एक अलग प्लेट लेआउट का उपयोग किया जाएगा।

Representative Results

प्रोटोकॉल के सकारात्मक परिणाम यह सत्यापित करते हैं कि प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम सफलतापूर्वक किए गए हैं; इनमें वाहक की तैयारी, एकल-कोशिका अलगाव, लाइसिस, पाचन, बारकोड लेबलिंग और एमएस पैरामीटर अनुकूलन शामिल हैं। डीओ-एमएस प्लॉट प्रोटोकॉल में प्रत्येक महत्वपूर्ण चरण के पूरा होने के आसान मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। एक सफलतापूर्वक तैयार वाहक, जो आमतौर पर मात्रा (प्रति सेट) में 25 और 200 कोशिकाओं से मेल खाता है, अच्छी तरह से पचा हुआ और अच्छी तरह से लेबल किया जाता है। डीओ-एमएस के प्लॉट नमूने की तीव्रता (मात्रा का अनुमान लगाने के लिए), पाचन दक्षता (आदर्श रूप से <25% गलत छोड़ने), और लेबलिंग दक्षता (>99%) को निर्धारित करने की अनुमति देते हैं। सबसे गंभीर रूप से, वाहक नमूने जो पूरी तरह से लेबल नहीं किए गए हैं, वे एकल कोशिकाओं के लिए बारकोड के साथ क्रॉस प्रतिक्रिया की अनुमति दे सकते हैं और एकल-सेल पेप्टाइड्स की मात्रा के लिए एक नकली संकेत जोड़ सकते हैं।

नकारात्मक नियंत्रण कुओं में सभी प्रयोगात्मक अभिकर्मक शामिल हैं लेकिन एक सेल की कमी है। यह न केवल पृष्ठभूमि शोर का आकलन करने की अनुमति देता है, बल्कि एक खाली कुएं का प्रतिनिधि संकेत प्रदान करके सेल अलगाव दक्षता भी निर्धारित की जा सकती है। डीओ-एमएस रिपोर्ट सेल अलगाव और पृष्ठभूमि शोर की सफलता निर्धारित करने के लिए एकल-सेल कुओं के साथ-साथ नियंत्रण के मापा संकेत का आकलन करने के लिए भूखंड प्रदान करती है। इसके अतिरिक्त, मात्रा की गुणवत्ता का आकलन एससीओपीई 2 पाइपलाइन (गिटहब पर उपलब्ध: github.com/SlavovLab/SCoPE2) या एससीपी बायोकंडक्टर पैकेज29 का उपयोग करके किया जा सकता है।

एकल कोशिकाओं की पाचन और लेबलिंग दक्षता को वाहक के साथ सीधे परख नहीं किया जा सकता है, लेकिन डीओ-एमएस फिर से भूखंड प्रदान करता है जो पाचन और लेबलिंग दक्षता के अनुमान की अनुमति देता है। एकल कोशिकाओं की तैयारी के साथ-साथ 100-200 कोशिकाओं के नियंत्रण को शामिल करके (यानी, सभी समान अभिकर्मक परिवर्धन प्राप्त करना), पाचन और लेबलिंग क्षमता का मूल्यांकन उस नियंत्रण के लिए किया जा सकता है, और साथ में तैयार एकल कोशिकाओं द्वारा साझा किया जा सकता है। खराब पाचन को उनके पूरी तरह से क्लीवर समकक्षों (चित्रा 1) के लिए गलत पेप्टाइड्स की तीव्रता के उच्च अनुपात से इंगित किया जाएगा।

सेट में विचार करने के लिए एक और कारक लापता डेटा का अंश और प्रत्येक टीएमटी चैनल में औसत रिपोर्टर आयन तीव्रता है (चित्रा 2)। जब एकल कोशिकाओं को सफलतापूर्वक तैयार किया जाता है, तो प्रति सेल और सकारात्मक नियंत्रण लापता डेटा की मात्रा नकारात्मक नियंत्रण नमूनों की तुलना में बहुत कम होती है। इसी तरह, अग्रदूतों की औसत तीव्रता नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना में एकल कोशिकाओं और सकारात्मक नियंत्रणों में बहुत अधिक है। एमएस मापदंडों के अनुकूलन परकहीं और बड़े पैमाने पर चर्चा की गई है, और डीओ-एमएस या एससीपी कंपैनियन25,27 जैसे उपकरणों का उपयोग करके इष्टतम पैरामीटर निर्धारित किए जा सकते हैं।

Figure 1
चित्र 1: वाहक तैयारी गुणवत्ता नियंत्रण। टीएमटी के साथ लेबलिंग की साइटों पर सफलतापूर्वक तैयार वाहक की (ए) लेबलिंग दक्षता को दर्शाने वाले डीओ-एमएस प्लॉट: लाइसिन और पेप्टाइड एन-टर्मिनस की साइड चेन पर प्राथमिक अमाइन, और (बी) ट्राइप्टिक क्लीवेज के अमीनो एसिड अवशेषों पर पाचन दक्षता। संक्षिप्त नाम: टीएमटी = अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एकल-सेल तैयारी गुणवत्ता नियंत्रण। डीओ-एमएस प्लॉट एकल कोशिकाओं (सी 5-10), नियंत्रण (सी 13,16), वाहक (सी 1), और संदर्भ (सी 2), और (बी) एकल कोशिकाओं और नियंत्रणों की तीव्रता में लापता डेटा के अंश को दर्शाते हैं। टैग 127C, 128N, 131C, 132N, 133N, और 133C, जो C3, C4, C11, C12 और C15 के अनुरूप हैं, इस विशेष सेट में अप्रयुक्त हैं। सकारात्मक नियंत्रण में थोक में पेप्टाइड्स के लिए संसाधित सेलुलर सामग्री होती है, फिर लेबलिंग से पहले 2-5 कोशिकाओं / μL के स्तर तक पतला किया जाता है। नकारात्मक नियंत्रण में एकल कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी प्रारंभिक चरणों के अधीन एक अच्छी तरह से शामिल होता है, बस एक एकल कोशिका के अतिरिक्त के बिना। संक्षिप्त नाम: टीएमटी = अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

SCoPE2 द्वारा एकल कोशिकाओं की सफल तैयारी और विश्लेषण की कुंजी में से एक वाहक और संदर्भ चैनलों की तैयारी है। सुझाए गए वाहक का आकार 100 से 200 कोशिकाओं का है; हालांकि, एक विशेष एकल-कोशिका प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या सिद्धांतों के आधार पर निर्धारित की जा सकती है जैसा कि कहीं और चर्चा की गईहै। सुझाए गए आकार के लिए, प्रति 384-वेल प्लेट में कम से कम ~ 11,275 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, जिससे प्रत्येक सेट में 200-सेल वाहक और 5-सेल संदर्भ की अनुमति मिलती है। यदि वांछित सेल आबादी एक सीमित कारक नहीं है, तो अधिक कोशिकाओं को अलग करना फायदेमंद हो सकता है, बस गलतियों के मामले में अतिरिक्त सामग्री है (जैसा कि इस प्रोटोकॉल में किया गया था, 11,275 कोशिकाओं के बजाय 22,000 कोशिकाओं को अलग करना)। वांछित प्लेटों की संख्या के लिए आवश्यक वाहक और संदर्भ की मात्रा को एक बैच में तैयार किया जाना चाहिए ताकि किसी भी बैच-टू-बैच भिन्नता को कम किया जा सके जो पेप्टाइड पहचान या परिमाणीकरण को बैचों के बीच भिन्न कर सकता है।

एकल-कोशिकाओं को 384-वेल प्लेट के कुओं में अलग करने से पहले, प्लेट लेआउट के डिजाइन पर विचार करना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक 384-वेल प्लेट के भीतर, सकारात्मक और नकारात्मक दोनों नियंत्रणों को लागू करने की सिफारिश की जाती है। नकारात्मक नियंत्रण वे कुएं होते हैं जिनमें कोई कोशिका नहीं जोड़ी जाती है, लेकिन एकल-कोशिका कुओं के समान अभिकर्मक परिवर्धन और प्रक्रियाओं से गुजरती है। सकारात्मक नियंत्रण वे कुएं होते हैं जिनमें सेल लाइसेट को एकल कोशिकाओं के बजाय 2-5 कोशिकाओं / μL तक पतला किया जाता है। यह लागू करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब एकल-सेल अलगाव विधियां अच्छी तरह से मान्य नहीं हैं। प्रत्येक 384-वेल प्लेट में आदर्श रूप से एकल कोशिकाओं और नियंत्रणों का यादृच्छिक वितरण होना चाहिए (उदाहरण के लिए, केवल एक पंक्ति में नकारात्मक या सकारात्मक नियंत्रण नहीं होना चाहिए)। प्रत्येक प्लेट में एक प्लेट में एक सेल प्रकार और दूसरी प्लेट में दूसरे सेल प्रकार को अलग करने के बजाय रुचि की सभी सेल आबादी का समान वितरण होना चाहिए। यह सेल प्रकार के ब्याज के साथ बैच प्रभाव ों को बांधने से बचेगा। इसके अलावा, यदि विश्लेषण के लिए एक से अधिक 384-वेल प्लेट की आवश्यकता होती है, तो यदि संभव हो तो कई दिनों में अलगाव चरण फैलाने के बजाय, कोशिकाओं को एक ही सत्र में अलग करने की सलाह दी जाती है।

एकल कोशिकाओं और वाहक /संदर्भ दोनों का लाइसिस फ्रीज-हीट चक्र23 के माध्यम से पानी में होता है। यह अनुमान लगाया गया है कि इस चरण के दौरान अधिकांश प्रोटीज को विकृत कर दिया गया है। ट्रिप्सिन को तब उच्च सांद्रता पर विकृतीकरण चरण के तुरंत बाद जोड़ा जाता है, यहां तक कि सबसे प्रचुर मात्रा में सेलुलर प्रोटीज की तुलना में एकाग्रता में अधिक परिमाण के कई आदेश। बड़े पैमाने पर कार्रवाई से, प्रोटीज गतिविधि के अधिकांश उत्पाद ट्रिप्सिन के कारण होंगे।

ट्रिप्सिन पाचन से पहले इस प्रोटोकॉल में सिस्टीन अवशेषों की कमी / क्षारीकरण नहीं किया जाता है। सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स मानव प्रोटिओम से लगभग 10% ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स का प्रतिनिधित्व करते हैं। हम कमी / क्षारीकरण के बिना एक दृष्टिकोण का उपयोग करके कम सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स का निरीक्षण करते हैं। ये चरण अभिकर्मकों का उपयोग करते हैं जो पाचन के तुरंत बाद टीएमटी (एनएचएस-एस्टर रसायन विज्ञान) द्वारा लेबलिंग के साथ असंगत होते हैं।

इस टीएमटी लेबलिंग रणनीति में, वाहक और संदर्भों को क्रमशः 126 और 127 एन के साथ लेबल किया जाता है, जबकि एकल-सेल और नियंत्रण कुओं को 128 सी से 135 एन के साथ लेबल किया जाता है। संदर्भ के बाद दो लेबल, 127 सी और 128 एन, वाहक और संदर्भ चैनलों से उत्पन्न आइसोटोपिक क्रॉस संदूषण के कारण उपयोग नहीं किए जाते हैं, जो स्पष्ट रूप से एकल कोशिकाओं की तुलना में पेप्टाइड सामग्री में बहुत अधिक प्रचुर मात्रा में हैं। कुल मिलाकर, प्रति सेट 12 टीएमटी चैनल हैं जिनका उपयोग टीएमटीप्रो -16प्लेक्स के साथ एकल कोशिकाओं या नियंत्रण कुओं को लेबल करने के लिए किया जा सकता है, या टीएमटीप्रो -18प्लेक्स के साथ प्रति सेट 14 टीएमटी चैनल।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकल-सेल प्रोटिओमिक्स माप करने के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में वाहक, एकल-कोशिका अलगाव, लाइसिस, पाचन, बारकोड लेबलिंग और उचित मास स्पेक्ट्रोमेट्री पैरामीटर तैयार करना शामिल है। इन चरणों को इस दस्तावेज में रेखांकित किया गया है औरकहीं और व्यापक रूप से विस्तृत किया गया है। प्रत्येक चरण में डीओ-एमएस में एक संबंधित भूखंड या भूखंडों का सेट होता है जो आसान गुणवत्ता नियंत्रण की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, वाहक के सफल निर्माण के मामले में, पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या, लेबलिंग दक्षता और गलत निकासी दर के प्रतिशत को दर्शाने वाले भूखंड इसकी सफल तैयारी के सत्यापन की अनुमति देते हैं। प्रतिनिधि DO-MS रिपोर्ट इस प्रकाशन में शामिल हैं और मूल डेटा16 के लिए http://scope2.slavovlab.net/ पर देखी जा सकती हैं। ये डीओ-एमएस रिपोर्ट लेखकों द्वारा अभी तक जांच नहीं की गई दिशाओं में विधि के अनुकूलन का आकलन करने की अनुमति देती हैं, जैसे कि लंबे एलसी ग्रेडिएंट, विभिन्न पाचन एंजाइम, या वैकल्पिक रासायनिक बारकोड।

वर्तमान में, डेटा-निर्भर अधिग्रहण एल्गोरिदम द्वारा पेप्टाइड्स का सीरियल विश्लेषण पेप्टाइड्स की संख्या को सीमित करता है जिन्हें उचित लंबाई के एलसी रन में विश्लेषण किया जा सकता है। यह विश्वसनीय एकल-सेल परिमाणीकरण21 के लिए पर्याप्त आयनों के सफल अधिग्रहण के लिए आवश्यक लंबे समय तक भरने के समय के कारण है। वाहक का उपयोग करने के लिए एक अंतर्निहित सीमा पाचन के प्रत्यक्ष मूल्यांकन और एकल कोशिकाओं की लेबलिंग दक्षता की कमी है। वर्तमान में, इस सीमा का एक समाधान एकल कोशिकाओं के साथ संसाधित एक बड़े नमूने पर गुणवत्ता नियंत्रण कर रहा है।

हमने एकल-सेल प्रोटिओमिक्स में सुधार के लिए कई अवसरों का प्रस्ताव दिया, जैसे कि कई विश्लेषकों के साथ मास स्पेक्ट्रोमीटर का निर्माण। वर्तमान विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और उपकरणों के साथ प्रति दिन लगभग 100 कोशिकाओं की गति से एकल स्तनधारी कोशिकाओं से हजारों प्रोटीन की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती है। एससीओपीई-एमएस दृष्टिकोण की दूसरी पीढ़ी, एससीओपीई 2 ने प्रति यूनिट समय में एनालाइजेबल कोशिकाओं की संख्या, प्रति यूनिट समय में विश्लेषण योग्य प्रोटीन की संख्या, नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक समय, अभिकर्मकों और उपकरणों की पहुंच, और प्रति एकल सेल तैयारी और विश्लेषण की समग्र लागत के संबंध में अपने पूर्ववर्ती पर काफी सुधार किया। झिल्ली-बाध्य प्रोटीन फ्रीज-हीट लाइसिस और प्रोटीज पाचन का उपयोग करके सुलभ हैं, जैसा कि यूरिया लाइसिस23 की तुलना में दिखाया गया है। विधि बहुतायत 16 के संबंध में प्रोटिओम के शीर्ष तीसरे से कईप्रोटीनों की पहचान करती है। यदि संशोधित प्रोटियोफॉर्म प्रोटिओम के शीर्ष तीसरे में है, और संशोधित पेप्टाइड मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए उत्तरदायी है (अच्छी तरह से आयनित होता है, असंशोधित पेप्टाइड से द्रव्यमान अंतर होता है), तो यह इस प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी होने की अधिक संभावना होगी। इस पद्धति को जैविक प्रणालियों में उपयोगी रूप से लागू किया जा सकता है जहां कोशिकाओं के बीच सार्थक विषमता होती है, जैसे कि भेदभाव, शिथिलता, या प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाएं (यानी, फागोसाइटोसिस)।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम फॉल 2021 एनएसएफ आई-कॉर्प्स प्रोग्राम (नॉर्थईस्टर्न यूनिवर्सिटी साइट) पुरस्कार को स्वीकार करना चाहते हैं जिसने इस प्रकाशन को वित्त पोषित किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plate, standard PCR plate Thermo Fisher Scientific AB1384 Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific A955-1 This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 271004-100ML This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils Thermo Fisher Scientific AB0626
Autosampler vial screw thread caps Thermo Fisher Scientific C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) MTC Bio C2595 This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease Sigma Aldrich E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm Thermo Fisher Scientific 60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade Thermo Fisher Scientific 85178 Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm Thermo Fisher Scientific C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol Sigma Aldrich 467804-50ML Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips Formulatrix MCLVPR2 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips Formulatrix MCLVS12 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler Formulatrix Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling Formulatrix 232400
MassPREP peptide mixture Waters 186002337 Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) USA Scientific 2621-0016 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips USA Scientific 1402-3900 If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free Thermo Fisher Scientific AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) Benchmark Scientific Model C2000 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) Biorad 1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg Thermo Fisher Scientific A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 Sigma Aldrich T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade Promega V5280 This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results.

Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer) VWR Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) VWR 97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific W6-1 All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .

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References

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जीव विज्ञान अंक 190
फ्रीज-हीट लाइसिस और एक आइसोबेरिक वाहक का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए एकल-सेल प्रोटिओमिक्स तैयारी
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Petelski, A. A., Slavov, N., Specht, … More

Petelski, A. A., Slavov, N., Specht, H. Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier. J. Vis. Exp. (190), e63802, doi:10.3791/63802 (2022).

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