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Biology

Preparação de Proteômica de Célula Única para Análise de Espectrometria de Massa usando Lise de Calor Congelante e um Transportador Isobárico

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802
Automatic Translation
*1, 1,2,3, *1
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University
* These authors contributed equally

Summary

Neste protocolo, descrevemos como preparar células de mamíferos para análise proteômica unicelular via espectrometria de massa usando reagentes e equipamentos comercialmente disponíveis, com opções para pipetagem manual e automática.

Abstract

A análise proteômica de célula única requer métodos sensíveis, quantitativamente precisos, amplamente acessíveis e robustos. Para atender a esses requisitos, o protocolo Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) foi desenvolvido como um método de segunda geração para quantificar centenas a milhares de proteínas de amostras limitadas, até o nível de uma única célula. Experimentos usando este método conseguiram quantificar mais de 3.000 proteínas em 1.500 células de mamíferos individuais (500-1.000 proteínas por célula) em 10 dias de tempo de instrumento de espectrômetro de massa. O SCoPE2 aproveita um ciclo de congelamento térmico para lise celular, evitando a necessidade de limpeza de células individuais e, consequentemente, reduzindo as perdas de amostras, ao mesmo tempo em que agiliza a preparação da amostra e simplifica sua automação. Além disso, o método usa um transportador isobárico, que auxilia na identificação de proteínas e reduz as perdas de amostras.

Este protocolo de vídeo fornece orientação detalhada para permitir a adoção de análises automatizadas de proteínas de célula única usando apenas equipamentos e reagentes que são amplamente acessíveis. Demonstramos etapas críticas no procedimento de preparação de células individuais para análise proteômica, desde a colheita até a injeção até a cromatografia líquida - espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Além disso, os espectadores são guiados pelos princípios de desenho experimental com o transportador isobárico, controle de qualidade para o transportador isobárico e preparações unicelulares e resultados representativos com uma discussão das limitações da abordagem.

Introduction

A análise unicelular é amplamente utilizada para estudar o nível de heterogeneidade dentro de sistemas biológicos que, de outra forma, seriam indiscerníveis por medições a granel 1,2,3. Essa diversidade celular pode ter consequências funcionais que podem favorecer a compreensão dos processos biológicos integrais, desde a resistência terapêutica das células cancerígenas 4,5,6 até a heterogeneidade célula-a-célula no diabetes 7,8,9,10. Muitas investigações se concentraram na medição de ácidos nucleicos em células individuais, medindo níveis genéticos ou transcriptômicos e permitiram a classificação de tipos e estados celulares. Tal progresso no espaço do ácido nucleico, no entanto, não pode preencher a lacuna de conhecimento da regulação pós-transcricional11, impulsionando a necessidade de medições de proteínas de alto rendimento semelhante em células individuais12,13,14,15.

Desenvolvemos o SCoPE216,17 para atender à demanda por proteômica unicelular rigorosa e robusta de sistemas de mamíferos. É um método multiplexado, permitindo o aumento da produtividade por meio da marcação e análise de muitas células em paralelo18, em contraste com os mthods livres de rótulo que analisam uma célula no momento19,20. A metodologia de preparação da amostra, a abordagem de espectrometria de massa e as etapas subsequentes de análise de dados permitem a quantificação precisa de centenas a milhares de proteínas por célula única. Este método torna possível a análise por espectrometria de massa de células individuais através do transportador isobárico21, uma pequena amostra a granel de células (geralmente 25-200) que é biologicamente semelhante à população de célula única de interesse. Este material transportador é multiplexado em um conjunto com um canal de referência do mesmo material e células individuais através do uso de tags de massa em tandem (etiquetas TMT). O canal transportador reduz a perda de amostra para áreas de superfície e fornece os fragmentos da espinha dorsal do íon para a identificação bem-sucedida do peptídeo. O canal de referência, que é preparado a granel e posteriormente diluído em 5-10 equivalentes celulares para cada conjunto de células únicas, ajuda a controlar a variabilidade técnica na análise. Especificamente, a referência permite a normalização da variabilidade causada por efeitos relacionados ao LC-MS/MS, como amostragem de íons e eficiências de ionização. Normalmente, a referência e os canais portadores são feitos a partir da mesma população celular.

Este protocolo de preparação de amostra é um método de segunda geração baseado no SCoPE-MS22 por meio de múltiplas melhorias sinérgicas. As melhorias incluem um método de lise celular que evita a limpeza da amostra, que é uma etapa comum das preparações proteômicas da EM. Utiliza mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)23, que é um método de lise por calor de congelamento. Este método permitiu a lise de células individuais em volumes menores e em placas de vários poços, em vez de em frascos, facilitando uma maior taxa de rendimento e automação por termocicladores. Em conjunto, esse método reduziu o custo por célula única e aumentou a acurácia quantitativa em relação ao SCoPE-MS 16,24.

Este protocolo descreve como preparar células individuais para análise proteômica, incluindo como preparar o transportador e os canais de referência usando rótulos isobáricos TMTpro 18-plex. As células de mamíferos que estão em suspensão unicelular e que podem ser isoladas em placas de 384 poços provavelmente são passíveis desse protocolo. Também estão incluídos resultados representativos de conjuntos de célula única bem-sucedidos, exibindo vários gráficos de controle de qualidade gerados por um aplicativo R Shiny, o DO-MS25. Outras ferramentas de software publicadas 26,27 e diretrizes experimentais 17,21 melhoraram a adoção desse protocolo. Esperamos que este guia visual ajude ainda mais os pesquisadores a realizar experimentos de proteômica de célula única.

Protocol

NOTA: Neste protocolo, a temperatura ambiente (RT) é de 18-22 °C.

1. Geração de material de transporte e de referência

  1. Isolamento celular
    1. Colete células de interesse em suspensões celulares em PBS gelado 1x.
      NOTA: Se possível, o transportador e o material de referência devem ser preparados a partir da(s) população(ões) celular(is) escolhida(s) para serem estudadas a nível de célula única. Números semelhantes de células das diferentes condições experimentais (como células imunes estimuladas e não estimuladas) devem constituir o portador e a referência. Em situações em que um número suficientemente grande dessas células não possa ser colhido, uma população celular adequada deve ser selecionada com base na semelhança biológica.
    2. Usando um hemocitômetro ou outros meios de contagem de células (como FACS), conte o número de células na suspensão.
    3. Gire e ressuscite 22.000 células de cada tipo de célula em 11 μL de água de grau HPLC, separadamente em tubos de PCR (tubos de PCR padrão de 250 μL).
      NOTA: O número de células aconselhadas aqui são suficientes para os portadores e referências para o número de conjuntos que podem ser preparados a partir de uma placa de 384 poços cheia de células únicas. A entrada de célula nesta etapa e as quantidades de reagente nas etapas subsequentes podem ser dimensionadas proporcionalmente para um número maior de conjuntos. A velocidade de rotação depende das práticas de cultura de células do laboratório. Um giro típico para baixo: 300 × g por 5 min.
    4. Transferir as amostras para um congelador a -80 °C durante, pelo menos, 30 minutos.
      PONTO DE PAUSA: As amostras podem permanecer congeladas por vários meses sem consequências para os dados de célula única.
  2. Lise celular
    1. Aqueça o tubo de PCR com as células a 90 °C durante 10 minutos (com a tampa do termociclador ajustada a 105 °C) e, em seguida, deixe os tubos arrefecerem a 12 °C logo após o ciclo de aquecimento.
    2. Vórtice o tubo brevemente e, em seguida, gire para baixo em um spinner de tubo de PCR de bancada no RT para coletar todo o líquido na parte inferior do tubo.
    3. Em um sonicator de banho de água, sonicate os tubos por 5 min, em seguida, colocá-los no gelo em RT.
  3. Digestão de tripsina
    1. Adicionar 2,2 μL da mistura principal (ver quadro 1 para os componentes) a cada tubo de amostra no gelo.
      CUIDADO: A tripsina pode causar irritação da pele, respiratória e ocular. Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual. Manuseio sob um exaustor químico.
    2. Vórtice os tubos brevemente para misturar e girar para baixo em um spinner de tubo de PCR de bancada em RT para coletar todo o líquido no fundo de cada tubo.
    3. Aquecer as amostras a 37 °C durante 3 h (com a tampa do termociclador regulada a 52 °C).
  4. Reação de marcação TMT
    1. Gire as amostras após a digestão em um spinner de tubo de PCR de bancada em RT.
    2. Divida cada amostra em dois volumes iguais de 6,6 μL cada, de modo que cada tubo contenha 11.000 células.
    3. Aos tubos destinados ao transportador, adicione 3,3 μL de TMT label 126 que foi ressuspenso a uma concentração de 85 mM.
    4. Aos tubos destinados à referência, adicionar 3,3 μL de TMT label 127N que foi ressuspenso a uma concentração de 85 mM.
    5. Vórtice os tubos brevemente e gire para baixo em um spinner de tubo de PCR de bancada no RT para coletar o líquido na parte inferior.
    6. Deixe os tubos em RT por 1 h.
  5. Têmpera da reação de marcação de TMT
    1. Adicionar 1,65 μL de hidroxilamina a 0,5% a cada tubo.
      CUIDADO: A hidroxilamina pode causar irritação da pele. Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual.
    2. Vórtice os tubos brevemente e gire para baixo em um spinner de tubo de PCR de bancada no RT para coletar o líquido na parte inferior.
    3. Deixe os tubos em RT por 30 min.
  6. Combinação de transportador e referência
    1. Se as amostras que constituirão o transportador tiverem sido rotuladas separadamente, misture-as em proporções iguais.
    2. Se as amostras que constituirão a referência tiverem sido rotuladas separadamente, misture-as em proporções iguais.
    3. Misture o transportador e a referência de modo que a concentração final do transportador seja de 100-200 células/μL e a concentração de referência seja de 5-10 células/μL.
    4. Avalie a qualidade do transportador e dos materiais de referência antes de combiná-los com conjuntos de células únicas.
      NOTA: O controle de qualidade do transportador e do material de referência pode ser realizado por uma variedade de métodos, mas recomenda-se o uso do software DO-MS, disponível emdo-ms.slavovlab.net 17. As medições críticas de qualidade incluem a taxa de declivagem (<25%, uma métrica calculada como o número de peptídeos identificados com confiança com uma clivagem perdida dividida pelo número de peptídeos identificados com confiança no total) e a eficiência de rotulagem (>99%, uma métrica calculada como o número de locais de marcação, ou seja, o peptídeo N-terminal e lisina, com um rótulo dividido pelo número total de locais de rotulagem).
      PONTO DE PAUSA: O suporte e os materiais de referência podem ser armazenados a -80 °C até que seja necessário.
Componente Concentração de mistura Concentração final por tubo
Tripsina Ouro 50 ng/μL 8,33 ng/μL
TEAB, pH = 8,5 500 mM 83.33 mM
Benzonase nuclease 1,2 unidades 0,2 unidades

Tabela 1: Quantidade de reagentes do master mix. As concentrações finais de reagentes necessários para a digestão da tripsina são listadas.

2. Preparação da amostra SCoPE2

  1. Isolamento celular
    1. Complemente a água de grau HPLC com 25 fmol por peptídeo por μL de uma solução peptídica sintética.
      NOTA: A solução peptídica Waters MassPrep é um exemplo do que pode ser usado. É composto por sete peptídeos que não ionizam muito bem. Este é um aspecto fundamental desta solução: esses peptídeos não interferem na quantificação precisa da espectrometria de massa de células individuais. Qualquer mistura altamente purificada de alguns peptídeos que provavelmente não esteja nas amostras de interesse será apropriada.
    2. Adicione 1 μL desta mistura a cada poço de uma placa de 384 poços usando um robô de dosagem de líquidos ou pipeta manual.
    3. Sele a placa e gire-a para baixo em um girador de placa de bancada em RT para coletar o líquido na parte inferior.
      PONTO DE PAUSA: As placas com esta solução podem ser armazenadas a -80 °C até que seja necessário.
    4. Obtenha uma suspensão de células não fixas que são desagregadas.
      NOTA: Como exatamente a suspensão celular é obtida é baseada no tipo de célula de interesse. Aqui estão exemplos gerais:
      1. Células em suspensão: gire as células para baixo em um pellet e remova o meio de cultura celular.
      2. Células aderentes: retire as células do prato ou frasco através de tripsinização ou raspagem. Em seguida, gire-os para baixo para remover o meio de cultura celular.
    5. Lave a suspensão celular duas vezes com 1x PBS gelado. Deixe as células suspensas em 1x PBS após a segunda lavagem.
    6. Se a placa de 384 poços foi congelada, descongele-a em RT. Gire para baixo para garantir que todo o líquido esteja no fundo dos poços.
    7. Use um classificador de células ou outros meios disponíveis, como a escolha manual a dedo, para distribuir células individuais nos respectivos poços.
      NOTA: Adicione células individuais aos poços, deixando alguns poços vazios para controles negativos e positivos (ver discussão). Ao usar a citometria de fluxo, use a menor taxa de fluxo possível para o citômetro de fluxo. Acredita-se que a taxa de fluxo mais baixa seja mais suave para o manuseio celular. Além disso, o tamanho do bico deve ser apropriado para uso com as células de interesse. Recomenda-se colaborar com uma instalação de citometria de fluxo.
    8. Adicione controles positivos de 2-5 células equivalentes lisado a poços selecionados pipetados manualmente ou com robôs de manuseio de líquidos.
    9. Selar e girar a placa com células separadas em um girador de placa de bancada no RT para coletar o líquido na parte inferior. Congelar a placa a -80 °C o mais rapidamente possível.
      PONTO DE PAUSA: As placas com células únicas classificadas podem ser armazenadas a -80 °C até que seja necessário.
  2. Lise celular
    1. Pegue a placa de 384 poços com as células únicas classificadas e coloque-a no termociclador o mais rápido possível.
    2. Aqueça a placa a 90 °C durante 10 minutos (com a temperatura da tampa ajustada para 105 °C) e, em seguida, deixe a placa arrefecer a 12 °C.
    3. Gire a placa brevemente em um girador de placa de bancada no RT.
    4. Em um sonicator de banho de água, sonicate a placa por 5 min em RT, em seguida, colocá-lo no gelo.
  3. Digestão de tripsina
    1. Preparar 100 μL da mistura principal (ver Tabela 1 para componentes) por placa de 384 poços.
    2. A cada alvéolo da placa de 384 alvéolos, adicionar 0,2 μL da mistura principal preparada na fase 2.3.1 utilizando um manipulador de líquidos.
      NOTA: Use volumes maiores se a pipetagem manual for usada, certificando-se de que as concentrações finais de reagentes ainda sejam as mesmas por poço.
    3. Sele a placa, vórtice por 5 s e gire para baixo em um girador de placa de bancada no RT.
    4. Aqueça a placa de 384 poços a 37 °C (com a temperatura da tampa ajustada para 52 °C) por 3 h.
  4. Reação de marcação TMT
    1. Retire as existências de 85 mM de etiquetas TMT (128N a 135N) do congelador de -80 °C. Aqueça os tubos à temperatura ambiente antes de abri-los.
    2. Diluir os rótulos a 22 mM em acetonitrila anidra.
      CUIDADO: A acetonitrila é um líquido inflamável. Pode irritar a pele, os olhos, o trato respiratório e o sistema nervoso central. Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual. Manuseio sob um exaustor químico.
    3. Usando esta estratégia de rotulagem, adicione 0,5 μL de etiquetas TMT diluídas a cada poço da placa de 384 poços. Use um robô de dosagem de líquidos (se estiver usando um manipulador de líquidos, certifique-se de usar o equipamento associado que seja adequado para solventes orgânicos) ou uma pipeta manual.
      NOTA: Consulte a Tabela 2 para a estratégia de rotulagem. Consulte a Tabela 3 para obter um exemplo de layout de placa.
    4. Sele a placa, vórtice por 5 s e gire para baixo em um girador de placa de bancada no RT.
    5. Deixe a reação de rotulagem prosseguir no RT por 1 h.
  5. Têmpera da reação de marcação de TMT
    1. A cada poço da placa de 384 poços, adicione 0,2 μL de hidroxilamina a 0,5% (diluída em água de grau HPLC) usando um manipulador de líquidos.
      NOTA: Use volumes maiores se a pipetagem manual for usada, certificando-se de que as concentrações finais de reagentes ainda sejam as mesmas por poço.
    2. Sele a placa, vórtice por 5 s e gire para baixo em um girador de placa de bancada no RT.
    3. Mantenha a placa em RT por 30 min.
  6. Preparação para análise LC-MS/MS: combinação de células únicas e poços de controle com material transportador/de referência
    1. Remova o transportador combinado/material de referência do congelador a -80 °C.
    2. Para cada conjunto, pipetar 1 μL de suporte e material de referência para o primeiro poço que fará parte de um único conjunto. Pipetar o volume completo do primeiro poço para o poço subsequente. Continue pipetando o volume completo de uma célula para a próxima até que todos os poços a serem incluídos em um único conjunto tenham sido combinados no poço final.
      NOTA: O transportador e o material de referência devem estar a uma concentração de equivalentes de 200 e 5 células, respectivamente, mas, como discutido anteriormente21, essas quantidades podem variar. Cada conjunto, conforme descrito na estratégia de rotulagem (ver Tabela 2), deve conter portador, referência e até 12 ou 14 amostras de célula única ou de controle ao usar TMTpro-16plex ou TMTpro-18plex, respectivamente (ver etapa 2.4.3).
    3. Para cada conjunto, adicionar 5 μL de acetonitrila a 50% (diluído em água de grau HPLC) ao primeiro poço de célula única a ser incluído em cada conjunto. Pipete o volume completo do primeiro poço para o poço subsequente. Continue pipetando o volume completo de uma célula para a próxima até que todos os poços a serem incluídos em um único conjunto tenham sido combinados no poço final.
      NOTA: Esta etapa de lavagem pode ajudar na recuperação de amostras dos poços.
    4. Transfira cada conjunto para suas inserções de vidro de amostrador automático individuais.
      NOTA: Estes conjuntos também podem ser combinados em poços únicos de uma placa de 384 poços e colocados diretamente no amostrador automático para injeção28.
    5. Uma vez que todos os conjuntos são combinados e colocados em inserções de vidro, seque as amostras.
      PONTO DE PAUSA: Os conjuntos secos podem ser armazenados a -80 °C durante pelo menos 1 semana antes de funcionarem num espectrómetro de massas.
    6. Antes da análise LC-MS/MS, adicione 1,2 μL de ácido fórmico a 0,1% (diluído em água de grau HPLC) a cada conjunto para ressuspender os peptídeos marcados.
      CUIDADO: O ácido fórmico é um líquido inflamável. Pode causar sérios danos oculares ou queimaduras na pele. Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual. Punho em uma área bem ventilada.
    7. Coloque as inserções do amostrador automático nos frascos para injetáveis do amostrador automático de vidro e feche cada amostra com uma tampa.
    8. Vórtice cada frasco para injetáveis durante 5 s para se certificar de que a ressuspensão está completa e, em seguida, gire para baixo num frasco para injetáveis girador em RT.
    9. Certifique-se de que cada amostra esteja na parte inferior da inserção, em vez de espirrada nas laterais.
    10. Coloque os frascos para injetáveis no tabuleiro do amostrador automático.
    11. Para cada conjunto, injete 1 μL para análise LC-MS/MS.
Etiqueta 126 127N 127º C 128N 128°C 129N 129°C 130N 130°C .... 135N
Tipo de amostra Portador Referência Vazio Vazio SC/Controle SC/Controle SC/Controle SC/Controle SC/Controle .... SC/Controle

Tabela 2: Exemplo de esquema de rotulagem SCoPE2 TMTpro-18plex. O transportador e a referência são geralmente rotulados nos dois primeiros rótulos TMT. Em seguida, os próximos dois rótulos são ignorados devido à potencial contaminação isotópica que tornaria a quantificação menos precisa. Os outros rótulos restantes são para células individuais ou controles.

128°C 129N 129°C 130N 130°C 131N 131º C 132N 132º C 133N 133º C 134N 128°C 129N 129°C 130N 130°C 131N 131º C 132N 132º C 133N 133º C 134N
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Um SC SC - SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC + SC SC SC
B SC + SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC +
C SC - SC - SC SC SC + SC - SC SC SC SC + SC - SC SC SC SC SC SC -
D SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC + SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
E SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC - SC SC
F SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC + SC SC SC + SC SC SC + SC SC
G SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC
H SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC SC SC SC
Eu SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
J - SC + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC
K SC SC SC SC - SC SC SC SC - SC SC + SC - - SC SC SC SC SC SC SC SC
L SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC
M SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC SC
N + SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
O SC SC SC SC + SC SC SC SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC
P SC SC - SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC SC + SC SC SC - SC

Tabela 3: Exemplo de layout de placa para rotulagem usando TMTpro-16plex. Usando um formato de placa de 384 poços (ou qualquer outro formato de placa), é importante randomizar os poços nos quais as células são classificadas. Um layout de placa diferente será usado para o TMTpro-18plex.

Representative Results

Os resultados positivos do protocolo implicam a verificação de que uma série de etapas críticas do protocolo foram executadas com sucesso; estes incluem a preparação do portador, isolamento de célula única, lise, digestão, rotulagem de código de barras e otimização de parâmetros MS. Os gráficos DO-MS permitem a fácil avaliação da conclusão de cada etapa crítica do protocolo. Um transportador preparado com sucesso, que geralmente corresponde a 25 e 200 células em quantidade (por conjunto), é bem digerido e bem rotulado. Gráficos de DO-MS permitem quantificar a intensidade da amostra (para estimar a quantidade), a eficiência da digestão (idealmente <25% de decotes) e a eficiência de rotulagem (deve ser >99%). Mais criticamente, amostras portadoras que não estão completamente marcadas podem permitir a reação cruzada com os códigos de barras destinados a células individuais e adicionar um sinal espúrio à quantificação de peptídeos de célula única.

Os poços de controle negativo incluem todos os reagentes experimentais, mas não possuem uma célula. Isso permite que não apenas o ruído de fundo seja avaliado, mas também que a eficiência do isolamento celular seja determinada, fornecendo um sinal representativo de um poço vazio. O relatório DO-MS oferece gráficos para avaliar o sinal medido do poço de controle ao lado dos poços de célula única para determinar o sucesso do isolamento celular e do ruído de fundo. Além disso, a qualidade da quantificação pode ser avaliada usando o pipeline SCoPE2 (disponível no GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) ou o pacote SCP Bioconductor29.

A eficiência de digestão e rotulagem das células individuais pode não ser diretamente ensaiada como com o transportador, mas o DO-MS novamente fornece gráficos que permitem a estimativa da eficiência de digestão e rotulagem. Ao incluir um controle de 100-200 células ao lado da preparação das células individuais (ou seja, recebendo todas as mesmas adições de reagentes), as eficiências de digestão e rotulagem podem ser avaliadas para esse controle e assumidas como compartilhadas pelas células únicas preparadas ao lado. A má digestão será indicada por uma alta proporção da intensidade dos peptídeos misciviados para suas contrapartes completamente clivadas (Figura 1).

Outro fator a ser considerado nos conjuntos é a fração de dados faltantes e a mediana da intensidade de íons repórteres em cada canal TMT (Figura 2). Quando células individuais são preparadas com sucesso, a quantidade de dados faltantes por célula e controle positivo é muito menor do que em amostras de controle negativas. Da mesma forma, a intensidade mediana dos precursores é muito maior em células individuais e controles positivos do que em controles negativos. A otimização dos parâmetros da EM tem sido amplamente discutida em outros lugares21, e os parâmetros ótimos podem ser determinados usando ferramentas como DO-MS ou SCP Companion25,27.

Figure 1
Figura 1: Controle de qualidade da preparação do transportador. Gráficos de DO-MS que descrevem (A) a eficiência de marcação de um transportador preparado com sucesso em locais de rotulagem com TMT: a amina primária na cadeia lateral da lisina e do peptídeo N-terminal, e (B) a eficiência da digestão em resíduos de aminoácidos da clivagem tríptica. Abreviação: TMT = tag de massa tandem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Controle de qualidade da preparação de célula única. Gráficos de OD-MS que descrevem (A) a fração de dados ausentes em células individuais (C5-10), controles (C13,16), transportador (C1) e referência (C2) e (B) a intensidade de células individuais e controles. As tags 127C, 128N, 131C, 132N, 133N e 133C, que correspondem a C3, C4, C11, C12 e C15, não são usadas neste conjunto específico. O controle positivo consiste em material celular processado em peptídeos a granel, depois diluído a um nível de 2-5 células/μL antes da marcação. O controle negativo consiste em um poço submetido a todas as etapas preparatórias utilizadas para células únicas, apenas sem a adição de uma única célula. Abreviação: TMT = tag de massa tandem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Uma das chaves para o sucesso da preparação e análise de células individuais pelo SCoPE2 é a preparação do transportador e dos canais de referência. O tamanho do portador sugerido é de 100 a 200 células; no entanto, o número de células necessárias para um experimento unicelular específico pode ser determinado com base em princípios discutidos em outro lugar21. Para o tamanho sugerido, pelo menos ~ 11.275 células são necessárias por placa de 384 poços, permitindo um transportador de 200 células e uma referência de 5 células em cada conjunto. Pode ser vantajoso isolar mais células se as populações celulares desejadas não forem um fator limitante, para simplesmente ter material extra em caso de erros (como foi feito neste protocolo, isolando 22.000 células em vez de 11.275 células). A quantidade de transportador e a referência necessárias para o número de placas desejadas devem ser preparadas em um único lote para minimizar qualquer variação de lote para lote que possa fazer com que a identificação ou quantificação de peptídeos seja diferente entre os lotes.

Antes de isolar células individuais em poços de uma placa de 384 poços, é importante considerar o design do layout da placa. Dentro de cada placa de 384 poços, recomenda-se a implementação de controles positivos e negativos. Controles negativos são poços nos quais nenhuma célula é adicionada, mas passam pelas mesmas adições e procedimentos de reagentes que os poços de célula única. Controles positivos são poços nos quais o lisado celular diluído em 2-5 células/μL é adicionado em vez de células únicas. Isso é particularmente importante de implementar quando os métodos de isolamento de célula única não são bem validados. Idealmente, cada placa de 384 poços deve ter uma distribuição aleatória de células e controles únicos (por exemplo, não ter controles negativos ou positivos em apenas uma linha). Cada placa deve ter uma distribuição igual de todas as populações celulares de interesse, em vez de isolar um tipo de célula em uma placa e um segundo tipo de célula em uma segunda placa. Isso evitará vincular os efeitos de lote com tipos de células de interesse. Além disso, se mais de uma placa de 384 poços for necessária para análise, é aconselhável isolar as células em uma única sessão, em vez de espalhar a etapa de isolamento por vários dias, se possível.

A lise de células individuais e de carreador/referência ocorre em água através de um ciclo de congelamento-calor23. Prevê-se que a maioria das proteases tenha sido desnaturada durante esta etapa. A tripsina é então adicionada imediatamente após a etapa de desnaturação em uma alta concentração, muitas ordens de magnitude maiores em concentração do que até mesmo as proteases celulares mais abundantes. Por ação de massa, a maioria dos produtos da atividade da protease será devida à tripsina.

A redução/alquilação dos resíduos de cisteína não é realizada neste protocolo antes da digestão da tripsina. Os peptídeos contendo cisteína representam cerca de 10% dos peptídeos trípticos do proteoma humano. Observamos menos peptídeos contendo cisteína usando uma abordagem sem redução/alquilação. Essas etapas usam reagentes que são incompatíveis com a rotulagem por TMT (química do éster NHS) imediatamente após a digestão.

Nesta estratégia de rotulagem TMT, o transportador e as referências são rotulados com 126 e 127N, respectivamente, enquanto os poços de célula única e de controle são rotulados com 128C a 135N. Os dois rótulos após a referência, 127C e 128N, não são utilizados devido à contaminação cruzada isotópica decorrente dos canais transportadores e de referência, que são claramente muito mais abundantes em material peptídico do que as células individuais. No total, existem 12 canais TMT por conjunto que podem ser usados para rotular células únicas ou poços de controle com TMTpro-16plex, ou 14 canais TMT por conjunto com TMTpro-18plex.

As etapas críticas no protocolo para realizar medições proteômicas de célula única usando este protocolo incluem a preparação do portador, isolamento de célula única, lise, digestão, marcação de código de barras e parâmetros adequados de espectrometria de massa. Essas etapas foram descritas neste documento e extensamente detalhadas em outros lugares 17,21,25. Cada etapa tem um gráfico correspondente ou conjunto de gráficos em DO-MS que permitem fácil controle de qualidade. Por exemplo, no caso de criação bem-sucedida do transportador, gráficos que descrevem o número de peptídeos identificados, a eficiência de rotulagem e a porcentagem de taxa de decolagem permitem a verificação de sua preparação bem-sucedida. Relatórios representativos de DO-MS estão incluídos nesta publicação e podem ser vistos em http://scope2.slavovlab.net/ para os dados originais16. Esses relatórios de DO-MS permitem avaliar a otimização do método em direções ainda não investigadas pelos autores, como gradientes de LC mais longos, diferentes enzimas de digestão ou códigos de barras químicos alternativos.

Atualmente, a análise seriada de peptídeos por algoritmos de aquisição dependentes de dados limita o número de peptídeos que podem ser analisados em uma execução de LC de um comprimento razoável. Isso se deve, em parte, aos tempos de enchimento mais longos necessários para a aquisição bem-sucedida de íons suficientes para quantificação confiável de célula única21. Uma limitação inerente ao uso do transportador é a falta de avaliação direta da digestão e da eficiência de rotulagem das células individuais. Atualmente, uma solução para essa limitação é realizar o controle de qualidade em uma amostra maior processada ao lado das células individuais.

Propusemos uma série de oportunidades para melhorar a proteômica de célula única, como a construção de espectrômetros de massa com vários analisadores. O método atual permite a quantificação de milhares de proteínas de células de mamíferos individuais a uma velocidade de aproximadamente 100 células por dia com reagentes e equipamentos comercialmente disponíveis. SCoPE2, a segunda geração da abordagem SCoPE-MS, melhorou significativamente em relação ao seu antecessor no que diz respeito ao número de células analisáveis por unidade de tempo, o número de proteínas analisáveis por unidade de tempo, o tempo necessário para a preparação da amostra, a acessibilidade de reagentes e equipamentos e o custo total de preparação e análise por única célula. As proteínas ligadas à membrana são acessíveis por meio da lise por calor de congelamento e digestão de protease, como demonstrado em comparação com a lise da ureia23. O método identifica muitas proteínas do terço superior do proteoma em relação à abundância16. Se o proteoforme modificado estiver no terço superior do proteoma, e o peptídeo modificado for passível de análise de espectrometria de massa (ioniza bem, tem uma diferença de massa do peptídeo não modificado), é mais provável que seja passível desse protocolo. Esse método pode ser aplicado de forma frutífera em sistemas biológicos em que há heterogeneidade significativa entre as células, como na diferenciação, senescência ou respostas imunológicas (ou seja, fagocitose).

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer o prêmio do Programa I-Corps da NSF do outono de 2021 (site da Northeastern University) que financiou esta publicação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plate, standard PCR plate Thermo Fisher Scientific AB1384 Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific A955-1 This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 271004-100ML This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils Thermo Fisher Scientific AB0626
Autosampler vial screw thread caps Thermo Fisher Scientific C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) MTC Bio C2595 This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease Sigma Aldrich E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm Thermo Fisher Scientific 60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade Thermo Fisher Scientific 85178 Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm Thermo Fisher Scientific C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol Sigma Aldrich 467804-50ML Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips Formulatrix MCLVPR2 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips Formulatrix MCLVS12 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler Formulatrix Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling Formulatrix 232400
MassPREP peptide mixture Waters 186002337 Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) USA Scientific 2621-0016 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips USA Scientific 1402-3900 If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free Thermo Fisher Scientific AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) Benchmark Scientific Model C2000 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) Biorad 1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg Thermo Fisher Scientific A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 Sigma Aldrich T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade Promega V5280 This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results.

Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer) VWR Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) VWR 97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific W6-1 All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .

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References

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Biologia Edição 190
Preparação de Proteômica de Célula Única para Análise de Espectrometria de Massa usando Lise de Calor Congelante e um Transportador Isobárico
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