Summary
Denne protokol beskriver dannelsen af en hud-fascia-eksplantation nævnt "SCar-lignende væv i en skål" eller SCAD. Denne model tillader hidtil uset visualisering af enkeltfibroblaster under ardannelse.
Abstract
Pattedyrs globale reaktion på forsegling af dybe vævssår er gennem ardannelse og vævskontraktion, medieret af specialiserede fasciafibroblaster. På trods af den kliniske betydning af ardannelse og nedsat sårheling er vores forståelse af fascia fibroblastdynamik i sårheling kortvarig på grund af manglen på relevante assays, der muliggør direkte visualisering af fibroblastkoreografi og dynamik i komplekse miljøer som i hudsår. Dette papir præsenterer en protokol til generering af ex situ hudar ved hjælp af SCAD eller "SCar-lignende væv i en skål", der efterligner det komplekse miljø af hudsår. I dette assay udskæres 2 mm fuld tykkelse hud og dyrkes på hovedet i medier i 5 dage, hvor ar og hudkontrakturer udvikler sig ensartet. Denne metode kombineret med fibroblast-afstamningsspecifikke transgene musemodeller muliggør visualisering af individuelle fibroblastafstrigninger på tværs af hele sårreparationsprocessen. Samlet set hjælper denne protokol forskere med at forstå grundlæggende processer og mekanismer til sårreparation og direkte udforske virkningerne af modulatorer på sårhelingsresultater.
Introduction
Sårheling er en proces med restaurering af brudte sår. Vævsskader hos hvirvelløse dyr resulterer i delvis eller fuldstændig regenerering. I modsætning hertil reagerer pattedyr på dyb skade ved ardannelse, en proces, der er skræddersyet til hurtigt at forsegle sår med tætte propper af matrixfibre, der minimerer det brudte område og samtidig permanent deformerer det skadede sted 1,2,3. Store hudforbrændinger eller dybe åbne sår hos pattedyr resulterer i patologiske fænotyper såsom hypertrofiske eller keloide ar 4,5. Disse sprudlende ar forårsager en enorm byrde for kliniske og globale sundhedssystemer. Alene i USA koster arhåndtering omkring 10 milliarder dollars årligt 6,7. Derfor er det nødvendigt at udvikle relevante metoder for bedre at forstå de fundementale processer og mekanismer, der er involveret i ardannelse.
I de senere år har en bred vifte af undersøgelser i mus afsløret heterogene fibroblastpopulationer med forskellige funktionelle potenser baseret på deres oprindelse på visse hudsteder 8,9,10. I ryghud identificerede Rinkevich et al., 2015, at en specifik fibroblastpopulation med et tidligt embryonalt udtryk for Engrailed-1 (En1), betegnet EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrager til kutan ardannelse ved såring. Omvendt bidrager en anden fibroblast-slægt uden historie med engrailed ekspression, Engrailed negative fibroblast (ENF), ikke til ardannelse8. Skæbnekortlægning af disse En1-slægter ved hjælp af Cre-drevne transgene muselinjer krydset til fluorescensreportermuslinjer såsom R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) muliggør visualisering af EPF- og ENF-populationer.
At studere fibroblastmigration in vivo over flere dage er begrænset af etiske og tekniske begrænsninger. Desuden er sammensatte, virale og neutraliserende antistofbiblioteksskærme til modulering af veje, der er involveret i ardannelse, teknisk udfordrende. Tidligere anvendte in vitro- eller ex vivo-modeller mangler evnen til at visualisere fibroblastmigration og ardannelse i ægte hudmikromiljøer, ensartethed i arudvikling samt vævskompleksitet, der efterligner in vivo-hudmiljøer 11,12. For at overvinde ovenstående begrænsninger udviklede vi et ex vivo ardannelsesassay nævnt SCAD (SCar-lignende væv i en skål)13,14. Dette enkle assay kan udføres ved at udskære 2 mm hud i fuld tykkelse, der indeholder epidermis, dermis og subkutane fasciaregioner og dyrke dem i serumstædsede DMSO-medier i op til 5 dage. Ar genereret fra SCAD replikerer pålideligt transkriptomiske og proteomiske kendetegn ved in vivo-ar. Derudover tillader SCAD'er genereret fra relevante transgene muselinjer (f.eks. En1-mus) krydset med fluorescerende reportermuslinjer visualisering af fibroblastmigrationsdynamik og arudvikling i en hidtil uset opløsning. Desuden kan denne model let tilpasses til alle applikationer med høj gennemstrømning (f.eks. Sammensat bibliotek, antistofbibliotek eller viral screening)13,14. I denne artikel beskriver vi en optimeret protokol til at generere SCAD'er og efterfølgende downstream-behandlingsapplikationer til at studere cellulær og matrixdynamik i arudvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Modellen præsenteret nedenfor giver en detaljeret trinvis beskrivelse af genereringen af SCAD-assay som kort beskrevet i Jiang et al., 202013. SCAD-prøvepræparater blev udført efter ofring af dyrene i henhold til de internationale og øvre Bayerns regerings retningslinjer. Dyrene blev ophuset på dyreanlægget i Helmholtz Centre München. Værelserne blev opretholdt med optimal fugtighed og konstant temperatur med en 12 timers lyscyklus. Dyrene blev forsynet med mad og vand ad libitum.
1. SCAD-vævsforberedelse
- Ofre nyfødte hvalpe påpostnatal dag 0 eller dag 1 (P0 eller P1).
- Skær forsigtigt mindst 1,5 cm x 1,5 cm fuld tykkelse dorsal ryghud indtil skeletmuskellaget ved hjælp af en steril kirurgisk skalpel.
- Skræl huden ved hjælp af steril buet tang, og sikre, at den overfladiske fascia er intakt med den underliggende panniculus carnosus muskel.
- Vask det udskårne væv med 50-100 ml koldt DMEM/F-12-medie for at fjerne forurenende blod.
- Vask en gang med Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) for at opretholde vævs- og cellelevedygtigheden.
- Placer huden på hovedet (overfladisk fascia ovenpå) i en 10 cm petriskål indeholdende DMEM/F12-medier.
- Ved hjælp af en engangs 2 mm biopsistans skal du punktafgiftspligtige runde hudstykker i fuld tykkelse, hvilket sikrer, at overfladisk fascia er intakt med underliggende panniculus carnosusmuskel indtil epidermis for at generere SCAD-væv.
- Forbered og fyld 200 μL DMEM / F12 (uden phenolrød) komplette medier-DMEM / F12 medier suppleret med 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM ikke-essentielle aminosyrer og 1x Penicillin / streptomycin i individuelle brønde af en 96-brønds plade.
- Brug sterile tang til forsigtigt at overføre og nedsænke individuelt SCAD-væv på hovedet (fascia vender opad) til brøndene på en 96-brønds plade.
- Overfør pladen til en cellekulturinkubator, der opretholdes under standardbetingelser (37 °C, 21 % (v/v) ilt, 5 % (v/v) C02 og 95 % fugtighed).
2. SCAD - Vævskultur
- Kultur SCAD'er i en inkubator i op til 5 dage.
- På dag 2 og dag 4 i kulturen skal du erstatte medierne med 200 μl friske forvarmede DMEM / F12 komplette medier for at sikre fortsatte celle- og vævslevedygtighedsforhold. Udskift behandlingsforbindelser under hver medieændring.
BEMÆRK: Sørg for at efterlade 10 μL medier i brønden for at undgå, at væv klæber til brøndene. - Forbered SCAD'er til følgende forsøg: Levende billeddannelse (punkt 3) og vævshøst og 2D/3D-immunfluorescensfarvning (punkt 4).
3. Levende billeddannelse af SCAD'er
- Der fremstilles mindst 30 ml 2%-3% (w/v) lavsmeltende agaroseopløsning i PBS i en glasflaske ved at opvarme den i en mikrobølgeovn, indtil den koger.
- Overfør straks flasken og afkøl den flydende agaroseopløsning i et vandbad på 40 °C.
- Overfør SCAD-vævet med fascia/ar opad på midten af et 35 mm fad.
- Integrer SCAD ved stuetemperatur (RT) ved langsomt at overføre 40 °C flydende agarose til 35 mm fadet ved hjælp af en Pasteur-pipette. Agarose polymeriserer inden for 2 min.
- Tilsæt 2 ml forvarmede DMEM/F12 komplette medier (uden phenolrød indikator).
- Få time-lapse-billeder af dag 0 SCAD'er op til 48 timer ved hjælp af et konfokalt eller et multifotonmikroskop udstyret med et passende inkubationssystem indstillet til 37 °C, 21 % (v/v) ilt, 5 % (v/v) C02 og 95 % fugtighed.
4. Vævshøst og 2D / 3D immunofluorescensfarvning
- Vask vævene på relevante tidspunkter ved at erstatte mediet med steril PBS.
- Brug steril tang til forsigtigt at overføre individuelle SCAD'er til 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 μL 2% paraformaldehyd for at fastgøre vævene natten over ved 4 ° C.
- Vask vævene tre gange med PBS og fortsæt med 2D / 3D immunofluorescensfarvning.
- 3D immunofluorescensfarvning
- Permeabilisere vævene ved at inkubere i et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 μL PBS suppleret med 0,2% gelatine, 0,5% Triton-X100 og 0,01% Thimerosal (PBSGT) ved RT i 24 timer.
- Forbered en tilstrækkelig mængde primære antistoffer i henhold til producentens anvisninger og inkuber SCAD-væv i 150 μL PBSGT-opløsning i 24 timer ved RT.
BEMÆRK: Hvis den optimale antistofkoncentration for immunfluorescens ikke rapporteres af producenten, skal der udføres forudgående antistoftitrering på kontrolvæv ved hjælp af varierende koncentrationer (f.eks. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Vask forsigtigt SCAD'erne tre gange med PBS for at fjerne det ubundne primære antistof.
- Inkubere væv med 1:1000 relevante Alexa Fluor sekundære antistoffer i PBS natten over ved RT.
- Vask forsigtigt vævet i 30 minutter i PBS tre gange for at fjerne overskydende ubundne sekundære antistoffer.
- Overfør vævet til en 35 mm glasbundsfad til konfokal eller multifotonbilleddannelse.
BEMÆRK: Når du bruger vandnedsænkningsmål, skal du indlejre SCAD'erne i 2 % lavt smeltepunktsalgarose for at immobilisere vævet for at forhindre drift under billedoptagelse
- 2D immunofluorescensfarvning
- Overfør vævet til en kryoform og fyld forsigtigt med optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse for at nedsænke vævet fuldstændigt.
- Juster forsigtigt vævets orientering, og sikre fraværet af luftbobler for at opnå et tværsnit eller et lodret snit.
- Læg formen på tøris i 20-30 min og inkuber blokken ved -80 °C natten over.
- Klingetemperaturen indstilles til -25 °C og prøvebloktemperaturen til -17 °C. Forbered 6 μm kryosektion ved hjælp af en kryostat, overfør sektionerne til et vedhæftningsglas, og opbevar diasene i -20 °C fryser.
- Skyl lysbillederne tre gange i PBS og inkuber lysbillederne i 5% Bovin Serum Albumin (BSA) m/v i PBST (PBS suppleret med 0,05% Tween) i 1 time.
- Tilsæt en passende mængde primært antistof til 150 μl PGST, og inkuber natten over ved 4 °C
BEMÆRK: Hvis den optimale antistofkoncentration for immunfluorescens ikke rapporteres af producenten, skal der udføres forudgående antistoftitrering på kontrolsektioner ved hjælp af varierende koncentrationer (f.eks. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Vask forsigtigt sektionerne tre gange med PBS for at fjerne det ubundne primære antistof.
- Inkubere væv med 1:1000 relevante Alexa Fluor sekundære antistoffer i PBS natten over ved RT i 2 timer.
- Vask forsigtigt vævet i 5 minutter i PBS tre gange for at fjerne overskydende ubundne sekundære antistoffer.
- Monter rutsjebanerne med et monteringsmedium, der indeholder DAPI, og tør rutsjebanerne i mørke ved RT.
- Billede sektionerne ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering af SCAD'er kan opdeles i tre vigtige trin: Høst af hud fra P0-P1-mus, generering af biopsistans i fuld tykkelse og efterfølgende dyrkning af individuelle scads op til 5 dage i plader med 96 brønde. Som en udlæsning kan dette assay yderligere anvendes til at analysere de rumlige og tidsmæssige aspekter af ardannelse. Den rumlige analyse anvender 2D og 3D immunmærkning af væv til at studere rumlig lokalisering af cellulære og matrixkomponenter inden for udvikling af arvæv. Spatiotemporale undersøgelser tillader visualisering af disse ex situ-ar ved hjælp af vævs indre eller ydre fluorescerende proteiner, der kan visualiseres ved hjælp af relevante 3D-time-lapse-billeddannelsesmetoder.
De afgørende trin i dette assay er at oprette eksperimentet ved omhyggeligt at generere biopsistans i fuld tykkelse, sikre tilstedeværelsen af et fascialt "gelé" -lag og dyrke vævet helt nedsænket på hovedet (epidermis mod bunden af pladerne med 96 brønde). Dette muliggør udvikling af ensartede ar, sammenlignelig migrationsdynamik af relevante fibroblastpopulationer og hudkontraktion på tværs af SCAD'er (figur 1A). Alsidigheden af SCAD-assay gør det muligt at høste vævet på tværs af hele spektret af arudvikling. For eksempel, hvis formålet med eksperimentet er at studere den tidlige dynamik i ardannelse, kan rumlig og spatiotemporal analyse begrænses til D1 eller D2 af SCAD-kulturen (figur 1B).
Repræsentative helmonterede lysfeltbilleder af SCAD'er på dag 0 og dag 5 er vist i henholdsvis figur 2A og figur 2A'. Til 2D-analyse er det vigtigt at indlejre SCAD'erne i OCT i vinkelret orientering uden luftbobler for at sikre intakt væv efter sektionering. Disse vævssektioner kan endvidere underkastes histologisk analyse (f.eks. Masson-trikromfarvning-figur 2B,2B') eller immunofluorescensfarvning (figur 2C,2C') på kryolektionerne fra En1 Cre,R26mTmG muse dorsal dermis; EPF i grøn og ENF i rød fra tidlig (figur 2D) og sen ar (figur 2D').
3D- og 3D-timelapse-billeddannelse af ar kræver detektering af fluorescenssignaler dybt inde i vævet (400-800 μm). Excitation i nær-infrarøde bølgelængder ved hjælp af to-foton excitation muliggør sådanne målinger uden behov for vævsclearing, en metode, der almindeligvis anvendes i 3D-billeddannelse for at gøre vævet gennemsigtigt ved at minimere lysspredning og absorption 15,16,17. Vi brugte et opretstående Multiphoton-mikroskop udstyret med et 25x vanddyppende mål i kombination med en justerbar laser. Væv blev udsat for 3D-immunfarvning ved hjælp af relevante sonder. Til 3D-billeddannelse blev vævet indlejret i en 2% lavtsmeltende agaroseopløsning for at immobilisere eller forhindre drift i væv (figur 3A) toppet med PBSGT for at matche det brydningsindeks, der kræves til vandnedsænkningsmålet. Repræsentativt billede i figur 3B og figur 3B 'viser eksklusiv lokalisering af N-Cadherin-protein (pink / magenta-Alexa fluor 647) på arstedet for en dag 5 SCAD fra en En1Cre, R26mTmG ryghud; EPF i grøn og ENF i rød. For 3D-time-lapse-billeddannelse blev der foretaget en lille ændring af ovenstående opsætning ved at indlejre vævet i en 2% lavsmeltende agaroseopløsning toppet med DMEM / F12-medier uden phenolrød indikator i stedet for PBS. For at sikre de rette betingelser for "levende" SCAD-væv under billeddannelse blev der tilføjet et passende inkubationskammer, så alle fænotyper registreres korrekt under billeddannelse (figur 3C). Repræsentative snapshots af tidlige fibroblastsværme er vist i figur 3D, figur 3D' og figur 3D'' over de første 12 timer/tidlige stadier af arudviklingen.
Figur 1: Skematisk arbejdsgang af SCAD-assay. (A) Ryghud fra postnatal dag 0 / dag 1 hvalpe udskæres, hvilket sikrer vævsintegriteten indeholdende følgende dermale lag: Epidermis (E), papillær og retikulær dermis (PD og RD) og Fascia-lag (F) efterfulgt af 2 mm biopsistanser for at opnå dag 0 SCAD'er. B) SCAD'er kan derefter efterfølgende dyrkes i op til 5 dage med et valgfrit intermitterende høst-/vævsfikseringstrin baseret på arten af individuelle forsøg (stiplete pile) med et kulturmedieændringstrin på dag 2 og dag 4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: 2D immunofluorescensfarvning. Repræsentative 2D-udlæsninger til undersøgelse af tidlige og sene ar ved hjælp af (A og A') Bright field helmonteret billede på dag 0 (A) og dag 5 (A'). (B og B') Massons trikromfarvning af lodrette vævssektioner for at afsløre signaturer af vævsardannelse-vævskontraktion og ophobning af ECM i arkernen (gul fyldt trekant) på dag 0 (B) og dag 5 (B'). (C og C') Immunofluorescensanalyse af dag 0 (C) og dag 5 (C') SCAD'er genereret fra En1 Cre,R26mTmG ryghud. EPF'er vises i grønt, ENF i rødt og DAPI i blåt fra tidligt (D) og sent stadium (D') ar. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk opsætning og repræsentative udlæsninger af SCAD'er til 3D-spatio- og spatiotemporal analyse. (A) Skematisk repræsentation af indlejring af SCAD'erne i 2% agarosegel med lav smeltetemperatur under et opretstående fluorescerende mikroskop og (B) repræsentativt billede af en 3D-immunofluorescerende farvet dag 5 SCAD genereret fra En1 Cre,R26mTmG mus dermis og immunfarvet med N-Cadherin antistof (Magenta). EPF'er vises med grønt, og ENF'er vises med rødt. (C) Skematisk repræsentation 3D-billedbehandling SCAD-opsætning udstyret med et inkubationskammer: 37 °C, 21 % (v/v) ilt, 5 % (v/v) C02 og 95 % fugtighed. (D) Repræsentative resultater af levende billeddannelse, der viser tidlige hændelser med progression af fibroblastsværme (hvid stiplet cirkel) i de første 12 timer på dag 0 og dag 1 fase SCAD. E) Grafisk gengivelse af enkeltcellesporede cellebaner for individuelle fibroblaster ved D, D' og D'«. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere modeller er allerede udviklet til at forstå ardannelse efter skade. Selv om der er gjort mange fremskridt i denne henseende, men de faktiske mekanismer er stadig ikke klare. I modsætning til den tidligere teknik inkorporerer SCAD-modellen alle celletyper og kutane lag og opretholder derved kompleksiteten af indfødt hud18,19. Denne metode er i stand til at generere grundlæggende datasæt, der er vigtige for at forstå molekylære mekanismer, der driver ardannelse. Assayet er designet på en måde, der er enkel, minimalistisk, men alligevel i stand til at producere grundlæggende og funktionelle udlæsninger, der er afgørende for at forstå fibroblastmigration, ECM-aflejring, epidermal / muskelkontraktion13,14. Det er relativt mindre komplekst end in vivo-opsætninger, og afvigelser med hensyn til prøven kan minimeres. Desuden kan dette assay let kombineres med rørledninger til analyse med høj kapacitet. Hvor hele spektret eller bibliotekerne af hæmmere eller aktivatorer såsom kemiske forbindelser, neutraliserende antistoffer, siRNA eller virale metoder, der reducerer eller fremmer ardannelse, kunne anvendes med relativ lethed til minimale mængder udskåret væv. Med hensyn til begrænsningen af denne ex vivo armodel kan dette assay ikke anvendes til at studere fænotypiske eller dynamiske aspekter af a) ikke-hjemmehørende immunsværme i arudvikling b) vaskularisering c) armodning, da væv ikke er levedygtigt ud over 5 dage efter skade.
Før biopsi slår excision, er det vigtigt, at der ikke må være resterende blod tilbage i vævet, da det kan forstyrre forsøgets forløb. Vi anbefaler at vaske vævet mere end én gang med HBSS, hvis det er nødvendigt, for at sikre, at eventuelt resterende blod fra vævet elimineres. Skiftende medier på alternative dage skal også udføres med særlig omhu, da de dermale og epidermale lag kan adskilles på grund af vævets lille størrelse. Derfor er det bydende nødvendigt at øve proceduren korrekt på forhånd, inden man starter egentlige eksperimenter. For at undgå gentagen adskillelse af vævslagene foreslår vi, at der under medieændring kan opbevares 10 μl resterende medier, før de udskiftes med friske medier for at stabilisere vævet og minimere ændringen i overfladespændingen på vævet forårsaget af mediet tilsat brønden.
Til 2D-analyserørledninger anbefaler vi at ligestille vævet med væskeoptimal skæretemperaturforbindelse ved stuetemperatur i et par minutter, før vævet monteres i en blok. Dette forhindrer vævsseparation på grund af iskrystaldannelse under sektionering. 3D/3D time-lapse-billeddannelsesrørledninger bør ændres tilstrækkeligt baseret på den tilgængelige mikroskopmodalitet. For et opretstående mikroskop (med eller uden vandnedsænkningsmål) forhindrer indlejring af vævet i agarose eller brug af superlim den fysiske forskydning af væv under billeddannelse. Vandnedsænkningsmål tillader 3D / 3D time-lapse-billeddannelse ved hjælp af PBS eller farveløse medier (uden phenolrød). For et omvendt mikroskop kan væv placeres på en glasbund / billedplade og immobiliseres ved hjælp af et fald af agarose med lav smeltetemperatur og toppes med passende medier for at sikre levedygtighed under levende billeddannelse. I begge modaliteter kan et kompatibelt inkubationssystem bruges til at sikre den rigtige temperatur, fugtighed og gasforsyning under billeddannelse.
Afslutningsvis muliggør SCAD-modellen identifikation og karakterisering af nye molekylære signaler og mekanistiske veje involveret i pattedyrs sårheling13,14. Protokollen giver en detaljeret beskrivelse af genereringen af SCAD'er og potentielle downstream-applikationer og analyser for at give indsigt i arudvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi anerkender alle medforfatterne af Jiang et al. 2020 for at bidrage til udviklingen af SCAD-metoden13. Vi takker Dr. Steffen Dietzel og Bioimaging-kerneanlægget ved Ludwig-Maximilans-Universität for adgang til Multiphoton-systemet. Y.R. blev støttet af Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) og LEO Fondet (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
