Biology

Encellsproteomikberedning för masspektrometrianalys med frysvärmelys och en isobarisk bärare

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802

Aleksandra A. Petelski*¹, Nikolai Slavov^1,2,3, Harrison Specht*¹

¹Department of Bioengineering, Northeastern University, ²Barnett Institute, Northeastern University, ³Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

Summary

I detta protokoll beskriver vi hur man förbereder däggdjursceller för encellsproteomikanalys via masspektrometri med hjälp av kommersiellt tillgängliga reagenser och utrustning, med alternativ för både manuell och automatisk pipettering.

Abstract

Encellsproteomikanalys kräver känsliga, kvantitativt exakta, allmänt tillgängliga och robusta metoder. För att uppfylla dessa krav utvecklades Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) -protokollet som en andra generationens metod för att kvantifiera hundratals till tusentals proteiner från begränsade prover, ner till nivån för en enda cell. Experiment med denna metod har uppnått kvantifiering av över 3 000 proteiner över 1 500 enskilda däggdjursceller (500-1 000 proteiner per cell) på 10 dagars masspektrometerinstrumenttid. SCoPE2 utnyttjar en frysvärmecykel för celllys, vilket undanröjer behovet av sanering av enskilda celler och därmed minskar provförlusterna, samtidigt som provberedningen påskyndas och automatiseringen förenklas. Dessutom använder metoden en isobarisk bärare, vilket underlättar proteinidentifiering och minskar provförluster.

Detta videoprotokoll ger detaljerad vägledning för att möjliggöra antagandet av automatiserad encellsproteinanalys med endast utrustning och reagenser som är allmänt tillgängliga. Vi demonstrerar kritiska steg i proceduren för att förbereda enstaka celler för proteomisk analys, från skörd upp till injektion till vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS / MS) analys. Dessutom guidas tittarna genom principerna för experimentell design med den isobariska bäraren, kvalitetskontroll för både isobariska bärare och encellspreparat och representativa resultat med en diskussion om begränsningar av tillvägagångssättet.

Introduction

Encellsanalys används ofta för att studera graden av heterogenitet inom biologiska system som annars skulle vara oskiljbara genom bulkmätningar ^1,2,3. Sådan cellulär mångfald kan ha funktionella konsekvenser som kan främja förståelsen av integrerade biologiska processer, från cancercellterapeutisk resistens ^4,5,6 till cell-till-cell-heterogenitet vid diabetes 7,8,9,10. Många undersökningar har fokuserat på att mäta nukleinsyror i enskilda celler genom att mäta genetiska eller transkriptomiska nivåer och har möjliggjort klassificering av celltyper och tillstånd. Sådana framsteg i nukleinsyrautrymmet kan dock inte fylla kunskapsluckan i post-transkriptionell reglering¹¹, vilket driver behovet av liknande proteinmätningar med hög genomströmning i enskilda celler^12,13,14,15.

Vi har utvecklat SCoPE2^16,17 för att möta efterfrågan på rigorös och robust encellsproteomik av däggdjurssystem. Det är en multiplexerad metod som möjliggör ökad genomströmning genom att märka och analysera många celler parallellt¹⁸, i motsats till etikettfria mthoder som analyserar en cell vid tiden^19,20. Provberedningsmetoden, masspektrometrimetoden och efterföljande dataanalyssteg möjliggör exakt kvantifiering av hundratals till tusentals proteiner per enskild cell. Denna metod möjliggör masspektrometrianalys av enskilda celler genom den isobariska bäraren²¹, ett litet bulkprov av celler (vanligtvis 25-200) som biologiskt liknar den encelliga populationen av intresse. Detta bärarmaterial multiplexeras i en uppsättning med en referenskanal av samma material och enstaka celler genom användning av tandemmasstaggar (TMT-etiketter). Bärarkanalen minskar provförlusten till ytorna och tillhandahåller jonstamfragmenten för framgångsrik peptididentifiering. Referenskanalen, som framställs i bulk och därefter späds ner till 5-10 cellekvivalenter för varje encellsuppsättning, hjälper till att kontrollera teknisk variation i analysen. Specifikt möjliggör referensen normalisering av variabilitet orsakad av LC-MS / MS-relaterade effekter, såsom jonprovtagning och joniseringseffektivitet. Vanligtvis är referens- och bärarkanalerna gjorda från samma cellpopulation.

Detta provberedningsprotokoll är en andra generationens metod som bygger på SCoPE-MS²² genom flera synergistiska förbättringar. Förbättringarna inkluderar en celllysmetod som undviker provrensning, vilket är ett vanligt steg i MS-proteomikpreparat. Den använder mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)²³, som är en frysvärmelysmetod. Denna metod möjliggjorde lys av enstaka celler i mindre volymer och i flerbrunnsplattor snarare än i injektionsflaskor, vilket underlättade en högre genomströmningshastighet och automatisering av termiska cykler. Sammantaget har denna metod sänkt kostnaden per enskild cell och ökat kvantitativ noggrannhet jämfört med SCoPE-MS^16,24.

Detta protokoll beskriver hur man förbereder enskilda celler för proteomisk analys, inklusive hur man förbereder bäraren och referenskanalerna med TMTpro 18-plex isobariska etiketter. Däggdjursceller som är i encellssuspension och som kan isoleras i 384-brunnsplattor är sannolikt mottagliga för detta protokoll. Dessutom ingår representativa resultat av framgångsrika encellsuppsättningar, som visar flera kvalitetskontrolldiagram som genereras av en R Shiny-app, DO-MS²⁵. Andra publicerade programvaruverktyg 26,27 och experimentella riktlinjer ^17,21 har förbättrat antagandet av detta protokoll. Vi hoppas att den här visuella guiden ytterligare kommer att hjälpa forskare att utföra encellsproteomikexperiment.

Protocol

OBS: I detta protokoll är rumstemperaturen (RT) 18-22 °C.

1. Generering av bärar- och referensmaterial

Cellisolering
1. Samla celler av intresse i cellsuspensioner i iskall 1x PBS.
  OBS: Om möjligt bör bärar- och referensmaterialet framställas från den eller de cellpopulationer som valts ut för att studeras på encellsnivå. Liknande antal celler från de olika experimentella betingelserna (såsom stimulerade och ostimulerade immunceller) bör utgöra bäraren och referensen. I situationer där ett tillräckligt stort antal av dessa celler inte kan skördas bör en lämplig cellpopulation väljas utifrån biologisk likhet.
2. Använd en hemocytometer eller andra medel för cellräkning (som FACS), räkna antalet celler i suspensionen.
3. Snurra ner och återsuspendera 22 000 celler av varje celltyp i 11 μL vatten av HPLC-kvalitet, separat i PCR-rör (standard 250 μL PCR-rör).
  OBS: Antalet celler som rekommenderas här är tillräckligt för bärarna och referenser för antalet uppsättningar som kan framställas från en 384-brunnsplatta full av enstaka celler. Cellinmatningen i detta steg och reagensmängder i efterföljande steg kan skalas proportionellt för ett större antal uppsättningar. Hastigheten att snurra ner är beroende av cellodlingsmetoderna i labbet. En typisk spin down: 300 × g i 5 min.
4. Överför proverna till en frys på -80 °C i minst 30 minuter.
  PAUSPUNKT: Prover kan förbli frysta i flera månader utan konsekvenser för encellsdata.
Celllys
1. Värm PCR-röret med cellerna till 90 °C i 10 minuter (med termiskt cykellock inställt på 105 °C) och låt sedan rören svalna till 12 °C direkt efter uppvärmningscykeln.
2. Vörda röret kort och snurra sedan ner i en bänk-topp PCR-rörspinnare vid RT för att samla all vätska i botten av röret.
3. I en vattenbad sonicator, sonika rören i 5 min, placera dem sedan på is vid RT.
Trypsin matsmältning
1. Tillsätt 2,2 μl av huvudblandningen (se tabell 1 för komponenterna) till varje provrör medan det ligger på is.
  VARNING: Trypsin kan orsaka hud-, andnings- och ögonirritation. Var noga med att bära personlig skyddsutrustning. Hantera under en kemisk rökhuv.
2. Vörda rören kort för att blanda och snurra ner i en bänk-top PCR-rörspinnare vid RT för att samla all vätska i botten av varje rör.
3. Värm proverna vid 37 °C i 3 timmar (med locket till den termiska cykeln inställt på 52 °C).
TMT-märkning reaktion
1. Snurra ner proverna efter matsmältningen i en bänk-PCR-rörspinnare vid RT.
2. Dela upp varje prov i två lika stora volymer på 6,6 μl vardera, så att varje rör innehåller 11 000 celler.
3. Till rören avsedda för bäraren, tillsätt 3,3 μL TMT-etikett 126 som har återsuspenderats i en koncentration av 85 mM.
4. Till de rör som är avsedda för referensen, lägg till 3,3 μL TMT-etikett 127N som har återsuspenderats i en koncentration av 85 mM.
5. Vörda rören kort och snurra ner i en bänk-topp PCR-rörspinnare vid RT för att samla vätskan i botten.
6. Låt rören stå vid RT i 1 timme.
Släckning av TMT-märkningsreaktion
1. Tillsätt 1,65 μl 0,5% hydroxylamin till varje rör.
  VARNING: Hydroxylamin kan orsaka hudirritation. Var noga med att bära personlig skyddsutrustning.
2. Vörda rören kort och snurra ner i en bänk-topp PCR-rörspinnare vid RT för att samla vätskan i botten.
3. Låt rören stå på RT i 30 min.
Kombination av bärare och referens
1. Om prover som kommer att utgöra bäraren har märkts separat, blanda dem i lika stora förhållanden.
2. Om prover som kommer att utgöra referensen har märkts separat, blanda dem i lika stora förhållanden.
3. Blanda bäraren och referensen så att bärarens slutliga koncentration är 100-200 celler / μl och referenskoncentrationen är 5-10 celler / μl.
4. Bedöm kvaliteten på bäraren och referensmaterialen innan du kombinerar dem med encellsuppsättningar.
  OBS: Kvalitetskontroll av bäraren och referensmaterialet kan utföras med en mängd olika metoder, men det rekommenderas att använda DO-MS-programvaran, tillgänglig på do-ms.slavovlab.net¹⁷. Kritiska mätningar av kvalitet inkluderar felklyvningshastighet (<25%, ett mått beräknat som antalet säkert identifierade peptider med en missad klyvning dividerat med antalet säkert identifierade peptider totalt) och märkningseffektivitet (>99%, ett mått beräknat som antalet märkningsställen, nämligen peptid N-terminus och lysin, med en etikett dividerat med det totala antalet märkningsställen).
  PAUSPUNKT: Bäraren och referensmaterialet kan förvaras vid -80 °C tills det behövs.

Komponent	Blanda koncentration	Slutlig koncentration per rör
Trypsin Guld	50 ng/μL	8,33 ng/μl
TEAB, pH = 8,5	500 mM	83,33 miljoner
Benzonas nukleas	1,2 enheter	0,2 enheter

Tabell 1: Reagensmängd för masterblandning. De slutliga koncentrationerna av reagens som behövs för trypsindigestion listas.

2. Beredning av SCoPE2-prov

Cellisolering
1. Komplettera vatten av HPLC-kvalitet med 25 fmol per peptid per μL av en syntetisk peptidlösning.
  OBS: Waters MassPrep peptidlösning är ett exempel på vad som kan användas. Den består av sju peptider som inte joniserar särskilt bra. Detta är en viktig aspekt av denna lösning: dessa peptider stör inte exakt masspektrometrikvantifiering av enskilda celler. Varje högrenad blandning av några peptider som sannolikt inte finns i proverna av intresse kommer att vara lämplig.
2. Tillsätt 1 μL av denna blandning till varje brunn i en 384-brunnsplatta med en vätskedispenseringsrobot eller manuell pipett.
3. Försegla plattan och snurra ner den i en bänkskivspinnare vid RT för att samla vätskan i botten.
  PAUSPUNKT: Plattor med denna lösning kan förvaras vid -80 °C tills det behövs.
4. Få en suspension av ofixerade celler som är disaggregerade.
  OBS: Hur exakt cellsuspensionen erhålls baseras på celltypen av intresse. Här är breda exempel:
  1. Suspensionsceller: snurra ner cellerna i en pellet och ta bort cellodlingsmediet.
  2. Vidhäftande celler: ta bort cellerna från skålen eller kolven genom trypsinisering eller skrapning. Snurra sedan ner dem för att ta bort cellodlingsmediet.
5. Tvätta cellsuspensionen två gånger med 1x iskall PBS. Låt cellerna hänga i 1x PBS efter den andra tvätten.
6. Om 384-brunnsplattan var frusen, tina upp den vid RT. Snurra ner den för att säkerställa att all vätska är i botten av brunnarna.
7. Använd en cellsorterare eller andra tillgängliga medel, såsom manuell handplockning, för att distribuera enstaka celler i respektive brunnar.
  OBS: Lägg till enstaka celler i brunnar medan du lämnar vissa brunnar tomma för negativa och positiva kontroller (se diskussion). Vid användning av flödescytometri, använd lägsta möjliga flödeshastighet för flödescytometern. Lägre flödeshastighet tros vara skonsammare för cellhantering. Dessutom bör munstycksstorleken vara lämplig för användning med cellerna av intresse. Det rekommenderas att samarbeta med en flödescytometrianläggning.
8. Lägg till positiva kontroller av 2-5 cellekvivalenter lysat till utvalda brunnar pipetterade manuellt eller med vätskehanteringsrobotar.
9. Försegla och snurra ner plattan med sorterade celler i en bänkplattspinnare vid RT för att samla vätskan i botten. Frys plattan vid -80 °C så snart som möjligt.
  PAUSPUNKT: Plattor med sorterade enstaka celler kan förvaras vid -80 °C tills det behövs.
Celllys
1. Ta 384-brunnsplattan med de sorterade enskilda cellerna och lägg den i den termiska cykeln så snabbt som möjligt.
2. Värm plattan till 90 °C i 10 min (med locktemperaturen inställd på 105 °C) och låt sedan plattan svalna till 12 °C.
3. Snurra ner plattan en kort stund i en bänkskivspinnare på RT.
4. I en vattenbad sonicator, sonika plattan i 5 min vid RT, lägg den sedan på is.
Trypsin matsmältning
1. Bered 100 μl av huvudblandningen (se tabell 1 för komponenter) per 384-brunnsplatta.
2. Tillsätt 0,2 μl av huvudblandningen som beretts i steg 2.3.1 till varje brunn på 384-brunnsplattan med hjälp av en vätskehanterare.
  OBS: Använd större volymer om manuell pipettering används, se till att de slutliga koncentrationerna av reagens fortfarande är desamma per brunn.
3. Försegla plattan, virveln i 5 s och snurra ner i en bänkplattspinnare vid RT.
4. Värm 384-brunnsplattan vid 37 °C (med locktemperaturen inställd på 52 °C) i 3 timmar.
TMT-märkning reaktion
1. Ta ut 85 mM lager av TMT-etiketter (128N till 135N) ur frysen -80 °C. Värm rören till rumstemperatur innan du öppnar dem.
2. Späd etiketterna till 22 mM i vattenfri acetonitril.
  VARNING: Acetonitril är en brandfarlig vätska. Det kan irritera huden, ögonen, luftvägarna och centrala nervsystemet. Var noga med att bära personlig skyddsutrustning. Hantera under en kemisk rökhuv.
3. Använd denna märkningsstrategi och tillsätt 0,5 μL utspädda TMT-etiketter till varje brunn på 384-brunnsplattan. Använd antingen en vätskedispenseringsrobot (om du använder en vätskehanterare, var noga med att använda tillhörande utrustning som är lämplig för organiska lösningsmedel) eller en manuell pipett.
  OBS: Se tabell 2 för märkningsstrategin. Se tabell 3 för ett exempel på skyltlayout.
4. Försegla plattan, virveln i 5 s och snurra ner i en bänkplattspinnare vid RT.
5. Låt märkningsreaktionen fortsätta vid RT i 1 timme.
Släckning av TMT-märkningsreaktion
1. Till varje brunn på 384-brunnsplattan, tillsätt 0,2 μL 0,5% hydroxylamin (utspädd i HPLC-vatten av HPLC-kvalitet) med hjälp av en vätskehanterare.
  OBS: Använd större volymer om manuell pipettering används, se till att de slutliga koncentrationerna av reagens fortfarande är desamma per brunn.
2. Försegla plattan, virveln i 5 s och snurra ner i en bänkplattspinnare vid RT.
3. Håll plattan vid RT i 30 min.
Förberedelse för LC-MS/MS-analys: kombination av enstaka celler och kontrollbrunnar med bärar-/referensmaterial
1. Ta bort den kombinerade bäraren/referensmaterialet från frysen på -80 °C.
2. För varje uppsättning, pipettera 1 μL bärare och referensmaterial i den första brunnen som kommer att ingå i en enda uppsättning. Pipettera hela volymen av den första brunnen till den efterföljande brunnen. Fortsätt pipettera hela volymen från en cell till nästa tills alla brunnar som ska ingå i en enda uppsättning har kombinerats i den slutliga brunnen.
  OBS: Bäraren och referensmaterialet bör ha en koncentration av 200- respektive 5-cellsekvivalenter, men som diskuterats tidigare²¹ kan dessa mängder variera. Varje uppsättning, som beskrivs i märkningsstrategin (se tabell 2), bör innehålla bärare, referens och upp till 12 eller 14 encells- eller kontrollprover vid användning av TMTpro-16plex respektive TMTpro-18plex (se steg 2.4.3).
3. För varje uppsättning, tillsätt 5 μl 50% acetonitril (utspädd i HPLC-vatten av HPLC-kvalitet) till den första encelliga brunnen som ska ingå i varje uppsättning. Pipett hela volymen från den första brunnen till den efterföljande brunnen. Fortsätt pipettera hela volymen från en cell till nästa tills alla brunnar som ska ingå i en enda uppsättning har kombinerats i den slutliga brunnen.
  OBS: Detta tvättsteg kan hjälpa till med provåtervinning från brunnarna.
4. Överför varje uppsättning till deras individuella autosamplerglasinsatser.
  OBS: Dessa uppsättningar kan också kombineras till enstaka brunnar av en 384-brunnsplatta och placeras direkt i autosamplern för injektion²⁸.
5. När alla uppsättningar har kombinerats och placerats i glasinsatser, torka proverna.
  PAUSPUNKT: Torkade set kan förvaras vid -80 °C i minst 1 vecka innan de körs på en masspektrometer.
6. Före LC-MS/MS-analys, tillsätt 1,2 μL 0,1% myrsyra (utspädd i HPLC-vatten av HPLC-kvalitet) till varje uppsättning för att återsuspendera de märkta peptiderna.
  VARNING: Myrsyra är en brandfarlig vätska. Det kan orsaka allvarliga ögonskador eller hudbrännskador. Var noga med att bära personlig skyddsutrustning. Hantera i ett välventilerat område.
7. Placera autosamplerinsatserna i injektionsflaskor med autosampler av glas och stäng varje prov med ett lock.
8. Vörda varje injektionsflaska i 5 s för att se till att resuspensionen är klar och snurra sedan ner i en injektionsflaska vid RT.
9. Se till att varje prov är längst ner på insatsen i stället för att stänkas på sidorna.
10. Placera injektionsflaskorna i autosamplerfacket.
11. För varje uppsättning, injicera 1 μL för LC-MS/MS-analys.

Etikett	126	127N	127C	128N	128C	129N	129C	130N	130C	....	135N
Exempel på typ	Transportör	Hänvisning	Tom	Tom	SC/Styrning	SC/Styrning	SC/Styrning	SC/Styrning	SC/Styrning	....	SC/Styrning

Tabell 2: Exempel SCoPE2 TMTpro-18plex märkningsschema. Bäraren och referensen är vanligtvis märkta i de två första TMT-etiketterna. Sedan hoppas de två följande etiketterna över på grund av potentiell isotopförorening som skulle göra kvantifieringen mindre exakt. De andra etiketterna som finns kvar är för enskilda celler eller kontroller.

128C

129N

129C

130N

130C

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

128C

129N

129C

130N

130C

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

Jag

Tabell 3: Exempel på plattlayout för märkning med TMTpro-16plex. Med hjälp av ett 384-brunnsplattformat (eller något annat plattformat) är det viktigt att randomisera brunnarna där celler sorteras in. En annan plattlayout kommer att användas för TMTpro-18plex.

Representative Results

Positiva resultat från protokollet innebär att verifiera att ett antal kritiska steg i protokollet har utförts framgångsrikt; dessa inkluderar beredning av bäraren, encellsisolering, lys, matsmältning, streckkodsmärkning och MS-parameteroptimering. DO-MS-diagram möjliggör enkel bedömning av slutförandet av varje kritiskt steg i protokollet. En framgångsrikt beredd bärare, som vanligtvis motsvarar 25 och 200 celler i kvantitet (per uppsättning), är välsmält och väl märkt. Diagram från DO-MS gör det möjligt att kvantifiera provets intensitet (för att uppskatta kvantiteten), matsmältningseffektiviteten (helst <25% felklyvningar) och märkningseffektiviteten (måste vara >99%). Mest kritiskt kan bärarprover som inte är helt märkta tillåta korsreaktionen med streckkoderna avsedda för enstaka celler och lägga till en falsk signal till kvantifieringen av encelliga peptider.

Negativa kontrollbrunnar inkluderar alla experimentella reagenser men saknar en cell. Detta gör det möjligt att inte bara bedöma bakgrundsbrus utan också cellisoleringseffektiviteten genom att ge en representativ signal om en tom brunn. DO-MS-rapporten erbjuder diagram för att bedöma den uppmätta signalen från kontrollbrunnen tillsammans med encellsbrunnarna för att bestämma framgången för cellisolering och bakgrundsbrus. Dessutom kan kvantifieringskvaliteten bedömas med hjälp av SCoPE2-rörledningen (tillgänglig på GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) eller SCP Bioconductor-paketet²⁹.

Matsmältning och märkningseffektivitet hos de enskilda cellerna kanske inte analyseras direkt som med bäraren, men DO-MS ger igen diagram som möjliggör uppskattning av matsmältningen och märkningseffektiviteten. Genom att inkludera en kontroll av 100-200 celler tillsammans med beredningen av de enskilda cellerna (dvs. ta emot alla samma reagenstillägg) kan matsmältnings- och märkningseffektiviteten bedömas för den kontrollen och antas delas av de enskilda cellerna som framställts bredvid. Dålig matsmältning kommer att indikeras av ett högt förhållande mellan intensiteten hos felklyvda peptider och deras helt klyvda motsvarigheter (Figur 1).

En annan faktor att tänka på i uppsättningarna är andelen saknade data och medianreporterns jonintensitet i varje TMT-kanal (figur 2). När enstaka celler framgångsrikt förbereds är mängden saknade data per cell och positiv kontroll mycket lägre än i negativa kontrollprover. På samma sätt är medianintensiteten för prekursorer mycket högre i enskilda celler och positiva kontroller än för negativa kontroller. Optimeringen av MS-parametrar har diskuterats flitigt på andra håll²¹, och optimala parametrar kan bestämmas med hjälp av sådana verktyg som DO-MS eller SCP Companion^25,27.

Figur 1: Kvalitetskontroll av bärarberedning. DO-MS plottar som visar (A) märkningseffektivitet hos en framgångsrikt beredd bärare på märkningsställen med TMT: den primära aminen på sidokedjan av lysin och peptiden N-terminalus, och (B) matsmältningseffektiviteten vid aminosyrarester av tryptisk klyvning. Förkortning: TMT = tandemmasstagg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Kvalitetskontroll av encellsberedning. DO-MS-diagram som visar (A) andelen saknade data i enskilda celler (C5-10), kontroller (C13,16), bärare (C1) och referens (C2) och (B) intensiteten hos enskilda celler och kontroller. Taggarna 127C, 128N, 131C, 132N, 133N och 133C, som motsvarar C3, C4, C11, C12 och C15, används inte i just denna uppsättning. Den positiva kontrollen består av cellulärt material som bearbetas till peptider i bulk och sedan späds ut till en nivå av 2-5 celler / μL före märkning. Den negativa kontrollen består av en brunn som utsätts för alla förberedande steg som används för enstaka celler, bara utan tillsats av en enda cell. Förkortning: TMT = tandemmasstagg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

En av nycklarna till framgångsrik förberedelse och analys av enskilda celler med SCoPE2 är beredningen av bärar- och referenskanalerna. Den föreslagna bärarstorleken är 100 till 200 celler; Antalet celler som behövs för ett visst encellsexperiment kan dock bestämmas utifrån principer som diskuterats på annat håll²¹. För den föreslagna storleken behövs minst ~ 11 275 celler per 384-brunnsplatta, vilket möjliggör en 200-cellsbärare och 5-cellsreferens i varje uppsättning. Det kan vara fördelaktigt att isolera fler celler om de önskade cellpopulationerna inte är en begränsande faktor, att helt enkelt ha extra material vid misstag (som gjordes i detta protokoll, isolera 22 000 celler istället för 11 275 celler). Mängden bärare och referens som behövs för antalet önskade plattor bör beredas i en enda sats för att minimera eventuell variation från sats till sats som kan orsaka peptididentifiering eller kvantifiering att skilja sig åt mellan satser.

Innan du isolerar enstaka celler i brunnar på en 384-brunnsplatta är det viktigt att överväga utformningen av plattlayouten. Inom varje 384-brunnsplatta rekommenderas att implementera både positiva och negativa kontroller. Negativa kontroller är brunnar där inga celler tillsätts men genomgår samma reagenstillsatser och procedurer som encelliga brunnar. Positiva kontroller är brunnar där celllysat utspätt till 2-5 celler/μL tillsätts istället för enstaka celler. Detta är särskilt viktigt att implementera när encellsisoleringsmetoder inte är väl validerade. Varje platta med 384 brunnar bör helst ha en randomiserad fördelning av enskilda celler och kontroller (t.ex. inte ha negativa eller positiva kontroller i bara en rad). Varje platta bör ha en jämn fördelning av alla cellpopulationer av intresse, snarare än att isolera en celltyp i en platta och en andra celltyp i en andra platta. Detta kommer att undvika att binda batcheffekter med celltyper av intresse. Dessutom, om mer än en 384-brunnsplatta behövs för analys, är det lämpligt att isolera celler i en enda session, snarare än att sprida isoleringssteget över flera dagar, om möjligt.

Lys av både enstaka celler och bärare/referens sker i vatten genom en frysvärmecykel²³. Det förväntas att de flesta proteaser har denaturerats under detta steg. Trypsin tillsätts sedan omedelbart efter denatureringssteget vid en hög koncentration, många storleksordningar större i koncentration än till och med de vanligaste cellulära proteaserna. Genom massverkan kommer de flesta produkter av proteasaktivitet att bero på trypsin.

Reduktion/alkylering av cysteinrester utförs inte i detta protokoll före trypsindigestion. Cysteinhaltiga peptider representerar ungefär 10% av tryptiska peptider från det humana proteomet. Vi observerar färre cysteinhaltiga peptider med hjälp av en metod utan reduktion/alkylering. Dessa steg använder reagenser som är oförenliga med märkning av TMT (NHS-esterkemi) omedelbart efter matsmältningen.

I denna TMT-märkningsstrategi är bäraren och referenserna märkta med 126 respektive 127N, medan encells- och kontrollbrunnar är märkta med 128C till 135N. De två etiketterna efter referensen, 127C och 128N, används inte på grund av isotopisk korskontaminering som härrör från bärar- och referenskanalerna, som är klart mycket rikligare i peptidmaterial än de enskilda cellerna. Totalt finns det 12 TMT-kanaler per uppsättning som kan användas för märkning av enskilda celler eller kontrollbrunnar med TMTpro-16plex, eller 14 TMT-kanaler per uppsättning med TMTpro-18plex.

De kritiska stegen i protokollet för att utföra encellsproteomikmätningar med detta protokoll inkluderar beredning av bäraren, encellsisolering, lys, matsmältning, streckkodsmärkning och korrekta masspektrometriparametrar. Dessa steg har beskrivits i detta dokument och har utförligt beskrivits på andra ställen 17,21,25. Varje steg har en motsvarande plot eller uppsättning tomter i DO-MS som möjliggör enkel kvalitetskontroll. Till exempel, vid framgångsrik skapande av bäraren, gör tomter som visar antalet identifierade peptider, märkningseffektiviteten och procentandelen felklyvningshastighet möjliggör verifiering av dess framgångsrika beredning. Representativa DO-MS-rapporter ingår i denna publikation och kan ses på http://scope2.slavovlab.net/ för de ursprungliga uppgifterna¹⁶. Dessa DO-MS-rapporter gör det möjligt att bedöma optimering av metoden i riktningar som ännu inte undersökts av författarna, såsom längre LC-gradienter, olika matsmältningsenzymer eller alternativa kemiska streckkoder.

För närvarande begränsar den seriella analysen av peptider med databeroende förvärvsalgoritmer antalet peptider som kan analyseras i en LC-körning av rimlig längd. Detta beror delvis på de längre fyllningstider som krävs för att framgångsrikt förvärva tillräckligt med joner för tillförlitlig encellskvantifiering²¹. En inneboende begränsning för att använda bäraren är bristen på direkt bedömning av matsmältningen och märkningseffektiviteten hos de enskilda cellerna. För närvarande är en lösning på denna begränsning att utföra kvalitetskontroll på ett större prov som bearbetas tillsammans med de enskilda cellerna.

Vi föreslog ett antal möjligheter för att förbättra encellsproteomik, såsom att bygga masspektrometrar med flera analysatorer. Den nuvarande metoden möjliggör kvantifiering av tusentals proteiner från enskilda däggdjursceller med en hastighet av cirka 100 celler per dag med kommersiellt tillgängliga reagenser och utrustning. SCoPE2, den andra generationen av SCoPE-MS-metoden, förbättrades avsevärt jämfört med sin föregångare med avseende på antalet celler som kan analyseras per tidsenhet, antalet proteiner som kan analyseras per tidsenhet, den tid som krävs för provberedning, tillgängligheten av reagenser och utrustning och den totala kostnaden för beredning och analys per enskild cell. Membranbundna proteiner är tillgängliga med hjälp av frysvärmelys och proteassmältning, vilket visas i jämförelse med urea lys²³. Metoden identifierar många proteiner från den övre tredjedelen av proteomet med avseende på överflöd¹⁶. Om den modifierade proteoformen ligger i den övre tredjedelen av proteomet, och den modifierade peptiden är mottaglig för masspektrometrianalys (joniserar väl, har en massskillnad från omodifierad peptid), kommer den mer sannolikt att vara mottaglig för detta protokoll. Denna metod kan tillämpas fruktbart i biologiska system där det finns meningsfull heterogenitet bland celler, såsom vid differentiering, åldrande eller immunologiska svar (dvs. fagocytos).

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill erkänna hösten 2021 NSF I-Corps Program (Northeastern University site) utmärkelse som har finansierat denna publikation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plate, standard PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB1384	Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	A955-1	This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%	Sigma Aldrich	271004-100ML	This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils	Thermo Fisher Scientific	AB0626
Autosampler vial screw thread caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)	MTC Bio	C2595	This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease	Sigma Aldrich	E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade	Thermo Fisher Scientific	85178	Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol	Sigma Aldrich	467804-50ML	Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips	Formulatrix	MCLVPR2	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips	Formulatrix	MCLVS12	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler	Formulatrix		Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling	Formulatrix	232400
MassPREP peptide mixture	Waters	186002337	Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)	USA Scientific	2621-0016	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips	USA Scientific	1402-3900	If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)	Benchmark Scientific	Model C2000	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)	Biorad	1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg	Thermo Fisher Scientific	A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5	Sigma Aldrich	T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade	Promega	V5280	This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)	VWR	Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)	VWR	97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	W6-1	All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .