Summary
该协议描述了称为“培养皿中的SCar样组织”或SCAD的皮肤筋膜外植体的产生。该模型允许在疤痕形成过程中对单个成纤维细胞进行前所未有的可视化。
Abstract
哺乳动物对密封深部组织伤口的整体反应是通过瘢痕形成和组织收缩，由专门的筋膜成纤维细胞介导。尽管疤痕形成和伤口愈合受损具有临床意义，但由于缺乏相关的测定，我们可以直接可视化成纤维细胞在复杂环境（如皮肤伤口）中的成纤维细胞编导和动力学，因此我们对伤口愈合中筋膜成纤维细胞动力学的理解是粗略的。本文提出了一种使用SCAD或“培养皿中的SCar样组织”来模拟皮肤伤口的复杂环境来生成 异地 皮肤疤痕的方案。在该测定中，切除2mm全厚皮肤并在培养基中倒置培养5天，在此期间疤痕和皮肤挛缩均匀发展。这种方法与成纤维细胞谱系特异性转基因小鼠模型相结合，可以在整个伤口修复过程中可视化单个成纤维细胞谱系。总体而言，该协议有助于研究人员了解伤口修复的基本过程和机制，直接探索调节剂对伤口愈合结果的影响。
Introduction
伤口愈合是恢复破裂伤口的过程。无脊椎动物的组织损伤导致部分或完全再生。相比之下，哺乳动物通过疤痕形成对深部损伤做出反应，这是一种量身定制的过程，用于用密集的基质纤维塞快速密封伤口，从而最大限度地减少破坏区域，同时使受伤部位永久变形1，2，3。哺乳动物的大面积皮肤灼伤或深部开放性伤口导致病理性表型，例如肥厚性或瘢痕疙瘩4，5。这些茂密的疤痕给临床和全球医疗保健系统带来了巨大的负担。仅在美国，疤痕管理每年的成本约为100亿美元，6，7。因此，需要开发相关方法，以更好地了解疤痕形成所涉及的基础过程和机制。
近年来，对小鼠的广泛研究揭示了异质成纤维细胞群体，这些成纤维细胞群体基于它们在某些皮肤位置的起源具有不同的功能效力8，9，10。在后皮中，Rinkevich等人，2015年，发现具有Engrailed-1（En1）早期胚胎表达的特定成纤维细胞群体，称为EPF（Engrailed阳性成纤维细胞）有助于受伤时的皮肤瘢痕形成。相反，另一种没有受累表达史的成纤维细胞谱系，Engrailed阴性成纤维细胞（ENF），不会导致瘢痕形成8。这些En1谱系的命运图谱使用Cre驱动的转基因小鼠品系交叉到荧光报告小鼠品系，如R26mTmG （En1Cre x R26mTmG），可以可视化EPF和ENF种群。
在几天 内 研究体内成纤维细胞迁移受到伦理和技术限制的限制。此外，化合物、病毒和中和抗体库筛选以调节瘢痕形成所涉及的途径在技术上具有挑战性。以前使用的 体外 或 离体 模型缺乏在真实皮肤微环境中可视化成纤维细胞迁移和疤痕形成的能力，疤痕发育的均匀性，以及模拟 体内 皮肤环境的组织复杂性11，12。为了克服上述局限性，我们开发了一种称为SCAD（A培养皿中的SCar样组织）的 离体 瘢痕测定法13，14。这种简单的测定可以通过切除含有表皮，真皮和皮下筋膜区域的2mm全层皮肤并在血清补充的DMSO培养基中培养长达5天来进行。SCAD产生的瘢痕可靠地复制 体内 瘢痕的转录组和蛋白质组学特征。此外，从相关转基因小鼠品系（例如En1小鼠）与荧光报告小鼠品系杂交产生的SCAD能够以前所未有的分辨率可视化成纤维细胞迁移动力学和疤痕发展。此外，该模型可以很容易地适应任何高通量应用（例如，化合物库、抗体库或病毒筛选）13，14。在本文中，我们描述了一种优化的方案，用于生成SCAD和随后的下游处理应用，以研究疤痕发育中的细胞和基质动力学。
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Protocol
下面介绍的模型提供了SCAD测定生成的详细分步描述，如Jiang等人，202013中简要描述的那样。SCAD样品制备是在根据国际和上巴伐利亚政府的指导方针牺牲动物后进行的。动物被安置在慕尼黑亥姆霍兹中心的动物设施中。房间保持在最佳湿度和恒定温度下，光照周期为12小时。动物们 被随意地提供食物和水。
1. 全身心塌病组织制备
- 在产后第0天或第1天（P0或P1）处死新生幼崽。
- 使用无菌手术刀小心切除至少1.5厘米x 1.5厘米的全厚背背皮肤，直到骨骼肌层。
- 使用无菌弯曲镊子剥离皮肤，确保浅筋膜与下面的全皮肌完整。
- 用50-100 mL冷DMEM / F-12培养基洗涤切除的组织以除去污染的血液。
- 用Hanks的平衡盐溶液（HBSS）洗涤一次，以保持组织和细胞活力。
- 将皮肤倒置（浅筋膜在上面）放入含有DMEM / F12培养基的10厘米培养皿中。
- 使用一次性2 mm活检打孔，切除全层圆形皮肤片，确保浅筋膜完好无损，下层掌骨肌直到表皮产生SCAD组织。
- 制备200μL DMEM / F12（不含酚红）完整培养基DMEM / F12培养基，并补充有10%FBS，1x GlutaMAX，1x MEM非必需氨基酸和1x青霉素/链霉素到96孔板的单个孔中。
- 使用无菌镊子，小心地将单个SCAD组织倒置（筋膜朝上）完全浸没到96孔板的孔中。
- 将板转移到标准条件下（37°C，21%（v / v）氧气，5%（v / v）C02和95%湿度）下的细胞培养箱中。
2. SCAD - 组织培养
- 在培养箱中培养SCAD长达5天。
- 在培养的第2天和第4天，用200μl新鲜预热的DMEM / F12完整培养基替换培养基，以确保持续的细胞和组织活力条件。在每次更换培养基期间更换处理化合物。
注意：确保在孔中留下10μL培养基，以避免组织粘附在孔中。 - 为以下实验准备SCAD：实时成像（第3部分），组织收获和2D / 3D免疫荧光染色（第4部分）。
3. 表面活性损伤的成像
- 在玻璃瓶中制备至少30 mL的2%-3%（w / v）低熔点琼脂糖溶液，将其在玻璃瓶中加热至沸腾。
- 立即转移瓶子并在40°C水浴中冷却液体琼脂糖溶液。
- 将筋膜/疤痕朝上移动的SCAD组织到35 mm培养皿的中心。
- 通过使用巴斯德移液管将40°C液体琼脂糖缓慢转移到35mm培养皿上，在室温（RT）下包埋SCAD。琼脂糖在2分钟内聚合。
- 加入 2 mL 预热的 DMEM/F12 完整培养基（不含酚红指示剂）。
- 使用共聚焦或多光子显微镜采集第 0 天 SCAD 的延时图像，该显微镜配备的合适孵育系统，设置为 37 °C、21% （v/v） 氧气、5% （v/v） C02 和 95% 湿度。
4. 组织采集和2D/3D免疫荧光染色
- 通过用无菌PBS替换培养基，在相关时间点洗涤组织。
- 使用无菌镊子，小心地将单个SCAD转移到含有500μL2%多聚甲醛的1.5mL微量离心管中，以在4°C下固定组织过夜。
- 用PBS洗涤组织三次，然后进行2D / 3D免疫荧光染色。
- 3D 免疫荧光染色
- 通过在含有500μL PBS的1.5mL微量离心管中孵育组织以透化组织，补充有0.2%明胶，0.5%Triton-X100和0.01%硫柳汞（PBSGT）在室温下24小时。
- 根据制造商的说明制备足够量的一抗，并将SCAD组织在150μLPBSGT溶液中孵育24小时，以室温。
注意：如果制造商未报告免疫荧光的最佳抗体浓度，则需要使用不同的浓度（例如，1：50、1：200、1：500、1：1000）对对照组织进行先前的抗体滴定。 - 用PBS轻轻洗涤SCAD三次，以除去未结合的一抗。
- 在放疗时将组织与 1：1000 相关的 Alexa Fluor 二抗一起在 PBS 中孵育过夜。
- 在PBS中轻轻洗涤组织30分钟三次，以除去多余的未结合二抗。
- 将组织转移到35mm玻璃底培养皿上进行共聚焦或多光子成像。
注意：使用水浸物镜时，将SCADs嵌入2%低熔点琼脂糖中以固定组织，以防止图像采集过程中的漂移
- 2D 免疫荧光染色
- 将组织转移到冷冻模具中，并轻轻填充最佳切割温度（OCT）化合物以完全浸入组织。
- 轻轻调整组织的方向，确保没有气泡以获得横截面或垂直截面。
- 将模具放在干冰上20-30分钟，并将块在-80°C下孵育过夜。
- 将刀片温度设置为 -25 °C，将试样块温度设置为 -17 °C。 使用低温恒温器制备6μm冷冻切片，将这些切片转移到粘合载玻片上，并将载玻片储存在-20°C冰箱中。
- 在PBS中冲洗载玻片三次，并将载玻片在PBST（PBS补充0.05%吐温的PBS）中孵育5%牛血清白蛋白（BSA）w / v中1小时。
- 向150μlPGST中加入适量的一抗，并在4°C下孵育过夜
注意：如果制造商未报告免疫荧光的最佳抗体浓度，则需要使用不同的浓度（例如，1：50、1：200、1：500、1：1000）在对照区进行先前的抗体滴定。 - 用PBS轻轻洗涤切片三次，以除去未结合的一抗。
- 将组织与1：1000相关的Alexa Fluor二抗在PBS中室温过夜2小时。
- 在PBS中轻轻洗涤组织5分钟三次，以除去多余的未结合二抗。
- 使用含有DAPI的安装介质安装载玻片，并在室温下在黑暗中干燥载玻片。
- 使用荧光显微镜对切片进行成像。
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Representative Results
SCAD的产生可以分为三个基本步骤：从P0-P1小鼠中收集背部皮肤，产生全层活检冲孔，随后在96孔板中培养单个粪便长达5天。作为读数，该测定可以进一步应用于分析瘢痕形成的空间和时间方面。空间分析利用组织的2D和3D免疫标记来研究发育中的疤痕组织中细胞和基质成分的空间定位。时空研究允许使用组织内在或外在荧光蛋白来可视化这些 非原位 疤痕，这些荧光蛋白可以使用相关的3D延时成像方式进行可视化。
该测定中的关键步骤是通过仔细生成全层活检冲头来建立实验，确保存在筋膜“果冻”层，并培养完全倒置浸没的组织（表皮朝向96孔板的底部）。这允许形成均匀的疤痕，相关成纤维细胞群的可比迁移动力学以及跨SCAD的皮肤收缩（图1A）。SCAD测定的多功能性允许在整个疤痕发育范围内收获组织。例如，如果实验的目的是研究瘢痕形成的早期动力学，则空间和时空分析可以限制为SCAD培养物的D1或D2（图1B）。
SCAD在第0天和第5天的代表性全贴合明场图像分别如图 2A 和 图2A'所示。对于二维分析，必须将SCADs嵌入OCT中，使其垂直方向，没有气泡，以确保切片后组织的完整性。这些组织切片可以进一步进行组织学分析（例如，Masson三色染色 - 图2B，2B'）或免疫荧光染色（图2C，2C'）在 En1Cre，R26mTmG 小鼠背真皮的冷冻切片上;早期（图2D）和晚期疤痕的绿色EPF和红色的ENF（图2D'）。
疤痕的3D和3D延时成像需要检测组织内部深处（400-800μm）的荧光信号。使用双光子激发的近红外波长激发使得这种测量无需组织清除即可实现，这是3D成像中常用的一种方法，通过最小化光散射和吸收15，16，17使组织透明。我们使用一台配备25倍水浸物镜的直立式多光子显微镜，并结合可调谐激光器。使用相关探针对组织进行3D免疫染色。对于3D成像，将组织嵌入2%低熔点琼脂糖溶液中以固定或防止组织中的漂移（图3A），顶部装有PBSGT以匹配水浸物镜所需的折射率。图3B和图3B'中的代表性图像显示了N-钙粘蛋白（粉红色/洋红色 - Alexa氟647）在En1Cre，R26mTmG背皮5 SCAD的疤痕部位的独家定位;绿色的 EPF 和红色的 ENF。对于3D延时成像，通过将组织嵌入2%低熔点琼脂糖溶液中，顶部是不含酚红指示剂的DMEM / F12培养基而不是PBS，对上述设置进行了轻微的修改。为了确保在成像过程中“活的”SCAD组织的正确条件，添加了合适的孵育室，以便在成像过程中正确记录所有表型（图3C）。早期成纤维细胞群的代表性快照如图3D，图3D'和图3D''所示，在疤痕发育的前12小时/早期阶段。
图1：SCAD测定的工作流程示意图。（A）切除产后第0天/第1天幼崽的背部皮肤，确保含有以下真皮层的组织完整性：表皮（E），状和网状真皮（PD和RD）和筋膜层（F），然后进行2毫米活检冲孔以获得第0天SCAD。（B）然后，SCADs随后可以培养长达5天，并根据单个实验的性质（点箭头）进行可选的间歇性收获/组织固定步骤，并在第2天和第4天进行培养基更换步骤。请点击此处查看此图的大图。
图2：2D免疫荧光染色。代表性的2D读数，使用（A和A'）第0天（A）和第5天（A'）的明场全贴片图像研究早期和晚期疤痕。（B和B'）Masson对垂直组织切片进行三色染色，以揭示组织瘢痕形成的特征 - 组织收缩和ECM在第0天（B）和第5天（B'）在疤痕核心（黄色填充三角形）的积累。（C和C'）对En1Cre，R26mTmG背皮产生的第0天（C）和第5天（C'）SCAD进行免疫荧光分析。EPF以绿色显示，ENF以红色显示，DAPI以蓝色显示早期（D）和晚期（D'）疤痕。请点击此处查看此图的大图。
图3：用于3D时空和时空分析的SCAD的示意图设置和代表性读数。 （A）在直立荧光显微镜下将SCAD嵌入2%低熔点温度琼脂糖凝胶中的示意图和（B）从 En1Cre，R26mTmG 生成的3D免疫荧光染色第5天SCAD的代表性图像 小鼠真皮和免疫染色与N-钙粘蛋白抗体（洋红色）。EPF 以绿色显示，ENF 以红色显示。（C） 示意图 3D 成像 SCAD 设置配备孵育室：37 °C、21% （v/v） 氧气、5% （v/v） C02 和 95% 湿度。（D）现场成像的代表性结果显示第0天和第1天阶段SCAD的前12小时成纤维细胞群进展的早期事件（白色虚线圈）。（E）D，D'和D''处单个成纤维细胞的单细胞跟踪细胞轨迹的图形表示。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
已经开发了几种模型来了解受伤后疤痕的形成。虽然在这方面取得了许多进展，但实际机制仍不清楚。与以前的技术相比，SCAD模型包含所有细胞类型和皮肤层，从而保持了天然皮肤18，19的复杂性。这种方法能够生成基本数据集，这些数据集对于理解驱动疤痕形成的分子机制非常重要。该测定以简单，简约的方式设计，但能够产生基本和功能读数，这对于理解成纤维细胞迁移，ECM沉积，表皮/肌肉收缩至关重要13，14。它相对不如体内 设置复杂，并且可以最大限度地减少与样品的偏差。此外，该测定可以很容易地与高通量分析管道结合使用。其中，抑制剂或激活剂（例如化合物，中和抗体，siRNA或减少或促进瘢痕形成的病毒方法）的整个谱或文库可以相对容易地应用于最少量的切除组织。关于这种 离体 瘢痕模型的局限性，该测定不能应用于研究a）瘢痕发育中的非居民免疫群b）血管形成c）瘢痕成熟，因为组织在损伤后5天后不可存活，因此该测定不能用于研究表型或动力学方面。
在活检切除之前，重要的是组织中不能有残留的血液，因为它可能会干扰实验过程。如有必要，我们建议用HBSS多次清洗组织，以确保消除组织中的任何残留血液。此外，隔日更换培养基需要特别小心，因为由于组织尺寸小，真皮层和表皮层可能会分离。因此，在开始实际实验之前，必须提前正确练习该过程。为了避免组织层的重复分离，我们建议在培养基更换期间，在用新鲜培养基替换之前可以保留10μl残留培养基，以稳定组织并最大限度地减少由添加到孔中的培养基引起的组织表面张力变化。
对于 2D 分析管线，我们建议在室温下用液体最佳切割温度化合物平衡组织几分钟，然后再将组织安装到块中。这可以防止在切片过程中由于冰晶形成而导致的组织分离。应根据可用的显微镜模式对 3D/3D 延时成像流水线进行充分修改。对于正置显微镜（带或不带水浸物镜），将组织嵌入琼脂糖或使用超级胶水可防止成像过程中组织的物理移动。水浸物镜允许使用PBS或无色介质（不含酚红）进行3D/3D延时成像。对于倒置显微镜，可以将组织放置在玻璃底/成像板上，并使用一滴低熔点温度琼脂糖固定，并在上面涂上合适的培养基，以确保在实时成像过程中的活力。在这两种模式下，可以使用兼容的孵育系统来确保成像过程中正确的温度、湿度和气体供应。
总之，SCAD模型能够鉴定和表征哺乳动物伤口愈合中涉及的新型分子线索和机制途径13，14。该协议提供了对SCAD的生成以及潜在的下游应用和分析的详细说明，以提供对疤痕发展的见解。
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Disclosures
所有作者都声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢Jiang et al. 2020的所有合著者为SCAD方法13的发展做出了贡献。我们感谢Steffen Dietzel博士和路德维希- 马克西米兰斯大学生物成像核心设施对多光子系统的访问。Y.R.得到了Else-Kröner-Fresenius-Stiftung（2016_A21），欧洲研究理事会整合基金（ERC-CoG 819933）和LEO基金会（LF-OC-21-000835）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
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