Biology

Dondurarak Isı Lizisi ve İzobarik Taşıyıcı Kullanarak Kütle Spektrometresi Analizi için Tek Hücreli Proteomik Hazırlık

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802

Aleksandra A. Petelski*¹, Nikolai Slavov^1,2,3, Harrison Specht*¹

¹Department of Bioengineering, Northeastern University, ²Barnett Institute, Northeastern University, ³Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

Summary

Bu protokolde, memeli hücrelerinin, hem manuel hem de otomatik pipetleme seçenekleriyle, ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve ekipmanlar kullanılarak kütle spektrometresi yoluyla tek hücreli proteomik analiz için nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz.

Abstract

Tek hücreli proteomik analiz, hassas, nicel olarak doğru, yaygın olarak erişilebilir ve sağlam yöntemler gerektirir. Bu gereksinimleri karşılamak için, Tek Hücreli ProtEomics (SCoPE2) protokolü, sınırlı örneklerden yüzlerce ila binlerce proteini tek bir hücre seviyesine kadar ölçmek için ikinci nesil bir yöntem olarak geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanan deneyler, 10 günlük kütle spektrometresi enstrüman süresinde 1.500 tek memeli hücresinde (hücre başına 500-1.000 protein) 3.000'den fazla proteinin nicelleştirilmesini sağlamıştır. SCoPE2, hücre lizisi için dondurarak ısı döngüsünden yararlanır, tek hücrelerin temizlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır ve sonuç olarak numune kayıplarını azaltırken, numune hazırlamayı hızlandırır ve otomasyonunu basitleştirir. Ek olarak, yöntem protein tanımlamaya yardımcı olan ve numune kayıplarını azaltan izobarik bir taşıyıcı kullanır.

Bu video protokolü, yalnızca yaygın olarak erişilebilen ekipman ve reaktifleri kullanarak otomatik tek hücreli protein analizinin benimsenmesini sağlamak için ayrıntılı rehberlik sağlar. Proteomik analiz için tek hücrelerin hazırlanması prosedüründe, hasattan enjeksiyona, sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) analizine kadar kritik adımları gösteriyoruz. Ek olarak, izleyiciler izobarik taşıyıcı ile deneysel tasarım ilkeleri, hem izobarik taşıyıcı hem de tek hücreli preparatlar için kalite kontrolü ve yaklaşımın sınırlamalarının tartışılmasıyla temsili sonuçlar hakkında yönlendirilir.

Introduction

Tek hücreli analiz, biyolojik sistemler içindeki heterojenlik seviyesini incelemek için yaygın olarak kullanılır ve aksi takdirde^{toplu ölçümlerle} ayırt edilemez 1,2,3. Bu tür hücresel çeşitlilik, kanser hücresi terapötik direnci 4,5,6'dan diyabette hücreden hücreye heterojenliğe kadar integral biyolojik süreçlerin anlaşılmasını daha da ileri götürebilecek fonksiyonel sonuçlara sahip olabilir 7,8,9,10. Birçok araştırma, genetik veya transkriptomik seviyeleri ölçerek tek hücrelerdeki nükleik asitlerin ölçülmesine odaklanmış ve hücre tiplerinin ve durumlarının sınıflandırılmasını sağlamıştır. Bununla birlikte, nükleik asit uzayındaki bu tür bir ilerleme, transkripsiyon sonrası düzenleme^11'in bilgi boşluğunu dolduramaz ve tek hücrelerde benzer şekilde yüksek verimli protein ölçümlerine olan ihtiyacı artırmaktadır^12,13,14,15.

SCoPE2 ^16,17'yi, memeli sistemlerinin titiz ve sağlam tek hücreli proteomiklerine olan talebi karşılamak için geliştirdik. ^19,20 zamanında bir hücreyi analiz eden etiketsiz mthod'ların aksine, birçok hücreyi paralel^18'de etiketleyerek ve analiz ederek verimin artmasına izin veren çoklanmış bir yöntemdir. Numune hazırlama metodolojisi, kütle spektrometresi yaklaşımı ve sonraki veri analizi adımları, tek bir hücre başına yüz ila binlerce proteinin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu yöntem, biyolojik olarak ilgilenilen tek hücreli popülasyona benzeyen küçük bir hücre toplu örneği (genellikle 25-200) olan izobarik taşıyıcı²¹ aracılığıyla tek hücrelerin kütle spektrometrisi analizini mümkün kılar. Bu taşıyıcı malzeme, tandem kütle etiketleri (TMT etiketleri) kullanılarak aynı malzemenin referans kanalına ve tek hücrelere sahip bir sette çoğaltılır. Taşıyıcı kanal, yüzey alanlarındaki numune kaybını azaltır ve başarılı peptit tanımlaması için iyon omurga parçaları sağlar. Toplu olarak hazırlanan ve daha sonra her bir tek hücreli set için 5-10 hücre eşdeğerine kadar seyreltilen referans kanalı, analizdeki teknik değişkenliğin kontrol edilmesine yardımcı olur. Özellikle, referans, iyon örneklemesi ve iyonizasyon verimlilikleri gibi LC-MS / MS ile ilgili etkilerin neden olduğu değişkenliğin normalleştirilmesine izin verir. Genellikle, referans ve taşıyıcı kanallar aynı hücre popülasyonundan yapılır.

Bu örnek hazırlama protokolü, SCoPE-MS²² üzerine inşa edilen ve çoklu sinerjik iyileştirmeler yapılan ikinci nesil bir yöntemdir. İyileştirmeler, MS proteomik preparatlarının ortak bir adımı olan numune temizliğini önleyen bir hücre lizis yöntemini içerir. Dondurarak ısı lizizi yöntemi olan mPOP (minimal ProteOmic numune hazırlama)²³ kullanır. Bu yöntem, tek hücrelerin şişeler yerine daha küçük hacimlerde ve çok kuyulu plakalarda lizisini sağlayarak termal döngücüler tarafından daha yüksek bir verim oranı ve otomasyon sağladı. Toplamda, bu yöntem tek hücre başına maliyeti düşürdü ve SCoPE-MS 16,24'e kıyasla nicel doğruluğu artırdı.

Bu protokol, TMTpro 18-plex izobarik etiketleri kullanarak taşıyıcı ve referans kanallarının nasıl hazırlanacağı da dahil olmak üzere proteomik analiz için tek hücrelerin nasıl hazırlanacağını açıklar. Tek hücreli süspansiyonda olan ve 384 kuyucuklu plakalara izole edilebilen memeli hücreleri muhtemelen bu protokole uygundur. Ayrıca, bir R Shiny uygulaması olan DO-MS²⁵ tarafından oluşturulan çeşitli kalite kontrol grafiklerini görüntüleyen başarılı tek hücreli setlerin temsili sonuçları da dahildir. Yayınlanan diğer yazılım araçları^26,27 ve deneysel kılavuzlar ^17,21, bu protokolün benimsenmesini geliştirmiştir. Bu görsel kılavuzun, araştırmacıların tek hücreli proteomik deneyler yapmalarına yardımcı olacağını umuyoruz.

Protocol

NOT: Bu protokolde oda sıcaklığı (RT) 18-22 °C'dir.

1. Taşıyıcı ve referans malzeme üretimi

Hücre izolasyonu
1. İlgilenilen hücreleri buz gibi soğuk 1x PBS'de hücre süspansiyonlarına toplayın.
  NOT: Mümkünse, taşıyıcı ve referans materyal, tek hücre düzeyinde incelenmek üzere seçilen hücre popülasyonlarından hazırlanmalıdır. Farklı deney koşullarından (uyarılmış ve uyarılmamış bağışıklık hücreleri gibi) benzer sayıda hücre taşıyıcıyı ve referansı oluşturmalıdır. Bu hücrelerin yeterince büyük bir kısmının toplanamadığı durumlarda, biyolojik benzerliğe dayanarak uygun bir hücre popülasyonu seçilmelidir.
2. Bir hemositometre veya başka bir hücre sayma aracı (FACS gibi) kullanarak, süspansiyondaki hücre sayısını sayın.
3. Her hücre tipinden 22.000 hücreyi 11 μL HPLC sınıfı suda, ayrı ayrı PCR tüplerine (standart 250 μL PCR tüpleri) döndürün ve yeniden askıya alın.
  NOT: Burada tavsiye edilen hücre sayısı, taşıyıcılar için yeterlidir ve tek hücrelerle dolu 384 delikli bir plakadan hazırlanabilecek set sayısı için referanslar yeterlidir. Bu adımdaki hücre girişi ve sonraki adımlardaki reaktif miktarları, daha fazla sayıda küme için orantılı olarak ölçeklendirilebilir. Aşağı doğru dönme hızı, laboratuvarın hücre kültürü uygulamalarına bağlıdır. Tipik bir spin down: 5 dakika boyunca 300 × g.
4. Numuneleri en az 30 dakika boyunca -80 °C dondurucuya aktarın.
  DURAKLATMA NOKTASI: Numuneler, tek hücreli veriler için hiçbir sonuç vermeden birkaç ay boyunca donmuş kalabilir.
Hücre lizisi
1. PCR tüpünü hücrelerle birlikte 10 dakika boyunca 90 ° C'ye ısıtın (termal döngü kapağı 105 ° C'ye ayarlanmışken) ve ardından ısıtma döngüsünden hemen sonra tüplerin 12 ° C'ye soğumasını bekleyin.
2. Tüpü kısaca vorteksleyin ve ardından tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak için RT'de tezgah üstü bir PCR tüp iplikçisinde aşağı doğru döndürün.
3. Bir su banyosu sonicator'da, tüpleri 5 dakika boyunca sonikleştirin, ardından RT'de buzun üzerine yerleştirin.
Tripsin sindirimi
1. Buz üzerindeyken her numune tüpüne 2,2 μL ana karışım ekleyin (bileşenler için Tablo 1'e bakınız).
  DİKKAT: Tripsin cilt, solunum ve göz tahrişine neden olabilir. Kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun. Kimyasal bir duman başlığının altında tutun.
2. Her tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak için RT'de tezgah üstü bir PCR tüp iplikçisinde karıştırmak ve döndürmek için tüpleri kısaca vorteksleyin.
3. Numuneleri 37 °C'de 3 saat ısıtın (termal döngü kapağı 52 °C'ye ayarlanmışken).
TMT etiketleme reaksiyonu
1. RT'de tezgah üstü PCR tüp iplikçisinde sindirimden sonra numuneleri döndürün.
2. Her numuneyi her biri 6.6 μL'lik iki eşit hacme bölün, böylece her tüp 11.000 hücre içerir.
3. Taşıyıcı için kullanılan tüplere, 85 mM'lik bir konsantrasyonda yeniden askıya alınmış 3.3 μL TMT etiketi 126 ekleyin.
4. Referans amaçlı tüplere, 85 mM'lik bir konsantrasyonda yeniden askıya alınmış 3,3 μL TMT etiketi 127N'yi ekleyin.
5. Tüpleri kısaca vorteksleyin ve alttaki sıvıyı toplamak için RT'de tezgah üstü bir PCR tüp eğirici içinde aşağı doğru döndürün.
6. Tüpleri RT'de 1 saat bekletin.
TMT etiketleme reaksiyonunun söndürülmesi
1. Her tüpe 1.65 μL% 0.5 hidroksilamin ekleyin.
  DİKKAT: Hidroksilamin cilt tahrişine neden olabilir. Kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun.
2. Tüpleri kısaca vorteksleyin ve alttaki sıvıyı toplamak için RT'de tezgah üstü bir PCR tüp eğirici içinde aşağı doğru döndürün.
3. Tüpleri RT'de 30 dakika bekletin.
Taşıyıcı ve referans kombinasyonu
1. Taşıyıcıyı oluşturacak numuneler ayrı ayrı etiketlenmişse, bunları eşit oranlarda karıştırın.
2. Referansı oluşturacak numuneler ayrı ayrı etiketlenmişse, bunları eşit oranlarda karıştırın.
3. Taşıyıcıyı ve referansı, taşıyıcının nihai konsantrasyonu 100-200 hücre / μL olacak ve referans konsantrasyonu 5-10 hücre / μL olacak şekilde karıştırın.
4. Taşıyıcı ve referans malzemelerin kalitesini, bunları tek hücreli setlerle birleştirmeden önce değerlendirin.
  NOT: Taşıyıcının ve referans malzemenin kalite kontrolü çeşitli yöntemlerle gerçekleştirilebilir, ancak do-ms.slavovlab.net^17'de bulunan DO-MS yazılımının kullanılması önerilir. Kritik kalite ölçümleri arasında yanlış bölünme oranı (% <25, kaçırılmış bir bölünmeye sahip kendinden emin bir şekilde tanımlanmış peptitlerin sayısının, toplamda güvenle tanımlanmış peptitlerin sayısına bölünmesiyle hesaplanan bir metrik) ve etiketleme verimliliğini (% >99, etiketleme bölgelerinin sayısı olarak hesaplanan bir metrik, yani peptid N-terminus ve Lizin, bir etiketin toplam etiketleme bölgesi sayısına bölünmesiyle).
  DURAKLAMA NOKTASI: Taşıyıcı ve referans malzemeler gerekli olana kadar -80 °C'de saklanabilir.

Parça	Karışım Konsantrasyonu	Tüp başına son konsantrasyon
Tripsin Altın	50 ng/μL	8,33 ng/μL
ÇAY ÇAYI, pH = 8,5	500 mM	83,33 mM
Benzonaz nükleaz	1.2 birim	0,2 birim

Tablo 1: Ana karışımın reaktif miktarı. Tripsin sindirimi için gerekli olan reaktiflerin son konsantrasyonları listelenmiştir.

2. SCoPE2 numune hazırlama

Hücre izolasyonu
1. HPLC sınıfı suyu, sentetik bir peptit çözeltisinin μL'si başına peptid başına 25 fmol ile destekleyin.
  NOT: Waters MassPrep peptid çözeltisi, nelerin kullanılabileceğine bir örnektir. Çok iyi iyonlaşmayan yedi peptitten oluşur. Bu, bu çözümün kilit bir yönüdür: bu peptitler, tek hücrelerin doğru kütle spektrometrisi nicelleşmesine müdahale etmez. İlgilenilen örneklerde olması muhtemel olmayan birkaç peptidin yüksek oranda saflaştırılmış herhangi bir karışımı uygun olacaktır.
2. Bir sıvı dağıtım robotu veya manuel pipet kullanarak 384 delikli bir plakanın her bir oluğuna bu karışımın 1 μL'sini ekleyin.
3. Plakayı kapatın ve alttaki sıvıyı toplamak için RT'de tezgah üstü bir plaka döndürücüde döndürün.
  DURAKLAMA NOKTASI: Bu çözeltiye sahip plakalar gerekli olana kadar -80 °C'de saklanabilir.
4. Ayrıştırılmış sabitlenmemiş hücrelerin süspansiyonunu elde edin.
  NOT: Hücre süspansiyonunun tam olarak nasıl elde edildiği, ilgilenilen hücre tipine bağlıdır. Aşağıda geniş örnekler verilmiştir:
  1. Süspansiyon hücreleri: hücreleri bir pelet haline getirin ve hücre kültürü ortamını çıkarın.
  2. Yapışkan hücreler: hücreleri tripsinizasyon veya kazıma yoluyla çanaktan veya şişeden çıkarın. Ardından, hücre kültürü ortamını çıkarmak için bunları aşağı doğru döndürün.
5. Hücre süspansiyonunu 1x buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra hücreleri 1x PBS'de asılı bırakın.
6. 384 delikli plaka donmuşsa, RT'de çözün.
7. Tek hücreleri ilgili kuyucuklara dağıtmak için bir hücre sıralayıcısı veya manuel elle toplama gibi başka araçlar kullanın.
  NOT: Negatif ve pozitif kontroller için bazı kuyuları boş bırakırken kuyucuklara tek hücreler ekleyin (tartışmaya bakın). Akış sitometrisi kullanırken, akış sitometresi için mümkün olan en düşük akış hızını kullanın. Düşük akış hızının hücre kullanımı için daha yumuşak olduğu düşünülmektedir. Ek olarak, nozul boyutu, ilgilenilen hücrelerle kullanım için uygun olmalıdır. Bir akış sitometri tesisi ile işbirliği yapılması önerilir.
8. Manuel olarak veya sıvı taşıma robotlarıyla pipetlenmiş seçili kuyucuklara 2-5 hücre eşdeğeri lizatın pozitif kontrollerini ekleyin.
9. Alttaki sıvıyı toplamak için plakayı RT'de tezgah üstü bir plaka döndürücüde sıralanmış hücrelerle kapatın ve döndürün. Plakayı mümkün olan en kısa sürede -80 ° C'de dondurun.
  DURAKLAMA NOKTASI: Sıralanmış tek hücreli plakalar gerekli olana kadar -80 °C'de saklanabilir.
Hücre lizisi
1. Sıralanmış tek hücreli 384 delikli plakayı alın ve mümkün olduğunca çabuk termal döngüleyiciye koyun.
2. Plakayı 10 dakika boyunca 90 °C'ye ısıtın (kapak sıcaklığı 105 °C'ye ayarlanmışken) ve ardından plakanın 12 °C'ye soğumasını bekleyin.
3. RT'de tezgah üstü bir plaka eğirici ile plakayı kısaca aşağı doğru döndürün.
4. Bir su banyosu sonikatöründe, plakayı RT'de 5 dakika boyunca sonikleştirin, ardından buzun üzerine yerleştirin.
Tripsin sindirimi
1. 384 delikli plaka başına 100 μL ana karışım hazırlayın (bileşenler için Tablo 1'e bakınız).
2. 384 delikli plakanın her bir oyuğuna, bir sıvı işleyici kullanılarak adım 2.3.1'de hazırlanan ana karışımın 0,2 μL'sini ekleyin.
  NOT: Manuel pipetleme kullanılıyorsa daha büyük hacimler kullanın, böylece reaktiflerin nihai konsantrasyonlarının kuyu başına hala aynı olduğundan emin olun.
3. Plakayı kapatın, 5 sn boyunca vorteks yapın ve RT'de tezgah üstü bir plaka döndürücüde aşağı doğru döndürün.
4. 384 delikli plakayı 37 °C'de (kapak sıcaklığı 52 °C'ye ayarlanmış) 3 saat ısıtın.
TMT etiketleme reaksiyonu
1. TMT etiketlerinin 85 mM stoklarını (128N ila 135N) -80 °C dondurucudan çıkarın. Tüpleri açmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.
2. Etiketleri susuz asetonitril içinde 22 mM'ye kadar seyreltin.
  DİKKAT: Asetonitril, yanıcı bir sıvıdır. Cildi, gözleri, solunum yollarını ve merkezi sinir sistemini tahriş edebilir. Kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun. Kimyasal bir duman başlığının altında tutun.
3. Bu etiketleme stratejisini kullanarak, 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 0,5 μL seyreltilmiş TMT etiketi ekleyin. Bir sıvı dağıtım robotu (sıvı işleyici kullanıyorsanız, organik çözücüler için uygun olan ilgili ekipmanı kullandığınızdan emin olun) veya manuel pipet kullanın.
  NOT: Etiketleme stratejisi için Tablo 2'ye bakın. Örnek bir plaka düzeni için Tablo 3'e bakın.
4. Plakayı kapatın, 5 sn boyunca vorteks yapın ve RT'de tezgah üstü bir plaka döndürücüde aşağı doğru döndürün.
5. Etiketleme reaksiyonunun RT'de 1 saat boyunca ilerlemesine izin verin.
TMT etiketleme reaksiyonunun söndürülmesi
1. 384 delikli plakanın her bir kuyucuğuna, bir sıvı işleyici kullanarak 0,2 μL% 0,5 hidroksilamin (HPLC sınıfı suda seyreltilmiş) ekleyin.
  NOT: Manuel pipetleme kullanılıyorsa daha büyük hacimler kullanın, böylece reaktiflerin nihai konsantrasyonlarının kuyu başına hala aynı olduğundan emin olun.
2. Plakayı kapatın, 5 sn boyunca vorteks yapın ve RT'de tezgah üstü bir plaka döndürücüde aşağı doğru döndürün.
3. Tabağı 30 dakika boyunca RT'de tutun.
LC-MS/MS analizi için hazırlık: tek hücrelerin ve kontrol kuyularının taşıyıcı/referans malzeme ile kombinasyonu
1. Kombine taşıyıcı/referans malzemesini -80 °C dondurucudan çıkarın.
2. Her set için pipet, 1 μL taşıyıcı ve referans malzemeyi tek bir setin parçası olacak ilk kuyucuğa yerleştirir. İlk kuyunun tüm hacmini bir sonraki kuyuya pipetleyin. Tek bir sete dahil edilecek tüm kuyucuklar son kuyuda birleştirilene kadar tüm hacmi bir hücreden diğerine pipetlemeye devam edin.
  NOT: Taşıyıcı ve referans malzeme sırasıyla 200 ve 5 hücreli eşdeğerleri konsantrasyonunda olmalıdır, ancak daha önce tartışıldığı gibi²¹, bu miktarlar değişebilir. Her set, etiketleme stratejisinde belirtildiği gibi (bkz. Tablo 2), TMTpro-16plex veya TMTpro-18plex kullanılırken sırasıyla taşıyıcı, referans ve 12 veya 14 adede kadar tek hücreli veya kontrol örneği içermelidir (bkz. adım 2.4.3).
3. Her set için, her sete dahil edilecek ilk tek hücreli kuyucuğa 5 μL% 50 asetonitril (HPLC sınıfı suda seyreltilmiş) ekleyin. Pipet tüm hacmi ilk kuyudan sonraki kuyuya kadar pişirin. Tek bir sete dahil edilecek tüm kuyucuklar son kuyuda birleştirilene kadar tüm hacmi bir hücreden diğerine pipetlemeye devam edin.
  NOT: Bu yıkama adımı, kuyulardan numune geri kazanımına yardımcı olabilir.
4. Her seti kendi otomatik numune alma cihazı cam eklerine aktarın.
  NOT: Bu setler ayrıca 384 delikli bir plakanın tek kuyucuklarında birleştirilebilir ve enjeksiyon²⁸ için doğrudan otomatik numune alma cihazına yerleştirilebilir.
5. Tüm setler birleştirildikten ve cam eklere yerleştirildikten sonra, numuneleri kurulayın.
  DURAKLAMA NOKTASI: Kurutulmuş setler, kütle spektrometresinde çalıştırılmadan önce en az 1 hafta boyunca -80 ° C'de saklanabilir.
6. LC-MS / MS analizinden önce, etiketli peptitleri yeniden askıya almak için her sete 1.2 μL% 0.1 formik asit (HPLC sınıfı suda seyreltilmiş) ekleyin.
  DİKKAT: Formik asit yanıcı bir sıvıdır. Ciddi göz hasarına veya cilt yanıklarına neden olabilir. Kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun. İyi havalandırılan bir alanda tutun.
7. Otomatik numune alma eki parçalarını cam otomatik numune alma şişelerine yerleştirin ve her numuneyi bir kapakla kapatın.
8. Yeniden süspansiyonun tamamlandığından emin olmak için her bir şişeyi 5 sn boyunca vorteks yapın ve ardından RT'de bir şişe eğirici içinde aşağı doğru döndürün.
9. Her numunenin yanlara sıçramak yerine kesici ucun altında olduğundan emin olun.
10. Şişeleri otomatik numune alma tepsisine yerleştirin.
11. Her set için, LC-MS/MS analizi için 1 μL enjekte edin.

Etiket	126	127K	127C	128K	128C	129K	129C	130K	130C	....	135K
Örnek Türü	Taşıyıcı	Referans	Boş	Boş	SC/Kontrol	SC/Kontrol	SC/Kontrol	SC/Kontrol	SC/Kontrol	....	SC/Kontrol

Tablo 2: Örnek SCoPE2 TMTpro-18plex etiketleme şeması. Taşıyıcı ve referans genellikle ilk iki TMT etiketinde etiketlenir. Daha sonra, sonraki iki etiket, kantitasyonu daha az doğru hale getirecek potansiyel izotopik kontaminasyon nedeniyle atlanır. Kalan diğer etiketler tek hücreler veya denetimler içindir.

128C

129K

129C

130K

130C

131K

131C

132K

132C

133K

133C

134K

128C

129K

129C

130K

130C

131K

131C

132K

132C

133K

133C

134K

Ben

Tablo 3: TMTpro-16plex kullanarak etiketleme için örnek plaka düzeni. 384 kuyucuklu bir plaka formatı (veya başka bir plaka formatı) kullanarak, hücrelerin sıralandığı kuyucukları rastgele sıralamak önemlidir. TMTpro-18plex için farklı bir plaka düzeni kullanılacaktır.

Representative Results

Protokolden elde edilen olumlu sonuçlar, protokoldeki bir dizi kritik adımın başarıyla gerçekleştirildiğinin doğrulanmasını gerektirir; bunlar taşıyıcının hazırlanması, tek hücreli izolasyon, lizis, sindirim, barkod etiketleme ve MS parametre optimizasyonunu içerir. DO-MS grafikleri, protokoldeki her kritik adımın tamamlanmasının kolay bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Genellikle miktar olarak 25 ve 200 hücreye karşılık gelen (set başına) başarıyla hazırlanmış bir taşıyıcı, iyi sindirilmiş ve iyi etiketlenmiştir. DO-MS'den gelen grafikler, numunenin yoğunluğunu (miktarı tahmin etmek için), sindirim verimliliğini (ideal olarak% <25 yanlış bölünmeler) ve etiketleme verimliliğini (% >99 olmalıdır) ölçmeye izin verir. En önemlisi, tamamen etiketlenmemiş taşıyıcı numuneler, tek hücreler için tasarlanan barkodlarla çapraz reaksiyona izin verebilir ve tek hücreli peptitlerin miktarına sahte bir sinyal ekleyebilir.

Negatif kontrol kuyuları tüm deneysel reaktifleri içerir, ancak bir hücreden yoksundur. Bu, sadece arka plan gürültüsünün değerlendirilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda boş bir kuyunun temsili bir sinyalini sağlayarak hücre izolasyon verimliliğinin belirlenmesini sağlar. DO-MS raporu, hücre izolasyonunun ve arka plan gürültüsünün başarısını belirlemek için tek hücreli kuyuların yanı sıra kontrolün ölçülen sinyalini iyi değerlendirmek için grafikler sunar. Ek olarak, niceliğin kalitesi SCoPE2 işlem hattı (GitHub'da mevcuttur: github.com/SlavovLab/SCoPE2) veya SCP Bioconductor paketi²⁹ kullanılarak değerlendirilebilir.

Tek hücrelerin sindirim ve etiketleme verimliliği, taşıyıcıda olduğu gibi doğrudan test edilemeyebilir, ancak DO-MS yine sindirim ve etiketleme verimliliğinin tahmin edilmesine izin veren grafikler sağlar. Tek hücrelerin hazırlanmasının yanı sıra 100-200 hücrenin kontrolünü de dahil ederek (yani, aynı reaktif ilavelerini alarak), sindirim ve etiketleme verimlilikleri bu kontrol için değerlendirilebilir ve birlikte hazırlanan tek hücreler tarafından paylaşıldığı varsayılabilir. Zayıf sindirim, karışık peptitlerin yoğunluğunun tamamen parçalanmış muadillerine yüksek bir oranı ile gösterilecektir (Şekil 1).

Kümelerde göz önünde bulundurulması gereken bir diğer faktör, eksik verilerin oranı ve her TMT kanalındaki medyan muhabir iyon yoğunluğudur (Şekil 2). Tek hücreler başarıyla hazırlandığında, hücre başına eksik veri miktarı ve pozitif kontrol, negatif kontrol örneklerinden çok daha düşüktür. Benzer şekilde, öncüllerin medyan yoğunluğu, tek hücrelerde ve pozitif kontrollerde negatif kontrollerden çok daha yüksektir. MS parametrelerinin optimizasyonu²¹ başka yerlerde kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır ve optimal parametreler DO-MS veya SCP Companion^25,27 gibi araçlar kullanılarak belirlenebilir.

Şekil 1: Taşıyıcı hazırlama kalite kontrolü. DO-MS grafikleri, (A) TMT ile etiketleme bölgelerinde başarılı bir şekilde hazırlanmış bir taşıyıcının etiketleme verimliliği: lizin yan zincirindeki birincil amin ve peptid N-terminus ve (B) triptik bölünmenin amino asit kalıntılarındaki sindirim verimliliği. Kısaltma: TMT = tandem kütle etiketi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tek hücreli hazırlama kalite kontrolü. DO-MS grafikleri, (A) tek hücrelerdeki eksik verilerin fraksiyonunu (C5-10), kontrolleri (C13,16), taşıyıcıyı (C1) ve referansı (C2) ve (B) tek hücrelerin ve kontrollerin yoğunluğunu gösterir. C3, C4, C11, C12 ve C15'e karşılık gelen 127C, 128N, 131C, 132N, 133N ve 133C etiketleri bu özel kümede kullanılmaz. Pozitif kontrol, peptitlere toplu olarak işlenen hücresel materyalden oluşur, daha sonra etiketlemeden önce 2-5 hücre / μL seviyesine seyreltilir. Negatif kontrol, tek bir hücrenin eklenmesi olmadan, tek hücreler için kullanılan tüm hazırlık adımlarına tabi tutulan bir kuyudan oluşur. Kısaltma: TMT = tandem kütle etiketi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

SCoPE2 ile tek hücrelerin başarılı bir şekilde hazırlanması ve analizinin anahtarlarından biri, taşıyıcı ve referans kanallarının hazırlanmasıdır. Önerilen taşıyıcı boyutu 100 ila 200 hücredir; Bununla birlikte, belirli bir tek hücreli deney için gereken hücre sayısı, başka bir yerde tartışıldığı gibi ilkelere dayanarak belirlenebilir²¹. Önerilen boyut için, 384 kuyucuklu plaka başına en az ~ 11.275 hücreye ihtiyaç duyulur ve bu da her kümede 200 hücreli bir taşıyıcı ve 5 hücreli referansa izin verir. İstenilen hücre popülasyonları sınırlayıcı bir faktör değilse, hata durumunda fazladan materyale sahip olmak için daha fazla hücreyi izole etmek avantajlı olabilir (bu protokolde yapıldığı gibi, 11.275 hücre yerine 22.000 hücreyi izole etmek). İstenilen plakaların sayısı için gereken taşıyıcı ve referans miktarı, peptit tanımlamasının veya niceliğinin partiler arasında farklılık göstermesine neden olabilecek herhangi bir partiden partiye varyasyonu en aza indirmek için tek bir partide hazırlanmalıdır.

Tek hücreleri 384 kuyucuklu bir plakanın kuyularına izole etmeden önce, plaka düzeninin tasarımını dikkate almak önemlidir. Her 384 kuyucuklu plaka içinde hem pozitif hem de negatif kontrollerin uygulanması tavsiye edilir. Negatif kontroller, hiçbir hücrenin eklenmediği, ancak tek hücreli kuyucuklarla aynı reaktif ilavelerine ve prosedürlerine tabi tutulduğu kuyulardır. Pozitif kontroller, tek hücreler yerine 2-5 hücreye / μL'ye seyreltilmiş hücre lizatının eklendiği kuyulardır. Bu, tek hücreli izolasyon yöntemlerinin iyi doğrulanmadığı durumlarda uygulanması özellikle önemlidir. Her 384 kuyucuklu plaka ideal olarak tek hücrelerin ve kontrollerin rastgele dağılımına sahip olmalıdır (örneğin, sadece bir satırda negatif veya pozitif kontrollere sahip olmamalıdır). Her plaka, bir plakada bir hücre tipini ve ikinci bir plakada ikinci bir hücre tipini izole etmek yerine, ilgilenilen tüm hücre popülasyonlarının eşit dağılımına sahip olmalıdır. Bu, toplu iş efektlerinin ilgilenilen hücre türleriyle ilişkilendirilmesini önleyecektir. Ek olarak, analiz için birden fazla 384 kuyucuklu plakaya ihtiyaç duyulursa, mümkünse izolasyon adımını birkaç güne yaymak yerine, hücrelerin tek bir seansta izole edilmesi önerilir.

Hem tek hücrelerin hem de taşıyıcı / referansın parçalanması, dondurucu-ısı döngüsü²³ aracılığıyla suda gerçekleşir. Bu aşamada çoğu proteazın denatüre edildiği tahmin edilmektedir. Tripsin daha sonra yüksek konsantrasyonda denatürasyon adımından hemen sonra eklenir, konsantrasyonda en bol hücresel proteazlardan bile daha büyük büyüklük sıraları vardır. Kitle etkisiyle, proteaz aktivitesinin çoğu ürünü tripsin nedeniyle olacaktır.

Bu protokolde tripsin sindiriminden önce sistein kalıntılarının azaltılması/alkillenmesi yapılmaz. Sistein içeren peptitler, insan proteomundan triptik peptitlerin kabaca% 10'unu temsil eder. İndirgeme/alkilasyon içermeyen bir yaklaşım kullanarak daha az sistein içeren peptit gözlemliyoruz. Bu adımlar, sindirimden hemen sonra TMT (NHS-ester kimyası) ile etiketleme ile uyumlu olmayan reaktifleri kullanır.

Bu TMT etiketleme stratejisinde, taşıyıcı ve referanslar sırasıyla 126 ve 127N ile etiketlenirken, tek hücreli ve kontrol kuyuları 128C ila 135N ile etiketlenmiştir. Referanstan sonraki iki etiket, 127C ve 128N, peptid materyalinde tek hücrelerden çok daha bol miktarda bulunan taşıyıcı ve referans kanallarından kaynaklanan izotopik çapraz kontaminasyon nedeniyle kullanılmaz. Toplamda, TMTpro-16plex ile tek hücreleri etiketlemek veya kuyuları kontrol etmek için kullanılabilecek set başına 12 TMT kanalı veya TMTpro-18plex ile set başına 14 TMT kanalı vardır.

Bu protokolü kullanarak tek hücreli proteomik ölçümler yapmak için protokoldeki kritik adımlar, taşıyıcının hazırlanması, tek hücreli izolasyon, lizis, çürüme, barkod etiketleme ve uygun kütle spektrometrisi parametrelerini içerir. Bu adımlar bu belgede özetlenmiştir ve^17,21,25 başka bir yerde kapsamlı bir şekilde detaylandırılmıştır. Her adım, DO-MS'de kolay kalite kontrolüne izin veren karşılık gelen bir arsa veya arsa setine sahiptir. Örneğin, taşıyıcının başarılı bir şekilde oluşturulması durumunda, tanımlanan peptitlerin sayısını, etiketleme verimliliğini ve yanlış bölünme oranının yüzdesini gösteren grafikler, başarılı bir şekilde hazırlanmasının doğrulanmasına izin verir. Temsili DO-MS raporları bu yayına dahil edilmiştir ve orijinal veriler için http://scope2.slavovlab.net/ görülebilir¹⁶. Bu DO-MS raporları, yöntemin optimizasyonunu, daha uzun LC gradyanları, farklı sindirim enzimleri veya alternatif kimyasal barkodlar gibi yazarlar tarafından henüz araştırılmamış yönlerde değerlendirmeye izin verir.

Şu anda, veriye bağımlı toplama algoritmaları ile peptitlerin seri analizi, makul uzunlukta bir LC çalışmasında analiz edilebilecek peptitlerin sayısını sınırlamaktadır. Bu kısmen, güvenilir tek hücreli niceleme için yeterli iyonun başarılı bir şekilde elde edilmesi için gereken daha uzun dolum sürelerinden kaynaklanmaktadır²¹. Taşıyıcıyı kullanmanın doğal bir sınırlaması, tek hücrelerin sindirim ve etiketleme verimliliğinin doğrudan değerlendirilmemesidir. Şu anda, bu sınırlamanın bir çözümü, tek hücrelerle birlikte işlenen daha büyük bir numune üzerinde kalite kontrolü yapmaktır.

Tek hücreli proteomikleri geliştirmek için, çoklu analizörlerle kütle spektrometreleri oluşturmak gibi bir dizi fırsat önerdik. Mevcut yöntem, tek memeli hücrelerinden binlerce proteinin, ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve ekipmanlarla günde yaklaşık 100 hücre hızında miktarının belirlenmesine izin vermektedir. SCoPE-MS yaklaşımının ikinci nesli olan SCoPE2, birim zaman başına analiz edilebilir hücre sayısı, birim zaman başına analiz edilebilir protein sayısı, numune hazırlama için gereken süre, reaktiflerin ve ekipmanın erişilebilirliği ve tek hücre başına toplam hazırlama ve analiz maliyeti açısından selefine göre önemli ölçüde iyileşmiştir. Membrana bağlı proteinlere, üre lizisi^23'e kıyasla gösterildiği gibi, dondurarak ısı lizisi ve proteaz sindirimi kullanılarak erişilebilir. Yöntem, proteomun üst üçte birinden bolluk^16'ya göre birçok proteini tanımlar. Modifiye proteoform proteomun ilk üçte birindeyse ve modifiye peptid kütle spektrometri analizine uygunsa (iyi iyonize olur, modifiye edilmemiş peptidden kütle farkı vardır), bu protokole uygun olması daha olasıdır. Bu yöntem, farklılaşma, yaşlanma veya immünolojik yanıtlar (yani fagositoz) gibi hücreler arasında anlamlı heterojenliğin olduğu biyolojik sistemlerde verimli bir şekilde uygulanabilir.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu yayını finanse eden Güz 2021 NSF I-Corps Programı (Northeastern Üniversitesi sitesi) ödülüne teşekkür ederiz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plate, standard PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB1384	Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	A955-1	This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%	Sigma Aldrich	271004-100ML	This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils	Thermo Fisher Scientific	AB0626
Autosampler vial screw thread caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)	MTC Bio	C2595	This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease	Sigma Aldrich	E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade	Thermo Fisher Scientific	85178	Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol	Sigma Aldrich	467804-50ML	Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips	Formulatrix	MCLVPR2	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips	Formulatrix	MCLVS12	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler	Formulatrix		Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling	Formulatrix	232400
MassPREP peptide mixture	Waters	186002337	Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)	USA Scientific	2621-0016	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips	USA Scientific	1402-3900	If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)	Benchmark Scientific	Model C2000	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)	Biorad	1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg	Thermo Fisher Scientific	A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5	Sigma Aldrich	T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade	Promega	V5280	This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)	VWR	Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)	VWR	97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	W6-1	All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .