Summary
يصف هذا البروتوكول طرق تقسيم وتلطيخ وتصوير أقسام الأنسجة العائمة الحرة في دماغ الفأر ، متبوعا بوصف مفصل لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتداخل أراضي الخلايا النجمية أو تبليطها.
Abstract
تمتلك الخلايا النجمية درجة مذهلة من التعقيد المورفولوجي الذي يمكنها من التفاعل مع كل نوع من الخلايا والبنية تقريبا داخل الدماغ. من خلال هذه التفاعلات ، تنظم الخلايا النجمية بنشاط العديد من وظائف الدماغ الحرجة ، بما في ذلك تكوين المشبك العصبي ، والنقل العصبي ، والتوازن الأيوني. في دماغ القوارض ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة وتنشئ مناطق متميزة وغير متداخلة لتجانب الدماغ. يوفر هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة من دماغ الفأر. أولا ، يصف هذا البروتوكول خطوات جمع الأنسجة ، والتقسيم بالتبريد ، والتلطيخ المناعي لأقسام الأنسجة العائمة الحرة. ثانيا، يصف هذا البروتوكول اكتساب الصور وتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وحجم تداخل الأراضي، باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة تجاريا. وأخيرا، تناقش هذه المخطوطة المزايا والاعتبارات الهامة والمزالق الشائعة والقيود المفروضة على هذه الأساليب. يتطلب هذا البروتوكول أنسجة المخ مع وضع علامات فلورية متفرقة أو فسيفسائية على الخلايا النجمية ، وهو مصمم للاستخدام مع معدات المختبر الشائعة ، والمجهر البؤري ، وبرامج تحليل الصور المتاحة تجاريا.
Introduction
الخلايا النجمية هي خلايا متفرعة بشكل متقن تؤدي العديد من الوظائف المهمة في الدماغ1. في قشرة الفأر ، تؤدي الخلايا الجذعية الدبقية الشعاعية إلى ظهور الخلايا النجمية خلال المراحل الجنينية المتأخرة والمبكرة بعد الولادة2. خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد ، وتطور الآلاف من الفروع الدقيقة التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي1. في الوقت نفسه ، تتفاعل الخلايا النجمية مع الخلايا النجمية المجاورة لإنشاء مناطق منفصلة وغير متداخلة لتجانب الدماغ3 ، مع الحفاظ على الاتصال عبر قنوات تقاطع الفجوة4. تتعطل مورفولوجيا الخلايا النجمية وتنظيمها في العديد من الحالات المرضية بعد الإهانة أو الإصابة5 ، مما يشير إلى أهمية هذه العمليات لوظائف الدماغ السليمة. يمكن أن يوفر تحليل الخصائص المورفولوجية للخلايا النجمية أثناء التطور الطبيعي والشيخوخة والمرض رؤى قيمة في بيولوجيا الخلايا النجمية وعلم وظائف الأعضاء. علاوة على ذلك ، يعد تحليل مورفولوجيا الخلايا النجمية بعد التلاعب الجيني أداة قيمة لتمييز الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم إنشاء وصيانة التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية.
تحليل مورفولوجيا الخلايا النجمية في دماغ الفأر معقد بسبب كل من تعقيد تفرع الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية. تلطيخ الأجسام المضادة باستخدام البروتين الحمضي الليفي الدبقي الخيطي الوسيط (GFAP) كعلامة خاصة بالخلايا النجمية يلتقط فقط الفروع الرئيسية ، ويقلل إلى حد كبير من التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية1. تقوم علامات أخرى خاصة بالخلايا مثل ناقل الغلوتامات 1 (GLT-1 ؛ slc1a2) أو جلوتامين سينثيتاز أو S100β بعمل أفضل في وضع العلامات على فروع الخلايا النجمية6 ، ولكنها تقدم مشكلة جديدة. مناطق الخلايا النجمية غير متداخلة إلى حد كبير ، ولكن توجد درجة صغيرة من التداخل عند الحواف الطرفية. بسبب تعقيد التفرع ، عندما يتم تصنيف الخلايا النجمية المجاورة بنفس اللون ، من المستحيل التمييز بين المكان الذي تنتهي فيه إحدى الخلايا النجمية وتبدأ الأخرى. إن وضع العلامات المتناثرة أو الفسيفسائية للخلايا النجمية مع البروتينات الفلورية الذاتية المنشأ يحل كلتا المشكلتين: تملأ علامة الفلورسنت الخلية لالتقاط جميع الفروع وتسمح بتصوير الخلايا النجمية الفردية التي يمكن تمييزها عن جيرانها. تم استخدام العديد من الاستراتيجيات المختلفة لتحقيق وضع العلامات الفلورية المتناثرة للخلايا النجمية ، مع أو بدون التلاعب الجيني ، بما في ذلك الحقن الفيروسي ، أو كهربية البلازميد ، أو خطوط الفئران المعدلة وراثيا. يتم وصف تفاصيل تنفيذ هذه الاستراتيجيات في الدراسات والبروتوكولات المنشورة سابقا1،7،8،9،10،11،12،13.
توضح هذه المقالة طريقة لقياس حجم مساحة الخلايا النجمية من أدمغة الفئران باستخدام وسم الفلورسنت في مجموعة متفرقة من الخلايا النجمية (الشكل 1). نظرا لأن متوسط قطر الخلايا النجمية في قشرة الفأر يبلغ حوالي 60 ميكرومتر ، يتم استخدام أقسام بسماكة 100 ميكرومتر لتحسين الكفاءة في التقاط الخلايا النجمية الفردية بالكامل. التلطيخ المناعي غير مطلوب ولكن يوصى به لتعزيز إشارة الفلورسنت الذاتية المنشأ للتصوير والتحليل البؤري. قد يتيح التلطيخ المناعي أيضا كشفا أفضل لفروع الخلايا النجمية الدقيقة ويقلل من التبييض الضوئي للبروتينات الداخلية أثناء الحصول على الصورة. لتحسين تغلغل الأجسام المضادة في الأقسام السميكة ، وللحفاظ على حجم الأنسجة من التقسيم من خلال التصوير ، يتم استخدام أقسام الأنسجة العائمة بحرية. يتم إجراء تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح تجاريا. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة لتحليل بلاط الخلايا النجمية في أقسام الأنسجة مع وضع علامات الفسيفساء ، حيث تعبر الخلايا النجمية المجاورة عن تسميات فلورية مختلفة. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح في العديد من الدراسات الحديثة1،8،9 لتوصيف نمو الخلايا النجمية أثناء نمو الدماغ الطبيعي ، وكذلك تأثير التلاعب الجيني على تطور الخلايا النجمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استخدام جميع الفئران وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل وقسم الطب المقارن (بروتوكول IACUC رقم 21-116.0). تم استخدام الفئران من كلا الجنسين في اليوم 21 بعد الولادة (P21) لهذه التجارب. تم الحصول على الفئران CD1 تجاريا (جدول المواد) ، وتم وصف الفئران MADM9 WT: WT و MADM9 WT: KO سابقا9.
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول أدمغة ذات تعبير بروتين فلورسنت في مجموعة قليلة من الخلايا النجمية. يمكن إدخال تعبير البروتين الفلوري وراثيا أو فيروسيا أو عن طريق الكهروبورات. تم وصف تفاصيل طرق تسمية الخلايا النجمية بشكل ضئيل في الدراسات والبروتوكولات المنشورة سابقا1،7،8،9،10،11،12،13.
1. جمع الأنسجة وإعدادها
تحذير: بارافورمالدهيد (PFA) مادة كيميائية خطرة. نفذ جميع الخطوات باستخدام PFA في غطاء الدخان الكيميائي.
- تخدير الفئران بمخدر قابل للحقن (على سبيل المثال ، Avertin؛ 0.8 مجم / كجم) وضمان عمق التخدير مع قرصة إصبع القدم. استخدم مضخة تمعجية لإجراء التروية داخل القلب باستخدام محلول ملحي مخزن بالثلج (TBS) + الهيبارين بمعدل ~ 3 مل / دقيقة حتى يصبح الكبد صافيا (عادة 3-5 دقائق) ، يليه 4٪ PFA بارد في TBS بمعدل ~ 3 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يتم تحسين معدل التدفق والأوقات للفئران بعد يوم 21 (P21) بعد الولادة. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على معدل التدفق ووقت التروية للفئران من مختلف الأعمار. - بعد التروية ، استخدم زوجا من مقص التشغيل لفصل الرأس وإزالة الجلد لفضح الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم زوجا من مقص التشريح الدقيق لإزالة الجزء العلوي من الجمجمة لفضح الدماغ. استخدم زوجا من الملقط أو ملعقة صغيرة لإزالة الدماغ ونقله إلى أنبوب يحتوي على 4٪ PFA بارد واحتضانه بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تأكد من استخدام أنبوب ذو قاع مسطح ، مثل قارورة تلألؤ 7 مل ، بحيث لا يصبح الدماغ إسفينيا في قاع الأنبوب ، مما قد يضغط على الأنسجة ويغير حجم الخلايا النجمية. - في اليوم التالي ، صب PFA من الأنبوب. أضف 5 مل من 1x TBS إلى الأنبوب لشطف الدماغ وإزالة PFA المتبقية. اسكب السل وكرر هذه العملية مرتين أخريين لما مجموعه ثلاث غسلات.
- أضف 4-5 مل من 30٪ من السكروز في TBS واحتضن الدماغ عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام ، أو حتى يغرق الدماغ في قاع الأنبوب.
ملاحظة: تكون الأدمغة جاهزة للتجميد بمجرد غرقها ولكن يمكن تخزينها في محلول السكروز عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع. - تحضير وسط التجميد في أنبوب 50 مل عن طريق خلط 15 مل من مركب درجة حرارة القطع المثلى 100٪ (OCT) مع 30 مل من السكروز 30٪ في TBS. اخلطي على الجوز أو الخلاط المداري لمدة 1 ساعة على الأقل لضمان خلط المحلول بالكامل. حافظ على الأنبوب في وضع مستقيم لمدة ساعة إضافية للسماح لأي فقاعات بالارتفاع إلى السطح.
ملاحظة: يمكن تحضير وسط التجميد مسبقا وتخزينه في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع. - استخدم ماصة مصلية لإضافة وسط تجميد إلى قالب تضمين مربع (جدول المواد). احرص على تجنب إدخال الفقاعات إلى الوسط. بالنسبة لدماغ الماوس P21 ، يكفي 3 مل. اضبط مستوى الصوت حسب الحاجة لمختلف الأعمار بحيث يكون الدماغ مغمورا تماما.
- أضف الدماغ إلى الوسط واستخدم زوجا من الملقط رقم 5 لإزالة أي جذع دماغي قد يمنع الدماغ من الجلوس بشكل مسطح في القالب. اصطف الجزء الأمامي من الدماغ بحافة واحدة من القالب.
- انقل القالب إلى سطح مستو مبرد بالثلج الجاف. علبة غداء معدنية مليئة بالثلج الجاف تعمل بشكل جيد لهذا الغرض. أحط القالب بكريات الثلج الجاف لضمان بطء وحتى التجميد.
- بمجرد أن يصبح وسط التجميد أبيض وصلبا تماما ، قم بتخزين القالب عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الأدمغة عند -80 درجة مئوية لعدة سنوات.
2. التكسير
ملاحظة: تهدف طريقة التقسيم هذه إلى العمل مع العديد من منظمات التبريد المختلفة المتاحة تجاريا. مع cryostat المستخدمة هنا (جدول المواد) ، فإن درجة حرارة قطع رأس العينة المثلى هي -23 درجة مئوية ، مع درجة حرارة الغرفة المحيطة بين -23 درجة مئوية و -25 درجة مئوية.
تنبيه: شفرة cryostat حادة للغاية. توخ الحذر أثناء التلاعب بالشفرة وتشغيل قاعدة التبريد.
- تحضير وسط التقسيم عن طريق خلط 25 مل من 1x TBS و 25 مل من الجلسرين في أنبوب 50 مل. من الأسهل إضافة الجلسرين عن طريق سكبه مباشرة في الأنبوب واستخدام العلامات الموجودة على الأنبوب للقياس. رج / دوامة الأنبوب للخلط. يمكن تخزين هذا الحل في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
- استعد لجمع أقسام الأنسجة عن طريق إضافة 2 مل من وسط التقسيم لكل بئر إلى لوحة من 12 بئرا. قم بتسمية الجزء العلوي والسفلي من اللوحة بمعلومات العينة. ضع اللوحة، جنبا إلى جنب مع غيرها من الإمدادات (شفرة cryostat ، شفرة الحلاقة ، تشاك ، وفرش الطلاء) ، مباشرة في cryostat ، واسمح لهم بالتأقلم مع درجة الحرارة لمدة 5 دقائق تقريبا.
- حرك الأدمغة إلى غرفة التبريد واسمح لها بالتأقلم مع درجة الحرارة مع الإمدادات.
- قم بإزالة كتلة الأنسجة المجمدة من القالب عن طريق قطع زاويتين من القالب باستخدام شفرة حلاقة وتقشير القالب بعيدا عن الأنسجة. قم بتوجيه الكتلة بحيث تكون مقدمة الدماغ متجهة لأعلى.
- أضف OCT إلى الظرف بحيث يتم تغطية ~ 2/3 من الظرف ب OCT ووضع كتلة الأنسجة على الفور على الظرف ، مع الحفاظ على الاتجاه الموضح أعلاه. اضغط على الكتلة لأسفل في OCT بحيث تكون مسطحة على سطح الظرف.
- بمجرد تجميد OCT بالكامل وتكون كتلة الأنسجة في مكانها بشكل آمن ، قم بتثبيت الظرف على رأس العينة. أدخل شفرة cryostat واجعل الشفرة قريبة من العينة.
- قم بتقليم الدماغ على فترات 100 ميكرومتر حتى قبل الوصول إلى منطقة الدماغ ذات الاهتمام. لتقليل كمية OCT التي تذوب في وسائط التقسيم ، استخدم شفرة حلاقة لتقليم وسط التجميد الزائد من جوانب كتلة الأنسجة.
- بمجرد الوصول إلى المنطقة ذات الأهمية ، ابدأ في جمع أقسام بسماكة 100 ميكرومتر. اجمع المقاطع إما باستخدام اللوحة المضادة للتدحرج أو عن طريق التقدم ببطء إلى cryostat بيد واحدة أثناء استخدام فرشاة الطلاء في اليد الأخرى لتوجيه القسم خارج الكتلة أثناء تلبسه بالشفرة. إذا كان نموذج cryostat يحتوي على دواسة ، فاستخدم الدواسة لدفع cryostat بحيث يمكن استخدام كلتا اليدين لتوجيه القسم خارج الكتلة.
- انقل الأقسام إلى لوحة 12 بئرا باستخدام فرشاة طلاء أو ملقط. يمكن لكل بئر أن تستوعب ما لا يقل عن 10-12 قسما. عند إضافة القسم إلى الوسط ، يكفي عادة لمس الحافة السفلية للقسم إلى وسط التقسيم والسماح للقسم بالذوبان في الوسط دون الحصول على الفرشاة أو الملقط مبللا. إذا لمست الفرشاة الوسط ، فتأكد من تجفيفه بمنشفة ورقية أو منديل ورقي ، لأن الفرشاة المبللة بشكل مفرط ستجعل من الصعب نقل أقسام الأنسجة.
- قم بتأمين اللوحة عن طريق لفها بورق القصدير أو فيلم البارافين. تأكد من تسميته بوضوح ، ثم قم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: بالنسبة لمعظم بروتوكولات التلطيخ ، يمكن تخزين الأقسام عند -20 درجة مئوية لمدة 1-2 سنوات على الأقل دون فقدان كبير للإشارة.
3. تلطيخ المناعة
ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات الغسيل والحضانة على شاكر منصة مدارية تم ضبطه على حوالي 100 دورة في الدقيقة. يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ، باستثناء حضانة الأجسام المضادة الأولية ، والتي يتم تنفيذها عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد وسائط التركيب في وقت مبكر عن طريق الجمع بين المكونات في أنبوب سعة 50 مل والخلط على المغذيات طوال الليل. حماية من الضوء وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر. إذا كانت إشارة الفلورسنت الداخلية كافية للتصوير والتحليل دون الحاجة إلى تلطيخ مناعي ، فيمكن تخطي الخطوات 3.1-3.9. في حالة تخطي التلطيخ المناعي ، قم بإجراء ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق في TBS وانتقل إلى الخطوة 3.10.
- قم بإعداد محلول جديد من TBST (0.2٪ Triton in TBS) عن طريق إضافة 1 مل من 10٪ Triton-X إلى أنبوب 50 مل وملء الأنبوب إلى 50 مل ب 1x TBS. قم بإعداد 2 مل من المحاليل المانعة والأجسام المضادة (10٪ مصل الماعز في TBST) لكل دماغ.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، اصنع TBST طازجا لكل تجربة تلطيخ جديدة واستخدم مصدرا عالي الجودة من Triton-X المائي بنسبة 10٪ (جدول المواد). - قم بتسمية لوحة من 24 بئرا وفقا للمخطط (الشكل 1). ضع عينات مختلفة في صفوف مختلفة، وحلولا مختلفة في أعمدة مختلفة. أضف 1 مل من TBST إلى الأعمدة الثلاثة الأولى ("Wash 1" و "Wash 2" و "Wash 3"). أضف 1 مل من حل الحظر إلى العمود الرابع.
- قم بإعداد قطف زجاجي عن طريق إذابة نهاية ماصة 5.75 في باستور في خطاف صغير باستخدام موقد بنسن. استخدم هذا الاختيار لنقل مقاطع الأنسجة من اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى عمود Wash 1 من اللوحة ذات ال 24 بئرا.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بفحص الأقسام قبل البدء في تلطيخها. لفحص الأقسام، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى إلى طبق بتري مملوء ب 1x TBS وافحص الأقسام باستخدام مجهر الفلورسنت بهدف 5x أو 10x لضمان وجود عدد كاف من الخلايا المصنفة بالفلورسنت. يوصى بتلطيخ أربعة إلى ستة أقسام لكل بئر ، على الرغم من أن ما يصل إلى ثمانية أقسام لكل بئر قد تكون ملطخة إذا لزم الأمر. - اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق لكل منها في بئر Wash 1 و 2 و 3 ، متبوعا باحتضان الأقسام لمدة 1 ساعة في محلول الحظر. استخدم اللقطة الزجاجية لنقل الأقسام من بئر إلى آخر. يمكن استخدام الاختيار لنقل أقسام متعددة من الدماغ في وقت واحد.
- قم بإعداد 1 مل من محلول الأجسام المضادة الأساسي لكل عينة (على سبيل المثال ، Rabbit RFP 1: 2000 أو Chicken GFP 1: 2000). أضف الجسم المضاد إلى محلول الأجسام المضادة ، دوامة لفترة وجيزة ، ثم جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند ≥ 4000 × g عند 4 درجات مئوية. احتضن الأقسام في الأجسام المضادة الأولية لمدة ليلتين إلى ثلاث ليال عند 4 درجات مئوية أثناء الاهتزاز.
- بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بشفط اليوم 1 TBST من آبار الغسيل ، وأضف 1 مل من TBST الجديد إلى كل غسل جيدا ، وانقل الأقسام إلى البئر الأول للغسيل. اغسل الأقسام 3x لمدة 10 دقائق لكل منها.
ملاحظة: للشفط ، استخدم ماصة 9 في باستور متصلة بأنابيب إلى قارورة فراغ. يمكن استخدام خطوط التفريغ المنزلية أو مضخة التفريغ الكهربائية كمصدر فراغ. - أثناء غسل الأقسام ، قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 1:200 عن طريق إضافة أجسام مضادة إلى محلول الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، الماعز المضاد للأرانب 594 ، أو الماعز المضاد للدجاج 488). دوامة لفترة وجيزة ، ثم تدور لمدة 5 دقائق عند ≥ 4000 × غرام عند 4 درجات مئوية.
- احتضان الأقسام في الأجسام المضادة الثانوية لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. حماية الأقسام من الضوء خلال هذه الخطوة وجميع الخطوات التالية للتخفيف من تبييض الأجسام المضادة الثانوية.
- بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، قم بشفط اليوم 2 TBST من آبار الغسيل ، وأضف 1 مل من TBST الجديد إلى كل غسل جيدا ، وانقل الأقسام إلى الغسيل الأول جيدا. اغسل الأقسام 3x في TBST لمدة 10 دقائق لكل منها.
- أثناء الغسيل النهائي ، أخرج وسائط التركيب من 4 درجات مئوية واتركها تدفئ إلى درجة حرارة الغرفة. تحضير خليط 2: 1 من 1x TBS: dH2O وإضافته إلى طبق بتري. قم بإعداد شريحة مجهرية بإضافة 800 ميكرولتر من 2: 1 TBS: dH2O إلى السطح.
ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام وسائط تركيب غير معالجة. يمكن أن يؤدي تصلب وسائط التركيب إلى تغيير حجم الأنسجة مما قد يربك تحليل حجم منطقة الخلايا النجمية. يتم توفير وصفة لوسائط تركيب محلية الصنع بسيطة وغير مكلفة في جدول المواد. - باستخدام فرشاة طلاء ناعمة، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى من Wash 3 جيدا إلى طبق Petri. تزيل هذه الخطوة التريتون وتساعد الأقسام على التسطيح. بعد ذلك ، انقل الأقسام من طبق بتري إلى السائل الموجود على الشريحة.
- استخدم فرشاة طلاء للمساعدة في ترتيب الأقسام بحيث تكون مسطحة على الشريحة. قم بإزالة السائل الزائد بعناية من الشريحة باستخدام ماصة P1000 ، متبوعة بشفط الفراغ.
ملاحظة: أضف طرف ماصة P200 إلى نهاية ماصة باستور للتحكم بشكل أدق في شفط الفراغ. - بمجرد إزالة كل السائل الزائد من الشريحة ، استخدم ماصة نقل لإضافة قطرة واحدة من وسائط التركيب على الفور إلى كل قسم ووضع غطاء برفق فوق الشريحة. اسمح لوسائط التركيب بالانتشار لبضع دقائق، ثم قم بإزالة أي وسائط تركيب زائدة تخرج من تحت الغطاء عن طريق الشفط الفراغي.
ملاحظة: لا تسمح للأقسام في أي وقت بالجفاف قبل إضافة وسائط التركيب. إذا بدأت الأقسام في الجفاف قبل إضافة وسائط التركيب ، فقد يؤثر ذلك على حجم الأنسجة ويعيق جمع البيانات بدقة. - أغلق جميع الحواف الأربعة للغطاء بطلاء أظافر شفاف. اترك الشرائح تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتخزينها بشكل مسطح عند 4 درجات مئوية. انتظر 2 ساعة على الأقل قبل التصوير ، أو الصورة في اليوم التالي.
ملاحظة: يمكن تخزين الأقسام الملطخة بالأجسام المضادة ضد GFP و RFP لمدة تصل إلى 2 أسابيع قبل التصوير ، شريطة أن تكون مغلقة تماما بطلاء الأظافر.
4. التصوير البؤري
ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول إرشادات عامة للحصول على الصور تنطبق على نطاق واسع على المجاهر البؤرية المختلفة، بدلا من تفاصيل محددة لواجهة بؤرية وبرمجية معينة.
- استخدم هدفا 10x لتحديد موقع الخلايا الفردية للتصوير ، مع ملاحظة منطقة الدماغ المحددة أو المنطقة الفرعية (على سبيل المثال ، الطبقة 5 من القشرة البصرية) كما هو مناسب للتجربة. استخدم مقبض التركيز البؤري لمحاولة تحديد ما إذا كانت الخلايا النجمية بأكملها موجودة داخل القسم.
- قم بالتبديل إلى هدف زيت تكبير أعلى (على سبيل المثال، 40x أو 60x أو 63x) واجعل الخلية في بؤرة التركيز. أثناء النظر من خلال العدسة ، استخدم مقبض التركيز البؤري للانتقال من أعلى الخلية إلى أسفلها.
- افحص الخلية بصريا للتأكد من احتواء الخلية بأكملها داخل القسم. إذا خرجت الخلية فجأة عن التركيز البؤري وتم قطعها عند حافة القسم، فاستبعد هذه الخلية وحدد موقع خلية أخرى.
- باستخدام برنامج الاقتناء المرتبط بالمجهر البؤري ، اضبط معلمات الاقتناء للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مناسبة ومستوى من التفاصيل (ستوفر دقة 512 × 512 تفاصيل كافية لتحليل المنطقة وستقلل من وقت الحصول على الصورة). استخدم التكبير/التصغير بمعدل 2x في حالة استخدام هدف 40x، ولا يمكنك استخدام هدف 60x أو 63x.
- اضبط الحدود العلوية والسفلية للمكدس z. لضمان التقاط الخلايا النجمية بأكملها ، يجب ألا تحتوي الصور الأولى والأخيرة للمكدس z على أي وسم فلورسنت للخلية. للحصول على عينات كافية ، استخدم حجم خطوة 0.5 ميكرومتر.
5. تحليل الصور
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول خطوات إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح تجاريا (أي Imaris؛ انظر جدول المواد). يمكن استخدام إصدارات أخرى من هذا البرنامج مع تعديلات طفيفة على سير العمل. يتطلب هذا البروتوكول أيضا MATLAB لتشغيل ملف Hull XTension المحدب (ملف تكميلي).
- قبل البدء في التحليل، قم بتثبيت الملف المحدب هال XTension XTSpotsConvexHull.m عن طريق لصق الملف في المجلد الفرعي rtmatlab من المجلد XT.
- استخدم محول ملفات Imaris لتحويل الصور إلى تنسيق ".ims". افتح ملف صورة في برنامج تحليل الصور واعرض الصورة في وضع العرض ثلاثي الأبعاد عن طريق تحديد زر عرض 3D .
- قبل التحليل، افحص الخلية للتأكد من أنها تفي بمعايير التضمين.
- تأكد من وجود الخلية بأكملها داخل الصورة (أي أنه لا ينبغي قطع أي جزء من الخلية من الصورة). قم بتدوير الصورة لفحص الحواف الأمامية والخلفية.
- تأكد من أن الخلية تحتوي على جسم خلية واحد فقط. انقر فوق الزر شريحة ، واسحب المؤشر على يسار الشاشة للتنقل عبر مكدس z ، وتحقق من أن الخلية المصنفة تحتوي على جسم خلية واحد فقط.
- تأكد من وجود خلية نجمية فردية يمكن تمييزها عن أي خلايا نجمية مجاورة تحمل نفس اللون.
- إنشاء سطح
- مع تحديد زر 3D View مرة أخرى ، قم بإنشاء سطح جديد بالنقر فوق رمز إضافة أسطح جديدة باللون الأزرق .
- في علامة التبويب إنشاء التي تظهر في أسفل يمين نافذة البرنامج، تأكد من تحديد المربعات فقط تقسيم منطقة اهتمام وإحصائيات كائن كائن فقط لإعدادات الخوارزمية، ومن عدم تحديد مربع بدء الإنشاء باستخدام طريقة عرض مقسم طريقة العرض لتفضيلات الإنشاء . انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
ملاحظة: قد لا تكون هناك حاجة إلى منطقة ذات أهمية إذا لم تكن هناك إشارة فلورسنت إضافية في الصورة خارج خلية الاهتمام. في هذه الحالة، اترك الشريحة منطقة اهتمام فقط دون تحديد وانتقل إلى الخطوة 5.4.3.
- في علامة التبويب إنشاء التي تظهر في أسفل يمين نافذة البرنامج، تأكد من تحديد المربعات فقط تقسيم منطقة اهتمام وإحصائيات كائن كائن فقط لإعدادات الخوارزمية، ومن عدم تحديد مربع بدء الإنشاء باستخدام طريقة عرض مقسم طريقة العرض لتفضيلات الإنشاء . انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
- قم بإنشاء منطقة ذات أهمية حول الخلية عن طريق إدخال الأبعاد في المربعات ضمن حجم أداة إنشاء Surface ، أو سحب حواف المربع الأصفر (الشكل 2A). انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
- حدد قناة المصدر الصحيحة من القائمة المنسدلة للتحليل (على سبيل المثال، القناة 1، أو القناة التي تحتوي على تعبئة خلية الفلورسنت). يتم تحديد القيمة في مربع تفاصيل الأسطح بواسطة البرنامج واستنادا إلى معلمات الحصول على الصور. تأكد من أن هذه القيمة تظل ثابتة لجميع العينات في التجربة. انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
- اضبط العتبة (الكثافة المطلقة) عن طريق سحب الشريط الأصفر أو عن طريق إدخال القيم في المربع بحيث يملأ السطح الرمادي أكبر قدر ممكن من إشارة الخلية دون تجاوز حدود الخلية. ستكون كمية صغيرة من إشارة الفلورسنت مرئية عند حواف السطح (الشكل 2B). انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
- تقوم اللوحة الأخيرة من أداة Surface Creation بتعيين الحد الأدنى لقيمة الجودة، وهي قيمة العتبة الدنيا الافتراضية للبرنامج. في القائمة المنسدلة، تأكد من تحديد عدد Voxels Img=1. تحقق من أن زر الطاقة الأيسر فقط للعتبة الدنيا أخضر (نشط)؛ يجب أن يكون زر الطاقة الأيمن أحمر (غير نشط). يقوم البرنامج افتراضيا بقيمة العتبة الدنيا إلى 10. اترك هذا دون تغيير وانقر على السهم الأخضر لإنهاء توليد السطح.
- افحص السطح الذي تم إنشاؤه حديثا بعناية. احذف أي قطع سطحية ليست جزءا من الخلية عن طريق تحديدها ، والنقر فوق أداة تحرير القلم الرصاص ، والنقر فوق الخيار حذف .
- قم بتوحيد القطع السطحية المتبقية من خلال النقر على أيقونة مرشح القمع لتحديد الكل ، والنقر فوق رمز تحرير القلم الرصاص ، والنقر فوق خيار توحيد (الشكل 2C).
ملاحظة: مع ملف صورة كبير، قد يتعطل البرنامج أحيانا أثناء الخطوات اللاحقة لهذا البروتوكول. من الجيد حفظ الملف في هذه المرحلة.
- مع تحديد زر 3D View مرة أخرى ، قم بإنشاء سطح جديد بالنقر فوق رمز إضافة أسطح جديدة باللون الأزرق .
- توليد بقع قريبة من السطح
- انقر على أيقونة إضافة بقع جديدة باللون البرتقالي . مع تحديد البقع الجديدة (على سبيل المثال، "النقاط 1") في علامة التبويب إنشاء ، تأكد من تحديد المربع إحصائيات الكائن الكائن فقط لإعدادات الخوارزمية، وإلغاء تحديد مربع بدء الإنشاء باستخدام طريقة عرض مقسم طريقة العرض لتفضيلات الإنشاء . انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
- حدد قناة المصدر الصحيحة من القائمة المنسدلة (على سبيل المثال، القناة 1)، ثم أدخل قيمة قطر XY المقدر 0.400 ميكرومتر في المربع. تأكد من تحديد مربع طرح الخلفية فقط. انقر على السهم الأزرق للمتابعة.
ملاحظة: 0.400 ميكرومتر مناسب لصور 1024 × 1024 أو 512 × 512 باستخدام هدف 63x أو 60x أو 40x. بالنسبة لظروف التصوير الأخرى ، يجب تحديد القطر بناء على ظروف التصوير ويظل ثابتا طوال جميع التحليلات. ستخلق القيمة المناسبة نقاطا كافية لتغطية جميع الإشارات الإيجابية ولكنها لن تضيف نقاطا على إشارة الخلفية. - تقوم اللوحة الأخيرة من أداة Spot Creation بتعيين الحد الأدنى لقيمة الجودة ، وهي قيمة العتبة الدنيا الافتراضية للبرنامج ؛ تأكد من أن هذه القيمة لا تتغير ما لم يكن هناك اختلاف ملحوظ في موضع / توزيع البقع (على سبيل المثال ، بسبب تلطيخ رديء الجودة). انقر على السهم الأخضر لإنهاء إنشاء البقع.
- لعرض البقع بشكل أفضل، قم بتغيير شفافية السطح عن طريق تحديد Surface والنقر فوق أداة الألوان متعددة الألوان. ضمن المادة، حدد المادة التي تجعل السطح شفافا بما يكفي لعرض البقع في جميع أنحاء الخلية (المادة الرابعة إلى الأخيرة في القائمة) (الشكل 2D,E).
- أعد تحديد البقع، وانقر على أيقونة التصفية وحدد أقصر مسافة إلى الأسطح = الأسطح X، حيث "الأسطح X" هي السطح الذي يتم تحليله (على سبيل المثال، الأسطح 1)، من القائمة المنسدلة. تأكد من أن زري طاقة العتبة السفلى والعتبة العليا أخضر (نشط).
- أدخل مسافة لا تقل عن -1.0 ميكرومتر (مسافة البقع من داخل السطح) في مربع العتبة السفلى، ومسافة قصوى قدرها 0.1 ميكرومتر (المسافة من الخارج) في مربع العتبة العليا. انقر فوق الزر تكرار التحديد إلى بقع جديدة لإنهاء إنشاء بقع قريبة من السطح.
ملاحظة: قد تختلف قيم المسافة الدنيا والقصوى باختلاف معلمات الحصول على الصورة، مثل الهدف والتكبير/التصغير والدقة. يجب تحديد هذه الأرقام تجريبيا. يساعد السطح الشفاف في الحكم على ما إذا كانت القيم تلتقط جميع البقع التي تمثل شكل السطح بدقة.
- أدخل مسافة لا تقل عن -1.0 ميكرومتر (مسافة البقع من داخل السطح) في مربع العتبة السفلى، ومسافة قصوى قدرها 0.1 ميكرومتر (المسافة من الخارج) في مربع العتبة العليا. انقر فوق الزر تكرار التحديد إلى بقع جديدة لإنهاء إنشاء بقع قريبة من السطح.
- توليد بدن محدب وجمع قياس المنطقة
- تأكد من تحديد البقع التي تم إنشاؤها حديثا في اللوحة العلوية اليسرى من نافذة البرنامج (على سبيل المثال، "تحديد النقاط 1 ['أقصر مسافة...]"). انقر فوق رمز أدوات الترس ، ثم المكون الإضافي Convex Hull . انقر فوق المكون الإضافي مرة واحدة فقط وانتظر حتى تظهر نافذة MATLAB ثم تختفي (قد يستغرق ذلك عدة ثوان). سيظهر هيكل صلب في عرض 3D.
- في اللوحة العلوية اليمنى، حدد تحديد الهيكل المحدب للبقع X ["أقصر مسافة...]، حيث "تحديد البقع X" هو البقع التي تم إنشاؤها حديثا (على سبيل المثال، تحديد البقع 1)، ثم انقر فوق الهيكل لتحديده (الشكل 2F).
- انقر على أيقونة إحصائيات الرسم البياني، واختر علامة التبويب التحديد ، وتأكد من تحديد قيم محددة من القائمة المنسدلة العلوية، ثم اختر مستوى الصوت من القائمة المنسدلة السفلية. سجل حجم الهيكل. احفظ الملف وانتقل إلى الصورة التالية.
- قياس حجم تداخل الأراضي للخلايا المجاورة ذات التسميات الفلورية المختلفة
ملاحظة: يمكن استخدام هذا القسم من البروتوكول إذا كانت العينات تحتوي على خلايا نجمية مجاورة تعبر عن تسميات فلورسنت مميزة (على سبيل المثال، Astrocyte 1 يعبر عن GFP فقط و Astrocyte 2 يعبر عن RFP فقط). تم تحقيق هذا التصنيف باستخدام استراتيجيات فيروسية أو جينية كما هو موضح سابقا 9,10 (الشكل 3A).- باستخدام الخطوات المفصلة في الخطوات 5.4-5.6 ، قم بإنشاء السطح والبقع القريبة من السطح والهيكل المحدب لكل خلية نجمية (الشكل 3B).
- مع تحديد Huvex Hull of Spots 1 ... ، انقر فوق رمز تحرير القلم الرصاص وانقر فوق تحديد القناع. في نافذة قناة القناع ، تأكد من تحديد القناة 1 (أو القناة التي تمثل الخلايا النجمية 1 ) وتأكد من تحديد المربع المجاور للقناة المكررة قبل تطبيق خيار القناع . انقر فوق موافق لإنشاء قناة مقنعة CH1.
- مع بدن محدب من البقع 2 اختيار... محدد ، انقر فوق رمز تحرير القلم الرصاص وانقر فوق تحديد القناع. في نافذة قناة القناع، حدد القناة 2 (أو القناة التي تمثل الخلايا النجمية 2) من القائمة المنسدلة وتأكد من تحديد المربع المجاور للقناة المكررة قبل تطبيق خيار القناع. انقر فوق موافق لإنشاء قناة مقنعة CH2 (الشكل 3C).
- انقر فوق الزر Coloc في الجزء العلوي من الشاشة واستخدم أداة Coloc لإنشاء قناة تعريب مشتركة للقناتين المقنعتين. اضبط القناة A على القناة 3 - CH1 المقنعة والقناة B على القناة 4 - CH2 المقنعة (الشكل 3D).
- اسحب شريط الرسم البياني الأصفر إلى اليسار لكلتا القناتين. استخدم طريقة عرض الشريحة أدناه لمراقبة إشارة التوطين المشترك، والتي ستكون مرئية باللون الرمادي. لاحظ أنه نظرا لأن الإشارات الفلورية للخليتين ليست في الواقع مشتركة ، فستحتاج العتبة إلى نقلها إلى اليسار بحيث تبدأ التوطين المشترك الزائف في الظهور عند نقاط اتصال الخلايا الخلوية.
- انقر فوق بناء قناة Coloc على الجانب الأيمن لإكمال العملية. انقر فوق طريقة العرض ثلاثية الأبعاد للعودة إلى طريقة العرض ثلاثية الأبعاد القياسية. ستكون قناة نتائج التوطين المشترك مرئية الآن باللون الرمادي وتظهر في مربع ضبط العرض.
- قم بإنشاء السطح والبقع القريبة من السطح والهيكل المحدب لقناة نتيجة التوطين المشترك باستخدام الخطوات الموضحة في 5.4-5.7 (الشكل 3E ، F).
- سجل حجم الهيكل المحدب. هذا هو حجم تداخل الأراضي. اقسم هذا الرقم على حجم أراضي إحدى الخلايا النجمية لحساب النسبة المئوية لتداخل الأراضي. اختر عنصر التحكم أو الخلايا النجمية من النوع البري إذا تم التلاعب بإحدى الخلايا النجمية وراثيا فيما يتعلق بالأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويقدم الشكل 1 مخططا تخطيطيا للخطوات الرئيسية وسير العمل لهذا البروتوكول. يوضح الشكل 2 لقطات شاشة للخطوات الرئيسية باستخدام برنامج تحليل الصور لإنشاء سطح ، وتوليد بقع قريبة من السطح ، وإنشاء بدن محدب. يوضح الشكل 3 تطبيق هذه التقنية لتحديد تداخل/تبليط أراضي الخلايا النجمية. في الشكل 4، توضح النتائج التمثيلية من مخطوطة منشورة سابقارقم 9 تطبيق هذا البروتوكول. في الشكل 4A والشكل 4B ، فإن ضربة قاضية لجزيء التصاق الخلايا المخصب بالخلايا النجمية hepaCAM يقلل بشكل كبير من حجم منطقة الخلايا النجمية. في الشكل 4C والشكل 4D ، تم استخدام تحليل الفسيفساء باستخدام علامات مزدوجة (MADM) لإدخال علامات فسيفساء متفرقة وتعديل وراثي متزامن في قشرة الفأر. مع MADM ، تم توليد الفئران حيث تعبر الخلايا النجمية من النوع البري عن بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) والخلايا النجمية Hepacam بالضربة القاضية عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه ، تم حساب النسبة المئوية لتداخل الأراضي بين أزواج الخلايا النجمية RFP و GFP المجاورة (WT: KO). كعنصر تحكم ، تمت مقارنة هذا بأزواج الخلايا النجمية RFP و GFP المجاورة في الفئران دون أي تعديل وراثي ل Hepacam (WT: WT). أظهرت أزواج الخلايا النجمية WT:KO زيادة كبيرة في نسبة تداخل الأراضي مقارنة بأزواج الخلايا النجمية WT:WT. بشكل جماعي ، تظهر هذه النتائج أن hepaCAM مطلوب لحجم منطقة الخلايا النجمية الطبيعي وبلاط الخلايا النجمية.
الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل لتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية . (أ) يتطلب البروتوكول فأرة مع وضع علامات فلورية متفرقة أو فسيفسائية للخلايا النجمية. (ب) يتم اختراق الفأر ثم يتم استئصال الدماغ ومعالجته وتجميده. (ج) يتم تقسيم الدماغ المجمد باستخدام cryostat و (D) يتم جمع أقسام الأنسجة العائمة الحرة. (ه) بعد التقسيم ، يتم تلطيخ أقسام الأنسجة العائمة بالكيمياء النسيجية المناعية ثم يتم تثبيت (F) على الشرائح. (ز) يتم تصوير الخلايا النجمية داخل أقسام الأنسجة المثبتة باستخدام المجهر البؤري. (ح) وأخيرا، يتم تحديد أحجام أراضي الخلايا المصورة كميا باستخدام برنامج تحليل الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخطوات الرئيسية في إجراء تحليل الصورة لحجم منطقة الخلايا النجمية . (أ) عرض الخلية مع مربع منطقة الاهتمام الذي يستبعد الإشارة الأخرى في الصورة من إجراء التحليل. (ب) عتبة نسبية مقبولة لإنشاء السطح (رمادي) باستخدام الإشارة (الحمراء). (ج) سطح مكتمل مع اختيار الخلية الرئيسية (صفراء). سيتم حذف أجزاء أخرى من السطح ليست الخلية (أحمر). (د) سطح شفاف مع بقع تم إنشاؤها. (ه) صورة مقربة للسطح الشفاف مع بقع تم إنشاؤها لإظهار توزيع مقبول للبقع بالنسبة للسطح. (و) الهيكل المحدب النهائي. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الخطوات الرئيسية في تحليل تداخل أراضي الخلايا النجمية. (أ) صورة تمثيلية لاثنين من الخلايا النجمية التي تعبر عن علامات فلورسنت مختلفة ، GFP (أخضر) و RFP (أرجواني). (ب) توليد بدن محدب لكل خلية نجمية. (ج) عرض قنوات GFP و RFP المقنعة ، مع إزالة القنوات الأصلية. (د) مثال على العتبة باستخدام أداة "Coloc" لإنشاء قناة "نتيجة التوطين المشترك". تظهر الإشارة "colocalized" باللون الرمادي. (ه) عرض القناتين الملثمتين. (و) منظر دوار للهيكل المحدب لقناة "نتيجة التوطين المشترك" (رمادية) التي تمثل حجم تداخل الإقليم. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التطبيق الناجح للبروتوكول لقياس حجم أراضي الخلايا النجمية وتداخل أراضي الخلايا النجمية. (أ) الخلايا النجمية في القشرة البصرية للفئران CD1 من النوع البري في اليوم 21 بعد الولادة ، معبرا عن mCherry-CAAX (سماوي) و shRNA التحكم (shScramble) أو shRNA يستهدف الكبدCAM (shHepacam). يتم تحديد منطقة الخلايا النجمية باللون الأحمر. (ب) فقدان الكبد الدموي يقلل بشكل كبير من حجم أراضي الخلايا النجمية. تمثل نقاط البيانات متوسطات الماوس الفردية. أشرطة الخطأ هي ± s.e.m. اختبار t المتداخل. (ج) الخلايا النجمية المجاورة في قشرة الفأر في اليوم 21 بعد الولادة التي تعبر عن GFP (الأخضر) أو RFP (أرجواني). في الفئران MADM9 WT: WT ، كل من الخلايا النجمية من النوع البري. في الفئران MADM9 WT:KO ، تكون الخلايا النجمية الخضراء من النوع البري والخلايا النجمية الأرجوانية فارغة بالنسبة ل Hepacam. يظهر حجم تداخل الأراضي باللون الأزرق. (النمط الوراثي MADM9 WT:WT: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; هيباكام +/+. MADM9 WT:KO النمط الوراثي: MADM9TG/GT; EMX-CreTg/0; هيباكام +/-). (د ) التحديد الكمي للنسبة المئوية لتداخل حجم الأراضي. تمثل نقاط البيانات متوسطات الماوس الفردية. أشرطة الخطأ هي ± s.e.m. اختبار t المتداخل. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. تمت إعادة طباعة اللوحات في هذا الشكل من Baldwin et al9 بإذن من الناشر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملف تكميلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية في قشرة الفأر ، مع تفصيل جميع الخطوات الرئيسية التي تبدأ بالتروية وتنتهي بتحليل الصور. يتطلب هذا البروتوكول أدمغة من الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية في مجموعة متفرقة أو فسيفساء من الخلايا النجمية. خارج هذا المطلب، يمكن استخدام الفئران من أي عمر لهذا البروتوكول، مع تعديلات طفيفة فقط على إعدادات التروية وحجم وسائط التجميد المضافة إلى قالب التضمين. في حين تم نشر طرق أخرى لتحليل تعقيد وحجم تفرع الخلايا النجمية في أقسام أنسجة المخ 7,11 ، فإن هذا البروتوكول له العديد من المزايا الفريدة. أولا ، يصف هذا البروتوكول رمزا مخصصا يمكن استخدامه للحصول على حجم إقليم الخلايا النجمية. حجم أراضي الخلايا النجمية هو قياس متميز عن حجم الخلايا النجمية ، من حيث أنه يقيس المساحة الكاملة التي تشغلها الخلايا النجمية ، بغض النظر عن تعقيدها المتفرع. علاوة على ذلك ، يصف هذا البروتوكول كيفية تطبيق قياس حجم منطقة الخلايا النجمية لقياس حجم تداخل أراضي الخلايا النجمية ، وبالتالي سلوك تبليط الخلايا النجمية. وأخيرا، يقدم هذا البروتوكول مناقشة مفصلة للمتغيرات المحتملة التي قد تؤثر على حجم أراضي الخلايا النجمية وجمع البيانات، بما في ذلك ظروف التركيب، وظروف تخزين العينات، ومعايير الإدراج والاستبعاد للتصوير والتحليل. بالإضافة إلى هذه الميزات الفريدة ، يمكن تطبيق العديد من جوانب هذا البروتوكول ، بما في ذلك التروية والاستئصال بالتبريد والتلطيخ المناعي للأقسام العائمة الحرة ، على نطاق واسع على تلطيخ أقسام أنسجة المخ بسماكات مختلفة ومع مجموعات مختلفة من الأجسام المضادة. أدناه ، تتم مناقشة الخطوات الحرجة والاعتبارات المهمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها والقيود بالتفصيل.
اعتبارات جمع العينات
أحد الاعتبارات المهمة جدا للتجارب المصممة للتحقيق في مورفولوجيا الخلايا النجمية هو الحفاظ على وقت ثابت من اليوم لجمع العينات. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الحالات الوظيفية للخلايا النجمية مرتبطة بإيقاع الساعة البيولوجية وسلوكيات النوم14. لإزالة أي تباين قد يحدث من خلال العينات التي يتم جمعها في أوقات مختلفة من اليوم ، يجب التخطيط لعمليات التروية بحيث يتم جمع جميع العينات الخاصة بالتجربة في نفس الوقت تقريبا من اليوم ، في غضون فترة زمنية تتراوح بين 2-3 ساعات. بالنسبة لعمليات التروية المتسقة ، يوصى بشدة باستخدام مضخة تمعجية. إضافة الهيبارين إلى TBS مفيد للحد من تكوين جلطات الدم. في حين أن هذا البروتوكول لم يتم اختباره بأوقات أقصر بعد التثبيت ، فقد لا تكون هناك حاجة إلى التثبيت اللاحق بين عشية وضحاها ، ويمكن النظر في تثبيت أقصر لمدة 4 ساعات.
نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها للاستئصال بالتبريد
تجميد الأدمغة في وسط تجميد السكروز 2: 1: OCT يقلل من كمية OCT في آبار التجميع بعد التقسيم. عند تجميده ، يتصرف وسط التجميد بشكل مشابه ل OCT نفسه ولكنه أقل هشاشة. عند تجميد كتلة الأنسجة إلى الظرف ، تأكد من الضغط عليها بشكل مسطح على الظرف مباشرة بعد إضافة OCT إلى الظرف. إذا انفصلت كتلة الأنسجة عن الظرف أثناء التقسيم ، فاستخدم شفرة حلاقة لقطع سطح مستو جديد في القاع وإعادة تجميده إلى الظرف. إن إعطاء الظرف وقتا كافيا ليبرد إلى درجة حرارة غرفة cryostat قبل إضافة OCT والتأكد من أن الظرف نظيف وجاف سيحسن الالتصاق. عند تحريك أقسام الأنسجة باستخدام فرشاة الطلاء ، المس فرشاة الطلاء إلى حافة الزاوية في القسم ، بحيث تلمس OCT وليس الأنسجة نفسها. مع القليل من الرطوبة ، سوف يلتصق القسم بالفرشاة. ضع المنديل بلطف في وسط التقسيم عن طريق لمس الحافة المقابلة للقسم بالوسائط والسماح بسحبه إلى الوسط. إذا لمست الفرشاة وسط التجميد، فامسحها على منشفة ورقية داخل الثلاجة. الفرشاة الرطبة جدا ستجعل من الصعب نقل الأقسام إلى الطبق. يجب أن يذوب OCT بمجرد وضع قسم الأنسجة في وسط التقسيم. إذا لم يحدث ذلك، فقد تكون درجة حرارة غرفة التبريد منخفضة جدا.
اعتبارات مهمة لتلطيخ وتركيب أقسام الأنسجة
لتحسين جودة التلطيخ ، قم بإعداد TBST طازجا قبل كل تجربة. استخدم مصدر تريتون مائي عالي الجودة بنسبة 10٪ (جدول المواد). اختر مصلا يطابق الأنواع التي صنع فيها الجسم المضاد الثانوي (على سبيل المثال ، استخدم مصل الماعز لماعز مضاد للأرانب الثانوية). يتم طرد محاليل الأجسام المضادة مركزيا قبل الاستخدام ، لتكوير وإزالة أي جسم مضاد مترسب. احرص على عدم إزعاج الكريات عند نقل محلول الأجسام المضادة من الأنبوب إلى اللوحة (قد يعني ذلك سحب أقل قليلا من 1 مل من محلول الأجسام المضادة لكل بئر وعدم لمس الجزء السفلي من الأنبوب بطرف الماصة). تساعد هذه الخطوة على تقليل تلطيخ الخلفية. عندما يتم وضع الأقسام في TBS: dH2O ، فإن معظمها سوف يتكشف / يفكك نفسه ، ولكن قد يظل البعض مطويا أو ملتويا. عند نقل المقاطع إلى الشريحة باستخدام فرشاة، استخدم طرف P200 في اليد الأخرى للمساعدة في توجيه قسم الأنسجة إلى المكان المناسب. استخدم الفرشاة لكشف المقاطع أو فكها بلطف بحيث تكون مسطحة. تميل الأقسام إلى التحرك نحو ماصة الشفط أثناء إزالة السائل. استخدم طرف P200 للحفاظ على الأقسام المحمولة في مكانها أثناء الشفط. يجب إضافة وسائط التركيب إلى الأقسام مباشرة بعد إزالة جميع السوائل الزائدة وقبل أن يكون لدى الأقسام وقت لتجف. إن السماح للأقسام بالجفاف حتى لبضع دقائق سيؤثر بشكل كبير على حجم الخلايا داخل القسم. بعد إضافة وسائط التركيب إلى الشريحة، استخدم ماصة لإزالة أي فقاعات مرئية. بعد إضافة الغطاء ، تأكد من إزالة وسائط التركيب الزائدة من الجانبين ، لأن هذا سيتداخل مع قدرة طلاء الأظافر على الجفاف. اتركي طلاء الأظافر ليجف في درجة حرارة الغرفة. انتظر لمدة 2 ساعة على الأقل أو حتى اليوم التالي لتصوير الأقسام ، للتأكد من أن وسائط التركيب لديها ما يكفي من الوقت لاختراق الأقسام السميكة بالكامل.
تصوير الخلايا النجمية الكاملة
عند تصوير الخلايا النجمية لتحليل حجم المنطقة ، من الأهمية بمكان أن تلتقط الصورة الحجم الكامل للخلايا النجمية. العديد من الخلايا النجمية المسماة في قسم الأنسجة ستكون خلايا نجمية غير مكتملة. سيتم احتواء الخلايا النجمية الكاملة بالكامل داخل قسم الأنسجة. لتحديد الخلايا النجمية الكاملة ، ابدأ بنقطة محورية داخل منتصف الخلايا النجمية. استخدم مقبض التركيز البؤري للانتقال إلى الجزء العلوي من الخلايا النجمية. عندما لا تكون الخلايا النجمية في بؤرة التركيز ، يجب أن تظل السمات الأخرى للأنسجة في بؤرة التركيز. كرر هذه العملية لأسفل الخلايا النجمية. لا تصور الخلايا النجمية غير المكتملة. بسبب سمك الأقسام ، فإن اختراق الأجسام المضادة ليس قويا في منتصف القسم. قد يكون وضع العلامات أقوى حول الحواف الخارجية للخلايا النجمية وأضعف في المركز. ويلاحظ هذا عادة ولا يؤثر على تحليل الأراضي.
نصائح لتحليل الصور
الاعتبار الأكثر أهمية لجزء تحليل الصورة من البروتوكول هو التأكد من أن الهيكل المحدب يمثل خلية نجمية واحدة فقط. اتبع معايير الإدراج والاستبعاد في كل مرة. في بعض الأحيان ، سيكون لاثنين من الخلايا النجمية أجسامهما الخلوية قريبة جدا من بعضهما البعض. قد يكون من الصعب تحديد ذلك في طريقة العرض 3D ، ولكن يمكن التعرف عليه باستخدام طريقة عرض الشريحة. إذا كانت هناك خلايا نجمية أخرى تحمل علامات الفلورسنت تتصل بالخلايا النجمية ذات الأهمية ، فقد يؤدي ذلك إلى تعقيد عملية إنشاء السطح. إذا كان هناك حد واضح بشكل معقول بين الخليتين (على سبيل المثال ، يتم توصيلهما فقط عند نقطة فرع صغيرة واحدة) ، يمكن استخدام أداة القطع لإجراء قطع في السطح ، ويمكن حذف هذا الجزء من السطح. بعد إنشاء السطح ، قم بتدوير الخلية في عرض 3D للتحقق من وجود أجزاء صغيرة من السطح قد تكون مختبئة خلف الخلية ، ولكنها ليست جزءا من الخلية. احذفها قبل المتابعة. إذا برز الهيكل المحدب بشكل كبير إلى نقطة خارج منطقة الخلايا النجمية ، فمن المحتمل أن يكون هناك قطعة من سطح غير الخلية لم تتم إزالتها. إذا تعطل البرنامج بشكل روتيني أثناء إنشاء السطح ، فيمكن تقليل رقم تفاصيل السطح. إذا تحطمت أثناء إنشاء البقع ، فاستخدم منطقة ذات أهمية لإنشاء بقع بالقرب من الكائن السطحي فقط.
قيود البروتوكول
في حين أن هناك العديد من الاستخدامات والمزايا لهذا البروتوكول ، هناك أيضا العديد من القيود. يتطلب هذا البروتوكول الفئران التي تعبر بالفعل عن البروتينات الفلورية في مجموعة قليلة من الخلايا النجمية ، لكنه لا يصف طرق إدخال التعبير عن البروتينات الفلورية في الخلايا النجمية. تستغرق خطوط أنابيب التصوير والتحليل وقتا طويلا وليست مناسبة تماما للتحليل عالي الإنتاجية. علاوة على ذلك ، فهي موجهة على وجه التحديد نحو قياس حجم أراضي الخلايا النجمية والبلاط ، بدلا من تحديد السمات المورفولوجية التفصيلية للخلايا النجمية الفردية. قد يجد آخرون أنه من المفيد الجمع بين نهج واستراتيجيات هذا البروتوكول والبروتوكولات المنشورة مؤخرا والتي تفصل طرق قياس التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية 7,11. وأخيرا ، فإن منصات البرمجيات التجارية المستخدمة في هذا البروتوكول (أي Imaris و MATLAB) باهظة الثمن وتتطلب ترخيصا للاستخدام. في حين أن المؤسسات الكبيرة غالبا ما تشتري تراخيص لمنصات البرمجيات هذه ، إلا أن هذا قد يكون باهظ التكلفة للمؤسسات الصغيرة والمختبرات الفردية. قد تساعد التطورات في الفحص المجهري وبرامج تحليل الصور مفتوحة المصدر وخوارزميات التعلم الآلي في جعل هذا البروتوكول متاحا على نطاق واسع لجميع المختبرات ، وقد يحسن أيضا من كفاءة الحصول على الصور وتحليلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم إجراء الفحص المجهري في مركز UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) ، مدعوما جزئيا بتمويل من منحة دعم مركز العلوم العصبية NIH-NINDS P30 NS045892 ومنحة دعم مركز أبحاث الإعاقات الفكرية والتنموية التابع للمعاهد الوطنية للصحة النباتية - NICHD U54 HD079124. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. تتم إعادة طباعة الصور والبيانات الواردة في الشكل 4 من منشور سابق9 بإذن من الناشر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 1 mL TB Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309623 | |
| 10x TBS (tris-buffered saline) | 30 g Tris, 80 g NaCl, 2 g KCl, HCl to pH 7.4, dH2O to 1 L; store at room temperature (RT) | ||
| 12-well plate | Genesee Scientific | 25-106MP | |
| 1x TBS | 100 mL 10x TBS + 900 mL dH2O; store at RT | ||
| 1x TBS + Heparin | 28.2 mg Heparin + 250 mL 1x TBS; store at 4 °C | ||
| 24-well plate | Genesee Scientific | 25-107MP | |
| 30% Sucrose in TBS | 15 g sucrose, 1x TBS to 50 mL; store at 4 °C | ||
| 4% PFA (paraformaldehyde) in TBS | 40 g PFA, 4-6 NaOH pellets, 100 mL 10x TBS, dH2O to 1 L; store at 4 °C | ||
| Avertin | 0.3125 g tri-bromoethanol, 0.625 mL methylbutanol, dH2O to 25 mL; store at 4 °C; discard 2 weeks after making | ||
| Blocking and antibody buffer | 10% goat serum in TBST; store at 4 °C | ||
| CD1 mice | Charles River | 022 | |
| Collection vial for brains | Fisher Scientific | 03-337-20 | |
| Confocal acquisition software | Olympus | FV31S-SW | |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000RS | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX50 | |
| Cryostat blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
| Freezing Medium | 2:1 30% sucrose:OCT; store at RT | ||
| GFP antibody | Aves Labs | GFP1010 | |
| Glycerol | Thermo Scientific | 158920010 | |
| Goat anti-chicken 488 | Invitrogen | A-11039 | |
| Goat anti-rabbit 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210064 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imaris | Bitplane | N/A | Version 9.8.0 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | |
| Metal lunch tin | AQUARIUS | N/A | From Amazon, "DIY Large Fun Box" |
| Methylbutanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5921 | |
| Mounting medium | 20 mM Tris pH 8.0, 90% Glycerol, 0.5% N-propyl gallate; store at 4 °C; good for up to 2 months | ||
| Nail polish | VWR | 100491-940 | |
| N-propyl gallate | Sigma-Aldrich | 02370-100G | |
| O.C.T. | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | Specific to microscope/objective |
| Operating Scissors 6" | Roboz | RS-6820 | |
| Orbital platform shaker | Fisher Scientific | 88861043 | Minimum speed needed: 25 rpm |
| Paintbrush | Bogrinuo | N/A | From Amazon, "Detail Paint Brushes - Miniature Brushes" |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pasteur pipet (5.75") | VWR | 14672-608 | |
| Pasteur pipet (9") | VWR | 14672-380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541-500G | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RFP antibody | Rockland | 600-401-379 | |
| Sectioning medium | 1:1 glycerol:1x TBS; store at RT | ||
| Slides | VWR | 48311-703 | |
| Sodium chrloide | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| TBST (TBS + Triton X-100) | 0.2% Triton in 1x TBS; store at RT | ||
| Transfer Pipet | VWR | 414004-002 | |
| Tri-bromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Thermo Scientific | 424570025 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Triton X-100 (high-quality) | Fisher Scientific | 50-489-120 | |
| XTSpotsConvexHull | N/A | N/A | custom XTension provide as supplementary material |
References
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. Astrocytogenesis: where, when, and how. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Houades, V., et al. Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain. Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy. Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92 (2020).
- Takano, T., et al. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).
- Baldwin, K. T., et al. HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling. Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).
- Amberg, N., Hippenmeyer, S. Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers. STAR Protocols. 2 (4), 100939 (2021).
- Dumas, L., et al. In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110 (2020).
- Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communication. 10 (1), 4884 (2019).
- O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator. Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).
