Biology

Preparazione di proteomica a cella singola per analisi di spettrometria di massa mediante lisi a calore freddo e un vettore isobarico

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802

Aleksandra A. Petelski*¹, Nikolai Slavov^1,2,3, Harrison Specht*¹

¹Department of Bioengineering, Northeastern University, ²Barnett Institute, Northeastern University, ³Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

Summary

In questo protocollo, descriviamo come preparare le cellule di mammifero per l'analisi proteomica a singola cellula tramite spettrometria di massa utilizzando reagenti e apparecchiature disponibili in commercio, con opzioni per il pipettaggio manuale e automatico.

Abstract

L'analisi proteomica a singola cellula richiede metodi sensibili, quantitativamente accurati, ampiamente accessibili e robusti. Per soddisfare questi requisiti, il protocollo Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) è stato sviluppato come metodo di seconda generazione per quantificare da centinaia a migliaia di proteine da campioni limitati, fino al livello di una singola cellula. Gli esperimenti che utilizzano questo metodo hanno raggiunto la quantificazione di oltre 3.000 proteine in 1.500 singole cellule di mammifero (500-1.000 proteine per cellula) in 10 giorni di tempo dello strumento dello spettrometro di massa. SCoPE2 sfrutta un ciclo di congelamento-calore per la lisi cellulare, ovviando alla necessità di pulizia delle singole cellule e riducendo di conseguenza le perdite di campioni, accelerando al contempo la preparazione dei campioni e semplificandone l'automazione. Inoltre, il metodo utilizza un vettore isobarico, che aiuta l'identificazione delle proteine e riduce le perdite di campioni.

Questo protocollo video fornisce una guida dettagliata per consentire l'adozione di analisi automatizzate delle proteine a singola cellula utilizzando solo apparecchiature e reagenti ampiamente accessibili. Dimostriamo passaggi critici nella procedura di preparazione di singole cellule per l'analisi proteomica, dalla raccolta fino all'iniezione all'analisi cromatografica-spettrometria di massa tandem liquida (LC-MS / MS). Inoltre, gli spettatori sono guidati attraverso i principi della progettazione sperimentale con il vettore isobarico, il controllo di qualità sia per il vettore isobarico che per i preparati a singola cellula e i risultati rappresentativi con una discussione dei limiti dell'approccio.

Introduction

L'analisi a singola cellula è ampiamente utilizzata per studiare il livello di eterogeneità all'interno di sistemi biologici che altrimenti sarebbe indiscernibile con misurazioni di massa ^1,2,3. Tale diversità cellulare può avere conseguenze funzionali che possono favorire la comprensione dei processi biologici integrali, dalla resistenza terapeutica delle cellule tumorali ^4,5,6 all'eterogeneità cellula-cellula nel diabete 7,8,9,10. Molte indagini si sono concentrate sulla misurazione degli acidi nucleici in singole cellule, misurando i livelli genetici o trascrittomici e hanno permesso la classificazione di tipi e stati cellulari. Tali progressi nello spazio degli acidi nucleici, tuttavia, non possono colmare il divario di conoscenza della regolazione post-trascrizionale¹¹, portando alla necessità di misurazioni di proteine ad alto rendimento simile in singole cellule^12,13,14,15.

Abbiamo sviluppato SCoPE2^16,17 per soddisfare la domanda di proteomica unicellulare rigorosa e robusta dei sistemi di mammiferi. Si tratta di un metodo multiplexato, che consente una maggiore produttività etichettando e analizzando molte celle in parallelo¹⁸, in contrasto con i mthod label-free che analizzano una cella alla volta^19,20. La metodologia di preparazione del campione, l'approccio alla spettrometria di massa e le successive fasi di analisi dei dati consentono una quantificazione accurata di centinaia o migliaia di proteine per singola cellula. Questo metodo rende possibile l'analisi spettrometrica di massa di singole cellule attraverso il vettore isobarico²¹, un piccolo campione di massa di cellule (di solito 25-200) che è biologicamente simile alla popolazione monocellulare di interesse. Questo materiale portante viene multiplexato in un set con un canale di riferimento dello stesso materiale e singole celle attraverso l'uso di tag di massa tandem (etichette TMT). Il canale portante riduce la perdita di campioni nelle aree superficiali e fornisce i frammenti della spina dorsale ionica per una corretta identificazione del peptide. Il canale di riferimento, che viene preparato in blocco e successivamente diluito fino a 5-10 celle equivalenti per ogni set a cella singola, aiuta a controllare la variabilità tecnica nell'analisi. In particolare, il riferimento consente la normalizzazione della variabilità causata da effetti correlati a LC-MS/MS, come il campionamento ionico e le efficienze di ionizzazione. Di solito, i canali di riferimento e di trasporto sono costituiti dalla stessa popolazione cellulare.

Questo protocollo di preparazione del campione è un metodo di seconda generazione basato su SCoPE-MS²² da molteplici miglioramenti sinergici. I miglioramenti includono un metodo di lisi cellulare che evita la pulizia del campione, che è una fase comune dei preparativi proteomici della SM. Utilizza mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)²³, che è un metodo di lisi a calore gelido. Questo metodo ha permesso la lisi di singole celle in volumi più piccoli e in piastre multipozzetto piuttosto che in fiale, facilitando una maggiore velocità di produzione e automazione da parte dei termociclatori. Nel complesso, questo metodo ha ridotto il costo per singola cella e aumentato l'accuratezza quantitativa rispetto a SCoPE-MS^16,24.

Questo protocollo descrive come preparare singole cellule per l'analisi proteomica, incluso come preparare il vettore e i canali di riferimento utilizzando le etichette isobariche TMTpro 18-plex. Le cellule di mammifero che sono in sospensione monocellulare e che possono essere isolate in piastre a 384 pozzetti sono probabilmente suscettibili di questo protocollo. Sono inclusi anche risultati rappresentativi di set a cella singola di successo, che mostrano diversi grafici di controllo qualità generati da un'app R Shiny, DO-MS²⁵. Altri strumenti software pubblicati^26,27 e linee guida sperimentali ^17,21 hanno migliorato l'adozione di questo protocollo. Speriamo che questa guida visiva aiuti ulteriormente i ricercatori a eseguire esperimenti di proteomica a singola cellula.

Protocol

NOTA: In questo protocollo, la temperatura ambiente (RT) è 18-22 °C.

1. Generazione del supporto e del materiale di riferimento

Isolamento cellulare
1. Raccogli le cellule di interesse in sospensioni cellulari in 1x PBS ghiacciato.
  NOTA: Se possibile, il supporto e il materiale di riferimento devono essere preparati a partire dalla popolazione o dalle popolazioni cellulari scelte per essere studiate a livello di singola cellula. Un numero simile di cellule provenienti dalle diverse condizioni sperimentali (come le cellule immunitarie stimolate e non stimolate) dovrebbe costituire il vettore e il riferimento. In situazioni in cui un numero sufficiente di queste cellule non può essere raccolto, dovrebbe essere selezionata una popolazione cellulare adatta in base alla somiglianza biologica.
2. Utilizzando un emocitometro o altri mezzi di conteggio delle cellule (come FACS), contare il numero di cellule nella sospensione.
3. Spin down e risospendere 22.000 cellule di ciascun tipo di cellula in 11 μL di acqua di grado HPLC, separatamente in provette PCR (provette PCR standard da 250 μL).
  NOTA: Il numero di celle qui consigliato è sufficiente per i vettori e i riferimenti per il numero di set che possono essere preparati da una piastra da 384 pozzetti piena di celle singole. L'input della cella in questo passaggio e le quantità di reagenti nei passaggi successivi possono essere scalati proporzionalmente per un numero maggiore di set. La velocità di rotazione dipende dalle pratiche di coltura cellulare del laboratorio. Un tipico spin down: 300 × g per 5 min.
4. Trasferire i campioni in un congelatore a -80 °C per almeno 30 minuti.
  PUNTO DI PAUSA: I campioni possono rimanere congelati per diversi mesi senza conseguenze per i dati a cella singola.
Lisi cellulare
1. Riscaldare il tubo PCR con le celle a 90 °C per 10 minuti (con coperchio del termociclatore impostato a 105 °C), quindi lasciare raffreddare i tubi a 12 °C subito dopo il ciclo di riscaldamento.
2. Vortice brevemente il tubo, quindi ruotare verso il basso in uno spinner per tubi PCR da banco a RT per raccogliere tutto il liquido sul fondo del tubo.
3. In un sonicatore a bagnomaria, sonicare i tubi per 5 minuti, quindi posizionarli sul ghiaccio a RT.
Digestione della tripsina
1. Aggiungere 2,2 μL della miscela master (vedere Tabella 1 per i componenti) a ciascuna provetta mentre si è sul ghiaccio.
  ATTENZIONE: La tripsina può causare irritazione cutanea, respiratoria e oculare. Assicurati di indossare dispositivi di protezione individuale. Maneggiare sotto una cappa aspirante chimica.
2. Vortice i tubi brevemente per mescolare e girare giù in un filatore di tubi PCR da banco a RT per raccogliere tutto il liquido sul fondo di ogni tubo.
3. Riscaldare i campioni a 37 °C per 3 ore (con coperchio del termociclatore impostato a 52 °C).
Reazione di etichettatura TMT
1. Centrifugare i campioni dopo la digestione in uno spinner per tubi PCR da banco a RT.
2. Dividere ogni campione in due volumi uguali di 6,6 μL ciascuno, in modo che ogni provetta contenga 11.000 cellule.
3. Ai tubi destinati al supporto, aggiungere 3,3 μL di etichetta TMT 126 che è stata risospesa ad una concentrazione di 85 mM.
4. Ai tubi destinati al riferimento, aggiungere 3,3 μL di etichetta TMT 127N che è stata risospesa ad una concentrazione di 85 mM.
5. Vortice brevemente i tubi e girare giù in un filatore di tubi PCR da banco a RT per raccogliere il liquido sul fondo.
6. Lasciare i tubi a RT per 1 ora.
Tempra della reazione di marcatura TMT
1. Aggiungere 1,65 μL di idrossilammina allo 0,5% a ciascun tubo.
  ATTENZIONE: L'idrossilammina può causare irritazione cutanea. Assicurati di indossare dispositivi di protezione individuale.
2. Vortice brevemente i tubi e girare giù in un filatore di tubi PCR da banco a RT per raccogliere il liquido sul fondo.
3. Lasciare i tubi a RT per 30 minuti.
Combinazione di portante e riferimento
1. Se i campioni che costituiranno il vettore sono stati etichettati separatamente, mescolarli in proporzioni uguali.
2. Se i campioni che costituiranno il riferimento sono stati etichettati separatamente, mescolarli in proporzioni uguali.
3. Mescolare il supporto e il riferimento in modo che la concentrazione finale del supporto sia 100-200 cellule / μL e la concentrazione di riferimento sia 5-10 cellule / μL.
4. Valutare la qualità del supporto e dei materiali di riferimento prima di combinarli con set a cella singola.
  NOTA: il controllo di qualità del supporto e del materiale di riferimento può essere eseguito con una varietà di metodi, ma si consiglia di utilizzare il software DO-MS, disponibile a do-ms.slavovlab.net¹⁷. Le misurazioni critiche della qualità includono il tasso di miscleavage (<25%, una metrica calcolata come il numero di peptidi identificati con sicurezza con una scissione mancata divisa per il numero di peptidi identificati con sicurezza in totale) e l'efficienza di etichettatura (>99%, una metrica calcolata come il numero di siti di etichettatura, vale a dire il peptide N-terminus e la lisina, con un'etichetta divisa per il numero totale di siti di etichettatura).
  PUNTO DI PAUSA: Il supporto e i materiali di riferimento possono essere conservati a -80 °C fino a quando necessario.

Componente	Concentrazione della miscela	Concentrazione finale per tubo
Tripsina Oro	50 ng/μL	8,33 ng/μL
TEAB, pH = 8,5	500 mM	83,33 mM
Nucleasi benzonase	1.2 unità	0,2 unità

Tabella 1: Quantità di reagente della miscela master. Sono elencate le concentrazioni finali di reagenti necessari per la digestione della tripsina.

2. Preparazione del campione SCoPE2

Isolamento cellulare
1. Integrare l'acqua di grado HPLC con 25 fmol per peptide per μL di una soluzione peptidica sintetica.
  NOTA: La soluzione peptidica Waters MassPrep è un esempio di ciò che può essere utilizzato. È composto da sette peptidi che non ionizzano molto bene. Questo è un aspetto chiave di questa soluzione: questi peptidi non interferiscono con un'accurata quantificazione della spettrometria di massa delle singole cellule. Qualsiasi miscela altamente purificata di alcuni peptidi che difficilmente saranno nei campioni di interesse sarà appropriata.
2. Aggiungere 1 μL di questa miscela a ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti utilizzando un robot di erogazione del liquido o una pipetta manuale.
3. Sigillare la piastra e girarla in uno spinner da banco a RT per raccogliere il liquido sul fondo.
  PUNTO DI PAUSA: Le piastre con questa soluzione possono essere conservate a -80 °C fino al momento del bisogno.
4. Ottenere una sospensione delle celle non fisse disaggregate.
  NOTA: Il modo esatto in cui si ottiene la sospensione cellulare si basa sul tipo di cellula di interesse. Ecco alcuni esempi generali:
  1. Cellule di sospensione: spingere le cellule in un pellet e rimuovere il terreno di coltura cellulare.
  2. Cellule aderenti: rimuovere le cellule dal piatto o dal pallone attraverso tripsinizzazione o raschiatura. Quindi, ruotarli verso il basso per rimuovere il mezzo di coltura cellulare.
5. Lavare la sospensione cellulare due volte con 1x PBS ghiacciato. Lasciare le celle sospese in 1x PBS dopo il secondo lavaggio.
6. Se la piastra a 384 pozzetti è stata congelata, scongelarla a RT. Ruotarla verso il basso per assicurarsi che tutto il liquido sia sul fondo dei pozzetti.
7. Utilizzare un selezionatore di celle o altri mezzi disponibili, come la raccolta manuale manuale, per distribuire singole celle nei rispettivi pozzetti.
  NOTA: Aggiungere singole celle ai pozzetti lasciando alcuni pozzetti vuoti per i controlli negativi e positivi (vedere discussione). Quando si utilizza la citometria a flusso, utilizzare la portata più bassa possibile per il citometro a flusso. Si ritiene che una portata inferiore sia più delicata per la gestione delle celle. Inoltre, la dimensione dell'ugello dovrebbe essere appropriata per l'uso con le celle di interesse. Si raccomanda di collaborare con una struttura di citometria a flusso.
8. Aggiungere controlli positivi di lisato equivalente a 2-5 celle a pozzetti selezionati pipettati manualmente o con robot di gestione dei liquidi.
9. Sigillare e girare la piastra con celle ordinate in uno spinner da banco a RT per raccogliere il liquido sul fondo. Congelare la piastra a -80 °C il prima possibile.
  PUNTO DI PAUSA: Le piastre con celle singole selezionate possono essere conservate a -80 °C fino a quando non è necessario.
Lisi cellulare
1. Prendete la piastra da 384 pozzetti con le celle singole selezionate e mettetela nel termociclatore il più rapidamente possibile.
2. Riscaldare la piastra a 90 °C per 10 minuti (con la temperatura del coperchio impostata su 105 °C), quindi lasciare raffreddare la piastra a 12 °C.
3. Gira brevemente il piatto in uno spinner da banco a RT.
4. In un sonicatore a bagnomaria, sonicare la piastra per 5 minuti a RT, quindi posizionarla sul ghiaccio.
Digestione della tripsina
1. Preparare 100 μL della miscela principale (vedere Tabella 1 per i componenti) per piastra da 384 pozzetti.
2. A ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti, aggiungere 0,2 μL della miscela madre preparata al punto 2.3.1 utilizzando un manipolatore di liquidi.
  NOTA: utilizzare volumi maggiori se si utilizza il pipettaggio manuale, assicurandosi che le concentrazioni finali di reagenti siano sempre le stesse per pozzetto.
3. Sigillare la piastra, il vortice per 5 s e girare verso il basso in uno spinner da banco a RT.
4. Riscaldare la piastra a 384 pozzetti a 37 °C (con la temperatura del coperchio impostata su 52 °C) per 3 ore.
Reazione di etichettatura TMT
1. Estrarre le scorte di 85 mM di etichette TMT (da 128N a 135N) dal congelatore a -80 °C. Riscaldare i tubi a temperatura ambiente prima di aprirli.
2. Diluire le etichette a 22 mM in acetonitrile anidro.
  ATTENZIONE: L'acetonitrile è un liquido infiammabile. Può irritare la pelle, gli occhi, il tratto respiratorio e il sistema nervoso centrale. Assicurati di indossare dispositivi di protezione individuale. Maneggiare sotto una cappa aspirante chimica.
3. Utilizzando questa strategia di etichettatura, aggiungere 0,5 μL di etichette TMT diluite a ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti. Utilizzare un robot di erogazione di liquidi (se si utilizza un manipolatore di liquidi, assicurarsi di utilizzare un'apparecchiatura associata adatta ai solventi organici) o una pipetta manuale.
  NOTA: vedere la Tabella 2 per la strategia di etichettatura. Vedere la Tabella 3 per un esempio di layout delle targhe.
4. Sigillare la piastra, il vortice per 5 s e girare verso il basso in uno spinner da banco a RT.
5. Lasciare che la reazione di etichettatura proceda a RT per 1 ora.
Tempra della reazione di marcatura TMT
1. A ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti, aggiungere 0,2 μL di idrossilammina allo 0,5% (diluita in acqua di grado HPLC) utilizzando un manipolatore di liquidi.
  NOTA: utilizzare volumi maggiori se si utilizza il pipettaggio manuale, assicurandosi che le concentrazioni finali di reagenti siano sempre le stesse per pozzetto.
2. Sigillare la piastra, il vortice per 5 s e girare verso il basso in uno spinner da banco a RT.
3. Tenere la piastra a RT per 30 minuti.
Preparazione per l'analisi LC-MS/MS: combinazione di celle singole e pozzetti di controllo con materiale carrier/riferimento
1. Rimuovere il supporto combinato/materiale di riferimento dal congelatore a -80 °C.
2. Per ogni set, pipettare 1 μL di supporto e materiale di riferimento nel primo pozzetto che farà parte di un singolo set. Pipettare il volume completo del primo pozzetto al pozzetto successivo. Continuare a pipettare il volume completo da una cella all'altra fino a quando tutti i pozzetti da includere in un singolo set sono stati combinati nel pozzetto finale.
  NOTA: il supporto e il materiale di riferimento devono essere a una concentrazione di 200 e 5 celle equivalenti, rispettivamente, ma come discusso in precedenza²¹, queste quantità possono variare. Ogni set, come delineato nella strategia di etichettatura (vedere Tabella 2), deve contenere supporto, riferimento e fino a 12 o 14 campioni a cella singola o di controllo quando si utilizza TMTpro-16plex o TMTpro-18plex, rispettivamente (vedere il passaggio 2.4.3).
3. Per ogni set, aggiungere 5 μL di acetonitrile al 50% (diluito in acqua di grado HPLC) al primo pozzetto unicellulare da includere in ciascun set. Pipet il volume completo dal primo pozzo al pozzo successivo. Continuare a pipettare il volume completo da una cella all'altra fino a quando tutti i pozzetti da includere in un singolo set sono stati combinati nel pozzetto finale.
  NOTA: Questa fase di lavaggio può aiutare nel recupero del campione dai pozzi.
4. Trasferisci ogni set nei singoli inserti di vetro dell'autocampionatore.
  NOTA: Questi set possono anche essere combinati in singoli pozzetti di una piastra da 384 pozzetti e posizionati direttamente nell'autocampionatore per l'iniezione²⁸.
5. Una volta che tutti i set sono stati combinati e inseriti in inserti di vetro, asciugare i campioni.
  PUNTO DI PAUSA: I set essiccati possono essere conservati a -80 °C per almeno 1 settimana prima di funzionare su uno spettrometro di massa.
6. Prima dell'analisi LC-MS/MS, aggiungere 1,2 μL di acido formico allo 0,1% (diluito in acqua di grado HPLC) a ciascun set per risospendere i peptidi marcati.
  ATTENZIONE: L'acido formico è un liquido infiammabile. Può causare gravi danni agli occhi o ustioni della pelle. Assicurati di indossare dispositivi di protezione individuale. Maneggiare in un'area ben ventilata.
7. Posizionare gli inserti dell'autocampionatore in flaconcini di vetro e chiudere ogni campione con un tappo.
8. Vortice ogni flaconcino per 5 s per assicurarsi che la risospensione sia completa, quindi girare giù in un filatore di flaconcino a RT.
9. Assicurarsi che ogni campione sia nella parte inferiore dell'inserto, piuttosto che spruzzato sui lati.
10. Posizionare i flaconcini nel vassoio dell'autocampionatore.
11. Per ogni set, iniettare 1 μL per l'analisi LC-MS/MS.

Etichetta	126	127N	127C	128N	128C	129N	129C	130N	130C	....	135N
Tipo di campione	Trasportatore	Riferimento	Vuoto	Vuoto	SC/Controllo	SC/Controllo	SC/Controllo	SC/Controllo	SC/Controllo	....	SC/Controllo

Tabella 2: Esempio di schema di etichettatura SCoPE2 TMTpro-18plex. Il supporto e il riferimento sono solitamente etichettati nelle prime due etichette TMT. Quindi, le due etichette successive vengono saltate a causa della potenziale contaminazione isotopica che renderebbe la quantificazione meno accurata. Le altre etichette rimaste sono per celle singole o controlli.

128C

129N

129C

130N

130C

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

128C

129N

129C

130N

130C

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

Okay

Tabella 3: Esempio di layout delle piastre per l'etichettatura con TMTpro-16plex. Utilizzando un formato di piastra a 384 pozzetti (o qualsiasi altro formato di piastra), è importante randomizzare i pozzetti in cui sono ordinate le celle. Per TMTpro-18plex verrà utilizzato un layout di piastra diverso.

Representative Results

I risultati positivi del protocollo comportano la verifica che una serie di passaggi critici del protocollo siano stati eseguiti con successo; questi includono la preparazione del vettore, l'isolamento a singola cellula, la lisi, la digestione, l'etichettatura dei codici a barre e l'ottimizzazione dei parametri MS. I grafici DO-MS consentono una facile valutazione del completamento di ogni passaggio critico del protocollo. Un vettore preparato con successo, che di solito corrisponde a 25 e 200 cellule in quantità (per set), è ben digerito e ben etichettato. I grafici DO-MS consentono di quantificare l'intensità del campione (per stimare la quantità), l'efficienza della digestione (idealmente <25% di miscleavages) e l'efficienza di etichettatura (deve essere >99%). Più criticamente, i campioni di vettore che non sono completamente etichettati possono consentire la reazione incrociata con i codici a barre destinati alle singole cellule e aggiungere un segnale spurio alla quantificazione dei peptidi unicellulari.

I pozzetti di controllo negativi includono tutti i reagenti sperimentali ma mancano di una cellula. Ciò consente non solo di valutare il rumore di fondo, ma anche di determinare l'efficienza di isolamento cellulare fornendo un segnale rappresentativo di un pozzo vuoto. Il rapporto DO-MS offre grafici per valutare il segnale misurato del pozzo di controllo accanto ai pozzetti a cella singola per determinare il successo dell'isolamento cellulare e del rumore di fondo. Inoltre, la qualità della quantificazione può essere valutata utilizzando la pipeline SCoPE2 (disponibile su GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) o il pacchetto SCP Bioconductor²⁹.

L'efficienza di digestione ed etichettatura delle singole cellule potrebbe non essere valutata direttamente come con il vettore, ma DO-MS fornisce nuovamente grafici che consentono la stima dell'efficienza della digestione e dell'etichettatura. Includendo un controllo di 100-200 cellule accanto alla preparazione delle singole cellule (cioè, ricevendo tutte le stesse aggiunte di reagenti), le efficienze di digestione ed etichettatura possono essere valutate per tale controllo e assunte per essere condivise dalle singole cellule preparate a fianco. Una cattiva digestione sarà indicata da un alto rapporto tra l'intensità dei peptidi scissi e le loro controparti completamente scisse (Figura 1).

Un altro fattore da considerare nei set è la frazione di dati mancanti e l'intensità mediana dello ione reporter in ciascun canale TMT (Figura 2). Quando le singole cellule vengono preparate con successo, la quantità di dati mancanti per cellula e controllo positivo è molto inferiore rispetto ai campioni di controllo negativi. Allo stesso modo, l'intensità mediana dei precursori è molto più alta nelle singole cellule e nei controlli positivi rispetto ai controlli negativi. L'ottimizzazione dei parametri MS è stata ampiamente discussa altrove²¹, e i parametri ottimali possono essere determinati utilizzando strumenti come DO-MS o SCP Companion^25,27.

Figura 1: Controllo della qualità della preparazione del vettore. Grafici DO-MS che descrivono (A) l'efficienza di marcatura di un vettore preparato con successo nei siti di etichettatura con TMT: l'ammina primaria sulla catena laterale della lisina e il peptide N-terminale e (B) l'efficienza della digestione ai residui amminoacidici della scissione triptica. Abbreviazione: TMT = tag di massa tandem. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Controllo della qualità della preparazione a cella singola. Grafici DO-MS che descrivono (A) la frazione di dati mancanti in singole celle (C5-10), controlli (C13,16), portante (C1) e riferimento (C2) e (B) l'intensità delle singole celle e controlli. I tag 127C, 128N, 131C, 132N, 133N e 133C, che corrispondono a C3, C4, C11, C12 e C15, non sono utilizzati in questo particolare set. Il controllo positivo consiste in materiale cellulare trasformato in peptidi alla rinfusa, quindi diluito a un livello di 2-5 cellule / μL prima della marcatura. Il controllo negativo consiste in un pozzo sottoposto a tutte le fasi preparatorie utilizzate per le singole cellule, proprio senza l'aggiunta di una singola cella. Abbreviazione: TMT = tag di massa tandem. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

Una delle chiavi per una preparazione e un'analisi di successo delle singole cellule da parte di SCoPE2 è la preparazione del vettore e dei canali di riferimento. La dimensione del supporto suggerita è compresa tra 100 e 200 celle; Tuttavia, il numero di cellule necessarie per un particolare esperimento a singola cellula può essere determinato sulla base di principi come discusso altrove²¹. Per la dimensione suggerita, sono necessarie almeno ~ 11.275 celle per piastra a 384 pozzetti, consentendo un supporto di 200 celle e un riferimento a 5 celle in ciascun set. Può essere vantaggioso isolare più cellule se le popolazioni cellulari desiderate non sono un fattore limitante, avere semplicemente materiale extra in caso di errori (come è stato fatto in questo protocollo, isolando 22.000 cellule invece di 11.275 cellule). La quantità di supporto e di riferimento necessaria per il numero di piastre desiderate deve essere preparata in un singolo lotto per ridurre al minimo qualsiasi variazione da lotto a lotto che possa causare l'identificazione o la quantificazione dei peptidi a differire tra i lotti.

Prima di isolare le singole celle in pozzetti di una piastra a 384 pozzetti, è importante considerare il design del layout della piastra. All'interno di ogni piastra a 384 pozzetti, si consiglia di implementare controlli sia positivi che negativi. I controlli negativi sono pozzetti in cui non vengono aggiunte cellule ma subiscono le stesse aggiunte e procedure di reagenti dei pozzetti a singola cellula. I controlli positivi sono pozzetti in cui viene aggiunto lisato cellulare diluito a 2-5 cellule / μL invece di singole cellule. Ciò è particolarmente importante da implementare quando i metodi di isolamento a cella singola non sono ben convalidati. Ogni piastra a 384 pozzetti dovrebbe idealmente avere una distribuzione randomizzata di singole celle e controlli (ad esempio, non avere controlli negativi o positivi in una sola riga). Ogni piastra dovrebbe avere una distribuzione uguale di tutte le popolazioni cellulari di interesse, piuttosto che isolare un tipo di cellula in una piastra e un secondo tipo di cellula in una seconda piastra. Ciò eviterà di legare gli effetti batch con i tipi di celle di interesse. Inoltre, se è necessaria più di una piastra da 384 pozzetti per l'analisi, è consigliabile isolare le cellule in una singola sessione, piuttosto che distribuire la fase di isolamento su diversi giorni, se possibile.

La lisi sia delle singole cellule che del vettore/riferimento avviene in acqua attraverso un ciclo di congelamento-calore²³. Si prevede che la maggior parte delle proteasi siano state denaturate durante questa fase. La tripsina viene quindi aggiunta immediatamente dopo la fase di denaturazione ad alta concentrazione, molti ordini di grandezza in concentrazione maggiore anche delle proteasi cellulari più abbondanti. Con l'azione di massa, la maggior parte dei prodotti dell'attività della proteasi sarà dovuta alla tripsina.

La riduzione/alchilazione dei residui di cisteina non viene eseguita in questo protocollo prima della digestione della tripsina. I peptidi contenenti cisteina rappresentano circa il 10% dei peptidi triptici dal proteoma umano. Osserviamo meno peptidi contenenti cisteina utilizzando un approccio senza riduzione / alchilazione. Questi passaggi utilizzano reagenti incompatibili con l'etichettatura mediante TMT (NHS-ester chemistry) immediatamente dopo la digestione.

In questa strategia di etichettatura TMT, il vettore e i riferimenti sono etichettati rispettivamente con 126 e 127N, mentre i pozzetti a cella singola e di controllo sono etichettati con 128C fino a 135N. Le due etichette dopo il riferimento, 127C e 128N, non sono utilizzate a causa della contaminazione incrociata isotopica derivante dal vettore e dai canali di riferimento, che sono chiaramente molto più abbondanti nel materiale peptidico rispetto alle singole cellule. In totale, ci sono 12 canali TMT per set che possono essere utilizzati per etichettare singole celle o pozzetti di controllo con TMTpro-16plex o 14 canali TMT per set con TMTpro-18plex.

I passaggi critici del protocollo per eseguire misurazioni proteomiche a singola cellula utilizzando questo protocollo includono la preparazione del vettore, l'isolamento a singola cellula, la lisi, la digestione, l'etichettatura con codice a barre e i parametri di spettrometria di massa appropriati. Questi passaggi sono stati delineati in questo documento e sono stati ampiamente dettagliati altrove 17,21,25. Ogni fase ha un corrispondente grafico o insieme di grafici in DO-MS che consentono un facile controllo della qualità. Ad esempio, in caso di creazione riuscita del vettore, i grafici che descrivono il numero di peptidi identificati, l'efficienza dell'etichettatura e la percentuale di miscleavage rate consentono di verificare la sua preparazione di successo. Le relazioni rappresentative DO-MS sono incluse in questa pubblicazione e possono essere visualizzate a http://scope2.slavovlab.net/ per i dati originali¹⁶. Questi rapporti DO-MS consentono di valutare l'ottimizzazione del metodo in direzioni non ancora studiate dagli autori, come gradienti LC più lunghi, diversi enzimi di digestione o codici a barre chimici alternativi.

Attualmente, l'analisi seriale dei peptidi mediante algoritmi di acquisizione dipendenti dai dati limita il numero di peptidi che possono essere analizzati in una corsa LC di una lunghezza ragionevole. Ciò è in parte dovuto ai tempi di riempimento più lunghi necessari per l'acquisizione di una quantità sufficiente di ioni per una quantificazione affidabile a singola cellula²¹. Una limitazione intrinseca all'utilizzo del vettore è la mancanza di valutazione diretta della digestione e dell'efficienza di etichettatura delle singole cellule. Attualmente, una soluzione a questa limitazione è l'esecuzione del controllo di qualità su un campione più grande elaborato insieme alle singole celle.

Abbiamo proposto una serie di opportunità per migliorare la proteomica a singola cellula, come la costruzione di spettrometri di massa con analizzatori multipli. Il metodo attuale consente la quantificazione di migliaia di proteine da singole cellule di mammifero ad una velocità di circa 100 cellule al giorno con reagenti e attrezzature disponibili in commercio. SCoPE2, la seconda generazione dell'approccio SCoPE-MS, ha migliorato significativamente il suo predecessore per quanto riguarda il numero di cellule analizzabili per unità di tempo, il numero di proteine analizzabili per unità di tempo, il tempo necessario per la preparazione del campione, l'accessibilità dei reagenti e delle apparecchiature e il costo complessivo di preparazione e analisi per singola cellula. Le proteine legate alla membrana sono accessibili utilizzando la lisi a calore gelido e la digestione della proteasi, come mostrato rispetto alla lisi dell'urea²³. Il metodo identifica molte proteine dal terzo superiore del proteoma rispetto all'abbondanza¹⁶. Se la proteoforma modificata si trova nel terzo superiore del proteoma e il peptide modificato è suscettibile di analisi di spettrometria di massa (ionizza bene, ha una differenza di massa dal peptide non modificato), sarà più probabile che sia suscettibile di questo protocollo. Questo metodo può essere applicato fruttuosamente nei sistemi biologici in cui vi è una significativa eterogeneità tra le cellule, come nella differenziazione, nella senescenza o nelle risposte immunologiche (cioè la fagocitosi).

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere il premio Fall 2021 NSF I-Corps Program (sito della Northeastern University) che ha finanziato questa pubblicazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plate, standard PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB1384	Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	A955-1	This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%	Sigma Aldrich	271004-100ML	This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils	Thermo Fisher Scientific	AB0626
Autosampler vial screw thread caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)	MTC Bio	C2595	This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease	Sigma Aldrich	E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade	Thermo Fisher Scientific	85178	Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol	Sigma Aldrich	467804-50ML	Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips	Formulatrix	MCLVPR2	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips	Formulatrix	MCLVS12	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler	Formulatrix		Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling	Formulatrix	232400
MassPREP peptide mixture	Waters	186002337	Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)	USA Scientific	2621-0016	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips	USA Scientific	1402-3900	If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)	Benchmark Scientific	Model C2000	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)	Biorad	1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg	Thermo Fisher Scientific	A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5	Sigma Aldrich	T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade	Promega	V5280	This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)	VWR	Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)	VWR	97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	W6-1	All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .