Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Подготовка одноклеточной протеомики к масс-спектрометрическому анализу с использованием лизиса Freeze-Heat и изобарического носителя

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802
Automatic Translation
*1, 1,2,3, *1
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University
* These authors contributed equally

Summary

В этом протоколе мы описываем, как подготовить клетки млекопитающих к одноклеточному протеомическому анализу с помощью масс-спектрометрии с использованием коммерчески доступных реагентов и оборудования с опциями как ручного, так и автоматического пипетирования.

Abstract

Анализ одноклеточной протеомики требует чувствительных, количественно точных, широко доступных и надежных методов. Для удовлетворения этих требований был разработан протокол Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) в качестве метода количественной оценки от сотен до тысяч белков из ограниченных образцов до уровня одной клетки. Эксперименты с использованием этого метода достигли количественной оценки более 3000 белков в 1 500 одиночных клетках млекопитающих (500-1000 белков на клетку) за 10 дней измерения масс-спектрометра. SCoPE2 использует цикл замораживания-нагрева для лизиса клеток, устраняя необходимость очистки отдельных ячеек и, следовательно, снижая потери образца, одновременно ускоряя подготовку образца и упрощая его автоматизацию. Кроме того, в методе используется изобарический носитель, который помогает идентификации белка и снижает потери образцов.

Этот видеопротокол предоставляет подробное руководство, позволяющее принять автоматизированный анализ одноклеточных белков с использованием только оборудования и реагентов, которые широко доступны. Мы демонстрируем критические этапы в процедуре подготовки отдельных клеток к протеомному анализу, от сбора до инъекций и анализа жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Кроме того, зрители ориентируются на принципы экспериментального проектирования с изобарическим носителем, контроль качества как изобарических носителей, так и одноклеточных препаратов, а также репрезентативные результаты с обсуждением ограничений подхода.

Introduction

Одноклеточный анализ широко используется для изучения уровня гетерогенности в биологических системах, который в противном случае был бы неразличим по объемным измерениям 1,2,3. Такое клеточное разнообразие может иметь функциональные последствия, которые могут способствовать пониманию интегральных биологических процессов, от терапевтической резистентности раковых клеток 4,5,6 до межклеточной гетерогенности при диабете 7,8,9,10. Многие исследования были сосредоточены на измерении нуклеиновых кислот в отдельных клетках путем измерения генетических или транскриптомных уровней и позволили классифицировать типы клеток и состояния. Однако такой прогресс в пространстве нуклеиновых кислот не может заполнить пробел в знаниях посттранскрипционной регуляции11, что обуславливает необходимость аналогичных высокопроизводительных измерений белка в отдельных клетках 12,13,14,15.

Мы разработали SCoPE216,17 для удовлетворения спроса на строгую и надежную одноклеточную протеомику систем млекопитающих. Это мультиплексированный метод, позволяющий увеличить пропускную способность путем маркировки и анализа многих ячеек параллельно18, в отличие от mthods без меток, которые анализируют одну ячейку в моментвремени 19,20. Методология подготовки образцов, подход масс-спектрометрии и последующие этапы анализа данных позволяют точно количественно оценить от сотен до тысяч белков на одну клетку. Этот метод делает возможным масс-спектрометрический анализ отдельных клеток через изобарический носитель21, небольшой объемный образец клеток (обычно 25-200), который биологически похож на интересующую одноклеточную популяцию. Этот материал-носитель мультиплексируется в набор с опорным каналом из того же материала и одиночных ячеек с помощью тандемных масс-меток (меток ТМТ). Канал-носитель уменьшает потери образца на поверхности и обеспечивает фрагменты ионной основы для успешной идентификации пептидов. Эталонный канал, который готовится навалом и впоследствии разбавляется до 5-10 клеточных эквивалентов для каждого одноэлементного набора, помогает контролировать техническую изменчивость в анализе. В частности, эталон позволяет нормализовать изменчивость, вызванную эффектами, связанными с LC-MS/MS, такими как отбор ионов и эффективность ионизации. Обычно эталонный и несущий каналы производятся из одной и той же клеточной популяции.

Этот протокол пробоподготовки представляет собой метод второго поколения, основанный на SCoPE-MS22 путем многочисленных синергетических улучшений. Улучшения включают метод лизиса клеток, который позволяет избежать очистки образца, что является распространенным этапом препаратов протеомики MS. Он использует mPOP (минимальная протеомическая подготовка образца)23, которая представляет собой метод лизиса с замораживанием тепла. Этот метод позволил лизировать отдельные ячейки в меньших объемах и в многоскважинных пластинах, а не во флаконах, что способствовало более высокой пропускной способности и автоматизации тепловыми циклодерами. В целом, этот метод снизил стоимость одной ячейки и повысил количественную точность по сравнению с SCoPE-MS16,24.

Этот протокол описывает, как подготовить отдельные клетки для протеомного анализа, в том числе как подготовить носитель и эталонные каналы с использованием 18-плексных изобарических меток TMTpro. Клетки млекопитающих, которые находятся в одноклеточной суспензии и которые могут быть выделены в 384-луночные пластины, вероятно, поддаются этому протоколу. Также включены репрезентативные результаты успешных одноклеточных наборов, отображающих несколько графиков контроля качества, сгенерированных приложением R Shiny, DO-MS25. Другие опубликованные программные средства 26,27 и экспериментальные руководящие принципы17,21 улучшили принятие этого протокола. Мы надеемся, что это визуальное руководство в дальнейшем поможет исследователям проводить эксперименты по одноклеточной протеомике.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе комнатная температура (RT) составляет 18-22 °C.

1. Генерация носителей и справочных материалов

  1. Изоляция клеток
    1. Соберите интересующие клетки в клеточные суспензии в ледяном 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, носитель и справочный материал должны быть подготовлены из клеточной популяции (клеточных популяций), выбранной для изучения на одноклеточном уровне. Одинаковое количество клеток из различных экспериментальных условий (таких как стимулированные и нестимулированные иммунные клетки) должно составлять носитель и референт. В ситуациях, когда достаточно большое количество этих клеток не может быть собрано, подходящая клеточная популяция должна быть выбрана на основе биологического сходства.
    2. Используя гемоцитометр или другие средства подсчета клеток (например, FACS), подсчитайте количество клеток в суспензии.
    3. Открутите и повторно суспендируйте 22 000 клеток каждого типа клеток в 11 мкл воды класса ВЭЖХ отдельно в трубки ПЦР (стандартные 250 мкл ПЦР-трубки).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое здесь количество ячеек достаточно для носителей и ссылок на количество наборов, которые могут быть получены из 384-луночной пластины, полной одиночных ячеек. Вход ячейки на этой стадии и количество реагента на последующих стадиях могут быть масштабированы пропорционально для большего числа наборов. Скорость вращения зависит от практики клеточной культуры в лаборатории. Типичный спин-даун: 300 × g в течение 5 мин.
    4. Переложите образцы в морозильную камеру при температуре -80 °C в течение не менее 30 мин.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Образцы могут оставаться замороженными в течение нескольких месяцев без каких-либо последствий для одноклеточных данных.
  2. Лизис клеток
    1. Нагрейте трубку ПЦР с ячейками до 90 °C в течение 10 минут (с крышкой термоциклера, установленной на 105 °C), а затем дайте трубкам остыть до 12 °C сразу после цикла нагрева.
    2. Кратковременно вращайте трубку, а затем вращайтесь вниз в спиннере для ПЦР-трубки в RT, чтобы собрать всю жидкость в нижней части трубки.
    3. В ультразвуковом аппарате для водяной бани продувки в течение 5 минут, затем поместите их на лед в RT.
  3. Переваривание трипсина
    1. Добавьте 2,2 мкл основной смеси (компоненты см. в таблице 1 ) в каждую пробку во время нахождения на льду.
      ВНИМАНИЕ: Трипсин может вызвать раздражение кожи, дыхательных путей и глаз. Обязательно носите средства индивидуальной защиты. Ручка под химическим вытяжным капотом.
    2. Вихрьте трубки ненадолго, чтобы смешать и вращать вниз в настольном спиннере для ПЦР-трубки в RT, чтобы собрать всю жидкость в нижней части каждой трубки.
    3. Нагревайте образцы при 37 °C в течение 3 ч (с крышкой термоциклера, установленной при 52 °C).
  4. Реакция маркировки ТМТ
    1. Открутите образцы после сбраживания в настольном спиннере для трубки ПЦР на RT.
    2. Разделите каждый образец на два равных объема по 6,6 мкл каждый, так что каждая пробирка содержит 11 000 клеток.
    3. К трубкам, предназначенным для носителя, добавляют 3,3 мкл метки 126 ТМТ, которая была повторно суспендирована в концентрации 85 мМ.
    4. К пробиркам, предназначенным для эталона, добавить 3,3 мкл метки TMT 127N, которая была повторно суспендирована в концентрации 85 мМ.
    5. Вращайте трубки ненадолго и вращайтесь вниз в настольном спиннере для ПЦР-трубки в RT, чтобы собрать жидкость внизу.
    6. Оставьте пробирки при РТ на 1 ч.
  5. Закалка реакции маркировки ТМТ
    1. Добавьте 1,65 мкл 0,5% гидроксиламина в каждую пробирку.
      ВНИМАНИЕ: Гидроксиламин может вызвать раздражение кожи. Обязательно носите средства индивидуальной защиты.
    2. Вращайте трубки ненадолго и вращайтесь вниз в настольном спиннере для ПЦР-трубки в RT, чтобы собрать жидкость внизу.
    3. Оставьте пробирки при РТ на 30 мин.
  6. Сочетание носителя и эталона
    1. Если образцы, которые будут составлять носитель, были отдельно маркированы, смешайте их в равных пропорциях.
    2. Если образцы, которые будут представлять собой ссылку, были отдельно маркированы, смешайте их в равных соотношениях.
    3. Смешайте носитель и эталон так, чтобы конечная концентрация носителя составляла 100-200 клеток/мкл, а эталонная концентрация составляла 5-10 клеток/мкл.
    4. Оцените качество носителя и эталонных материалов перед их объединением с одноэлементными наборами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль качества носителя и эталонного материала может осуществляться различными методами, но рекомендуется использовать программное обеспечение DO-MS, доступное по адресу do-ms.slavovlab.net17. Критические измерения качества включают скорость неправильного расщепления (<25%, метрика, рассчитанная как количество уверенно идентифицированных пептидов с пропущенным расщеплением, деленное на количество уверенно идентифицированных пептидов в целом) и эффективность маркировки (>99%, метрика, рассчитанная как количество сайтов маркировки, а именно пептид N-конец и лизин, с меткой, разделенной на общее количество сайтов маркировки).
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Носитель и эталонные материалы могут храниться при температуре -80 °C до тех пор, пока это не потребуется.
Компонент Концентрация смеси Конечная концентрация на пробирку
Трипсин Золото 50 нг/мкл 8,33 нг/мкл
TEAB, pH = 8,5 500 мМ 83.33 мМ
Бензоназа нуклеаза 1.2 единиц 0.2 единиц

Таблица 1: Количество реагентов мастер-микса. Перечислены конечные концентрации реагентов, необходимых для переваривания трипсина.

2. Пробоподготовка SCoPE2

  1. Изоляция клеток
    1. Дополнить воду класса ВЭЖХ 25 фмоль на пептид на мкл синтетического пептидного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор пептида Waters MassPrep является примером того, что можно использовать. Он состоит из семи пептидов, которые не очень хорошо ионизируются. Это ключевой аспект этого решения: эти пептиды не мешают точному масс-спектрометрическому количественному определению отдельных клеток. Любая высокоочищенная смесь нескольких пептидов, которая вряд ли будет в интересующих образцах, будет уместной.
    2. Добавьте 1 мкл этой смеси в каждую лунку пластины из 384 скважин с помощью жидкостно-дозирующего робота или ручной пипетки.
    3. Запечатайте пластину и открутите ее вниз в настольном пластинчатом спиннере в RT, чтобы собрать жидкость внизу.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Пластины с этим раствором можно хранить при -80 °C до тех пор, пока это не потребуется.
    4. Получите приостановку нефиксированных ячеек, которые дезагрегированы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как именно получается клеточная суспензия, зависит от типа интересующей клетки. Вот общие примеры:
      1. Клетки суспензии: раскрутите клетки в гранулу и удалите питательную среду клеток.
      2. Адгезивные клетки: удалите клетки из чашки или колбы путем трипсинизации или соскабливания. Затем раскрутите их вниз, чтобы удалить культуральную среду клеток.
    5. Дважды промыть клеточную суспензию 1x ледяным PBS. Оставьте клетки подвешенными в 1x PBS после второй промывки.
    6. Если плита из 384 скважин была заморожена, разморозьте ее на RT. Раскрутите ее вниз, чтобы убедиться, что вся жидкость находится на дне скважин.
    7. Используйте сортировщик ячеек или другие доступные средства, такие как ручной отбор, для распределения отдельных ячеек в соответствующих скважинах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте одиночные ячейки в скважины, оставив некоторые скважины пустыми для отрицательного и положительного контроля (см. обсуждение). При использовании проточной цитометрии используйте минимально возможный расход для проточного цитометра. Считается, что более низкий расход является более мягким для обработки ячеек. Кроме того, размер сопла должен быть подходящим для использования с интересующими ячейками. Рекомендуется сотрудничать с центром проточной цитометрии.
    8. Добавьте положительные элементы управления лизатом из 2-5 ячеек в выбранные скважины, дозированные вручную или с помощью роботов для обработки жидкостей.
    9. Запечатайте и открутите пластину с отсортированными ячейками в настольном пластинчатом спиннере в RT, чтобы собрать жидкость внизу. Заморозьте пластину при -80 °C как можно скорее.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Пластины с отсортированными одиночными ячейками можно хранить при -80 °C до тех пор, пока это не потребуется.
  2. Лизис клеток
    1. Возьмите 384-луночную пластину с отсортированными одиночными ячейками и поместите ее в термоциклер как можно быстрее.
    2. Нагрейте пластину до 90 °C в течение 10 минут (при установленной температуре крышки до 105 °C), а затем дайте пластине остыть до 12 °C.
    3. Немного покрутите пластину в настольном спиннере на RT.
    4. В ультразвуковом аппарате для водяной бани обработайте пластину ультразвуком в течение 5 минут на RT, затем поместите ее на лед.
  3. Переваривание трипсина
    1. Приготовьте 100 мкл основной смеси (компоненты см. в таблице 1 ) на 384-луночную пластину.
    2. К каждой скважине из 384-луночной пластины добавляют 0,2 мкл основной смеси, приготовленной на этапе 2.3.1 с использованием жидкостного обработчика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте большие объемы, если используется ручное пипетирование, убедившись, что конечные концентрации реагентов остаются неизменными на скважину.
    3. Запечатайте пластину, вихрь в течение 5 с и вращайтесь вниз в настольном пластинчатом спиннере на RT.
    4. Нагревайте 384-луночную пластину при 37 °C (с температурой крышки 52 °C) в течение 3 часов.
  4. Реакция маркировки ТМТ
    1. Извлеките запасы этикеток TMT объемом 85 мМ (от 128N до 135N) из морозильной камеры с температурой -80 °C. Прогрейте трубки до комнатной температуры, прежде чем открывать их.
    2. Развести этикетки до 22 мМ в безводном ацетонитриле.
      ВНИМАНИЕ: Ацетонитрил является легковоспламеняющейся жидкостью. Он может раздражать кожу, глаза, дыхательные пути и центральную нервную систему. Обязательно носите средства индивидуальной защиты. Ручка под химическим вытяжным капотом.
    3. Используя эту стратегию маркировки, добавьте 0,5 мкл разбавленных этикеток TMT в каждую скважину пластины из 384 скважин. Используйте либо робота для дозирования жидкости (если используется жидкостный погрузчик, обязательно используйте сопутствующее оборудование, подходящее для органических растворителей), либо ручную пипетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. таблицу 2 для стратегии маркировки. Пример компоновки пластин см. в таблице 3 .
    4. Запечатайте пластину, вихрь в течение 5 с и вращайтесь вниз в настольном пластинчатом спиннере на RT.
    5. Дайте реакции маркировки продолжаться при RT в течение 1 ч.
  5. Закалка реакции маркировки ТМТ
    1. К каждой скважине плиты из 384 скважин добавляют 0,2 мкл 0,5% гидроксиламина (разбавленного в воде класса ВЭЖХ) с помощью жидкостного обработчика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте большие объемы, если используется ручное пипетирование, убедившись, что конечные концентрации реагентов остаются неизменными на скважину.
    2. Запечатайте пластину, вихрь в течение 5 с и вращайтесь вниз в настольном пластинчатом спиннере на RT.
    3. Держите тарелку при RT в течение 30 минут.
  6. Подготовка к анализу LC-MS/MS: сочетание одиночных ячеек и контрольных скважин с носителем/эталонным материалом
    1. Извлеките комбинированный носитель/эталонный материал из морозильной камеры с температурой -80 °C.
    2. Для каждого набора пипетка 1 мкл носителя и эталонного материала в первую скважину, которая будет частью одного набора. Пипетка полного объема первой скважины до последующей скважины. Продолжайте пипетку всего объема от одной ячейки к другой до тех пор, пока все скважины, которые будут включены в один набор, не будут объединены в конечную скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель и эталонный материал должны находиться в концентрации 200- и 5-элементных эквивалентов, соответственно, но, как обсуждалось ранее21, эти количества могут варьироваться. Каждый набор, как указано в стратегии маркировки (см. таблицу 2), должен содержать носитель, эталон и до 12 или 14 одноэлементных или контрольных образцов при использовании TMTpro-16plex или TMTpro-18plex, соответственно (см. шаг 2.4.3).
    3. Для каждого набора добавьте 5 мкл 50% ацетонитрила (разбавленного в воде класса ВЭЖХ) в первую одноклеточную скважину, которая будет включена в каждый набор. Пипетка полного объема от первой скважины до последующей скважины. Продолжайте пипетку всего объема от одной ячейки к другой до тех пор, пока все скважины, которые будут включены в один набор, не будут объединены в конечную скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап промывки может помочь в извлечении проб из скважин.
    4. Перенесите каждый комплект в свои индивидуальные стеклянные вставки автопробоотборника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти наборы также могут быть объединены в одиночные скважины из 384-луночной пластины и непосредственно помещены в автопробоотборник для закачки28.
    5. После того, как все наборы объединены и помещены в стеклянные вставки, высушите образцы.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Высушенные наборы можно хранить при -80 °C в течение не менее 1 недели до запуска на масс-спектрометре.
    6. Перед анализом LC-MS/MS добавьте 1,2 мкл 0,1% муравьиной кислоты (разбавленной в воде класса ВЭЖХ) к каждому набору для повторного суспендирования меченых пептидов.
      ВНИМАНИЕ: Муравьиная кислота является легковоспламеняющейся жидкостью. Это может привести к серьезному повреждению глаз или ожогам кожи. Обязательно носите средства индивидуальной защиты. Ручка в хорошо проветриваемом помещении.
    7. Поместите вставки автопробоотборника в стеклянные флаконы автосэмплера и закройте каждый образец колпачком.
    8. Вращайте каждый флакон в течение 5 с, чтобы убедиться, что повторное суспендирование завершено, а затем вращайтесь вниз во флаконе спиннера на RT.
    9. Убедитесь, что каждый образец находится в нижней части вкладыша, а не разбрызгивается по бокам.
    10. Поместите флаконы в лоток автопробоотборника.
    11. Для каждого набора вводите 1 мкл для анализа LC-MS/MS.
Ярлык 126 127Н 127С 128Н 128С 129Н 129С 130Н 130С .... 135Н
Тип образца Носитель Ссылка Пустой Пустой СК/Управление СК/Управление СК/Управление СК/Управление СК/Управление .... СК/Управление

Таблица 2: Пример схемы маркировки SCoPE2 TMTpro-18plex. Носитель и ссылка обычно маркируются на первых двух этикетках TMT. Затем следующие две метки пропускаются из-за потенциального изотопного загрязнения, которое сделает количественное определение менее точным. Остальные метки предназначены для отдельных ячеек или элементов управления.

128С 129Н 129С 130Н 130С 131Н 131С 132Н 132С 133Н 133С 134Н 128С 129Н 129С 130Н 130С 131Н 131С 132Н 132С 133Н 133С 134Н
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
A СК СК - СК СК СК СК СК + СК СК СК СК СК СК СК СК СК - СК + СК СК СК
B СК + СК СК СК СК СК СК СК СК + СК СК СК СК СК СК СК СК СК - СК СК +
C СК - СК - СК СК СК + СК - СК СК СК СК + СК - СК СК СК СК СК СК -
D СК СК СК СК СК СК - СК СК СК СК + СК - СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК
E СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК + СК СК СК СК СК - СК СК
F СК СК СК СК СК СК СК СК - СК СК СК СК + СК СК СК + СК СК СК + СК СК
G СК СК СК + СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК - СК СК СК СК
H СК СК СК СК СК + СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК + СК СК СК СК СК СК СК
Я СК СК СК СК СК СК СК СК СК + СК СК - СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК
J - СК + СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК - СК СК СК СК СК СК
K СК СК СК СК - СК СК СК СК - СК СК + СК - - СК СК СК СК СК СК СК СК
L СК СК СК СК СК - СК СК СК СК СК - СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК + СК
M СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК + СК СК СК СК
N + СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК
O СК СК СК СК + СК СК СК СК СК - СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК
P СК СК - СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК СК + СК СК СК - СК

Таблица 3: Пример компоновки пластин для маркировки с использованием TMTpro-16plex. Используя формат пластины на 384 скважины (или любой другой формат пластины), важно рандомизировать скважины, в которых сортируются ячейки. Для TMTpro-18plex будет использоваться другая компоновка пластин.

Representative Results

Положительные результаты протокола влекут за собой проверку того, что ряд критических шагов в протоколе был успешно выполнен; к ним относятся подготовка носителя, одноклеточная изоляция, лизис, пищеварение, маркировка штрих-кода и оптимизация параметров MS. Графики DO-MS позволяют легко оценить завершение каждого критического шага в протоколе. Успешно приготовленный носитель, который обычно соответствует 25 и 200 клеткам в количестве (на набор), хорошо усваивается и хорошо маркируется. Графики из DO-MS позволяют количественно оценить интенсивность образца (для оценки количества), эффективность пищеварения (в идеале <25% неправильных расщеплений) и эффективность маркировки (должна быть >99%). Наиболее важно, что образцы носителей, которые не полностью маркированы, могут допускать перекрестную реакцию со штрих-кодами, предназначенными для одиночных клеток, и добавлять ложный сигнал к количественной оценке одноклеточных пептидов.

Отрицательные контрольные скважины включают все экспериментальные реагенты, но не имеют клетки. Это позволяет не только оценить фоновый шум, но и определить эффективность изоляции ячеек путем предоставления репрезентативного сигнала пустой скважины. Отчет DO-MS предлагает графики для оценки измеренного сигнала контрольной скважины рядом с одноэлементными скважинами для определения успешности изоляции ячеек и фонового шума. Кроме того, качество количественного определения может быть оценено с помощью конвейера SCoPE2 (доступен на GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) или пакета29 биопроводников SCP.

Эффективность переваривания и маркировки отдельных клеток не может быть непосредственно проанализирована, как с носителем, но DO-MS снова предоставляет графики, которые позволяют оценить эффективность пищеварения и маркировки. Путем включения контроля 100-200 клеток наряду с подготовкой отдельных клеток (т.е. получением всех тех же добавок реагентов), эффективность пищеварения и маркировки может быть оценена для этого контроля и предполагается, что она разделяется отдельными клетками, приготовленными вместе. О плохом пищеварении будет свидетельствовать высокое отношение интенсивности неправильно расщепленных пептидов к их полностью расщепленным аналогам (рисунок 1).

Другим фактором, который следует учитывать в наборах, является доля недостающих данных и медиана интенсивности репортерных ионов в каждом канале TMT (рисунок 2). Когда одиночные клетки успешно подготовлены, количество недостающих данных на ячейку и положительный контроль намного ниже, чем в отрицательных контрольных образцах. Аналогичным образом, средняя интенсивность прекурсоров намного выше в одиночных клетках и положительном контроле, чем для отрицательных контрольных групп. Оптимизация параметров MS широко обсуждалась в другом месте21, и оптимальные параметры могут быть определены с помощью таких инструментов, как DO-MS или SCP Companion25,27.

Figure 1
Рисунок 1: Контроль качества подготовки носителя. Графики DO-MS, изображающие (А) эффективность маркировки успешно подготовленного носителя в местах маркировки ТМТ: первичный амин на боковой цепи лизина и пептида N-конца, и (В) эффективность пищеварения при аминокислотных остатках триптического расщепления. Аббревиатура: TMT = тандемный массовый тег. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Контроль качества одноклеточного препарата. Графики DO-MS, изображающие (A) долю недостающих данных в отдельных ячейках (C5-10), элементы управления (C13,16), носитель (C1) и эталон (C2) и (B) интенсивность отдельных ячеек и элементов управления. Теги 127C, 128N, 131C, 132N, 133N и 133C, которые соответствуют C3, C4, C11, C12 и C15, не используются в этом конкретном наборе. Положительный контроль состоит из клеточного материала, обработанного до пептидов массой, затем разбавленного до уровня 2-5 клеток/мкл до маркировки. Отрицательный контроль состоит из хорошо подвергнутых всех подготовительных этапов, используемых для одиночных клеток, только без добавления одной клетки. Аббревиатура: TMT = тандемный массовый тег. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Одним из залогов успешной подготовки и анализа одиночных клеток SCoPE2 является подготовка несущего и референсного каналов. Рекомендуемый размер носителя составляет от 100 до 200 клеток; однако количество клеток, необходимое для конкретного одноклеточного эксперимента, может быть определено на основе принципов, обсуждаемых в другом месте21. Для предполагаемого размера необходимо, по крайней мере, ~ 11 275 ячеек на пластину с 384 лунками, что позволяет использовать 200-элементный носитель и 5-элементный эталон в каждом наборе. Может быть выгодно изолировать больше клеток, если желаемые клеточные популяции не являются ограничивающим фактором, просто иметь дополнительный материал в случае ошибок (как это было сделано в этом протоколе, изолируя 22 000 клеток вместо 11 275 клеток). Количество носителя и эталона, необходимое для количества желаемых пластин, должно быть подготовлено в одной партии, чтобы свести к минимуму любые вариации между партиями, которые могут привести к различию идентификации или количественной оценки пептидов между партиями.

Перед выделением одиночных ячеек в скважины из 384-луночной плиты важно рассмотреть конструкцию компоновки плиты. В пределах каждой плиты на 384 скважины рекомендуется осуществлять как положительный, так и отрицательный контроль. Отрицательные контрольные элементы - это скважины, в которые не добавляются клетки, но подвергаются тем же добавлениям и процедурам реагентов, что и одноклеточные скважины. Положительными контрольными элементами являются колодцы, в которые добавляют клеточный лизат, разбавленный до 2-5 клеток/мкл, вместо одиночных клеток. Это особенно важно реализовать, когда методы изоляции одной ячейки недостаточно проверены. Каждая 384-луночная пластина в идеале должна иметь рандомизированное распределение одиночных ячеек и элементов управления (например, не иметь отрицательных или положительных элементов управления в одном ряду). Каждая пластина должна иметь равное распределение всех интересующих популяций клеток, а не выделять один тип клеток в одной пластине и второй тип клеток во второй пластине. Это позволит избежать связывания пакетных эффектов с типами клеток, представляющих интерес. Кроме того, если для анализа необходимо более одной 384-луночной пластины, целесообразно изолировать клетки за один сеанс, а не распределять ступень изоляции на несколько дней, если это возможно.

Лизис как одиночных ячеек, так и носителя/эталона происходит в воде через цикл замораживания-нагрева23. Ожидается, что большинство протеаз были денатурированы на этом этапе. Затем трипсин добавляют сразу после стадии денатурации в высокой концентрации, на много порядков большей по концентрации, чем даже самые распространенные клеточные протеазы. По массовому действию большинство продуктов протеазной активности будет обусловлено трипсином.

Восстановление/алкилирование остатков цистеина не проводится в этом протоколе до переваривания трипсина. Цистеинсодержащие пептиды составляют примерно 10% триптических пептидов из протеома человека. Мы наблюдаем меньше цистеинсодержащих пептидов, используя подход без восстановления/алкилирования. На этих этапах используются реагенты, которые несовместимы с маркировкой TMT (NHS-эфирная химия) сразу после пищеварения.

В этой стратегии маркировки TMT носитель и ссылки маркируются 126 и 127N соответственно, в то время как одноэлементные и контрольные скважины маркируются от 128C до 135N. Две метки после ссылки, 127C и 128N, не используются из-за изотопного перекрестного загрязнения, возникающего из каналов носителя и эталонного канала, которые явно гораздо более распространены в пептидном материале, чем одиночные клетки. В общей сложности существует 12 каналов TMT на комплект, которые могут быть использованы для маркировки отдельных ячеек или контрольных скважин с помощью TMTpro-16plex, или 14 каналов TMT на комплект с TMTpro-18plex.

Критические этапы в протоколе для выполнения одноклеточных протеомических измерений с использованием этого протокола включают подготовку носителя, изоляцию одной клетки, лизис, пищеварение, маркировку штрих-кода и надлежащие параметры масс-спектрометрии. Эти шаги были изложены в настоящем документе и подробно описаны в других разделах 17,21,25. Каждый шаг имеет соответствующий участок или набор графиков в DO-MS, которые позволяют легко контролировать качество. Например, в случае успешного создания носителя графики, изображающие количество идентифицированных пептидов, эффективность маркировки и процент скорости неправильного расщепления, позволяют проверить его успешную подготовку. Репрезентативные доклады ДО-МС включены в эту публикацию и могут быть просмотрены на http://scope2.slavovlab.net/ для исходных данных16. Эти отчеты DO-MS позволяют оценить оптимизацию метода в направлениях, еще не исследованных авторами, таких как более длинные градиенты LC, различные ферменты пищеварения или альтернативные химические штрих-коды.

В настоящее время последовательный анализ пептидов с помощью алгоритмов сбора данных ограничивает количество пептидов, которые могут быть проанализированы в LC-прогоне разумной длины. Отчасти это связано с более длительным временем заполнения, необходимым для успешного получения достаточного количества ионов для надежной одноэлементной количественной оценки21. Неотъемлемым ограничением использования носителя является отсутствие прямой оценки эффективности пищеварения и маркировки отдельных клеток. В настоящее время одним из решений этого ограничения является выполнение контроля качества на более крупном образце, обработанном вместе с одиночными ячейками.

Мы предложили ряд возможностей для улучшения одноклеточной протеомики, таких как построение масс-спектрометров с несколькими анализаторами. Текущий метод позволяет количественно оценить тысячи белков из одиночных клеток млекопитающих со скоростью около 100 клеток в день с помощью коммерчески доступных реагентов и оборудования. SCoPE2, второе поколение подхода SCoPE-MS, значительно улучшило своего предшественника в отношении количества клеток, анализируемых в единицу времени, количества белков, анализируемых в единицу времени, времени, необходимого для подготовки образцов, доступности реагентов и оборудования, а также общей стоимости подготовки и анализа на одну клетку. Мембранно-связанные белки доступны при использовании лизиса замораживания тепла и сбраживания протеазы, как показано в сравнении с лизисом мочевины23. Метод идентифицирует многие белки из верхней трети протеома относительно обилия16. Если модифицированный протеоформ находится в верхней трети протеома, а модифицированный пептид поддается масс-спектрометрическому анализу (хорошо ионизируется, имеет разницу в массе от немодифицированного пептида), он, скорее всего, будет поддаваться этому протоколу. Этот метод может быть плодотворно применен в биологических системах, где существует значимая гетерогенность между клетками, например, при дифференцировке, старении или иммунологических реакциях (т. Е. Фагоцитоз).

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы отметить награду NSF I-Corps Program осенью 2021 года (сайт Северо-Восточного университета), которая финансировала эту публикацию.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plate, standard PCR plate Thermo Fisher Scientific AB1384 Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific A955-1 This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 271004-100ML This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration.
Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils Thermo Fisher Scientific AB0626
Autosampler vial screw thread caps Thermo Fisher Scientific C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5) MTC Bio C2595 This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease Sigma Aldrich E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm Thermo Fisher Scientific 60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade Thermo Fisher Scientific 85178 Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm Thermo Fisher Scientific C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol Sigma Aldrich 467804-50ML Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips Formulatrix MCLVPR2 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips Formulatrix MCLVS12 These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler Formulatrix Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling Formulatrix 232400
MassPREP peptide mixture Waters 186002337 Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes) USA Scientific 2621-0016 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips USA Scientific 1402-3900 If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free Thermo Fisher Scientific AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge) Benchmark Scientific Model C2000 This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module) Biorad 1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg Thermo Fisher Scientific A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5 Sigma Aldrich T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade Promega V5280 This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results.

Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer) VWR Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer) VWR 97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade Fisher Scientific W6-1 All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Symmons, O., Raj, A. What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism. Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).
  2. Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics. The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).
  3. Levy, E., Slavov, N. Single cell protein analysis for systems biology. Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).
  4. Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition. Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22 (2021).
  5. Shaffer, S. M., et al. Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance. Nature. 555 (7695), 274 (2018).
  6. Pan, D., Jia, D. Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024 (2021).
  7. Segerstolpe, Å, et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  8. Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas. Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).
  9. Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity. Frontiers in Immunology. 12, 751701 (2021).
  10. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  11. Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. Post-transcriptional regulation across human tissues. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535 (2017).
  12. Slavov, N. Unpicking the proteome in single cells. Science. 367 (6477), 512-513 (2020).
  13. Specht, H., Slavov, N. Transformative opportunities for single-cell proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).
  14. Slavov, N. Learning from natural variation across the proteomes of single cells. PLoS Biology. , (2021).
  15. Slavov, N. Driving single cell proteomics forward with innovation. Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).
  16. Specht, H., et al. Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2. Genome Biology. 22 (1), 50 (2021).
  17. Petelski, A. A., et al. Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2. Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).
  18. Slavov, N. Scaling up single-cell proteomics. Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179 (2022).
  19. Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
  20. Lombard-Banek, C., et al. In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis). Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).
  21. Specht, H., Slavov, N. Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers. Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).
  22. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161 (2018).
  23. Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics. BioRxiv. , at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1.abstract (2018).
  24. Singh, A. Towards resolving proteomes in single cells. Nature Methods. 18 (8), 856 (2021).
  25. Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods. Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).
  26. Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. DART-ID increases single-cell proteome coverage. PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082 (2019).
  27. Cheung, T. K., et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).
  28. Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v1.abstract (2021).
  29. Vanderaa, C., Gatto, L. Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data. bioRxiv. , (2021).

Tags

Биология выпуск 190
Подготовка одноклеточной протеомики к масс-спектрометрическому анализу с использованием лизиса Freeze-Heat и изобарического носителя
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petelski, A. A., Slavov, N., Specht, … More

Petelski, A. A., Slavov, N., Specht, H. Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier. J. Vis. Exp. (190), e63802, doi:10.3791/63802 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter