Summary
Dit protocol beschrijft het genereren van een huid-fascia explant genaamd "SCar like tissue in A Dish" of SCAD. Dit model maakt een ongekende visualisatie van enkele fibroblasten mogelijk tijdens littekenvorming.
Abstract
De wereldwijde reactie van zoogdieren op het afdichten van diepe weefselwonden is door littekenvorming en weefselcontractie, gemedieerd door gespecialiseerde fascia fibroblasten. Ondanks de klinische betekenis van littekenvorming en verminderde wondgenezing, is ons begrip van fascia fibroblastdynamica bij wondgenezing vluchtig vanwege het gebrek aan relevante assays die directe visualisatie van fibroblastchoreografie en -dynamiek in complexe omgevingen zoals in huidwonden mogelijk maken. Dit artikel presenteert een protocol om ex-situ huidlittekens te genereren met behulp van SCAD of "SCar-achtig weefsel in A Dish" dat de complexe omgeving van huidwonden nabootst. In deze test wordt de huid van 2 mm van volledige dikte weggesneden en ondersteboven gekweekt in media gedurende 5 dagen, gedurende welke littekens en huidcontracturen zich uniform ontwikkelen. Deze methodologie, in combinatie met fibroblast-lineage specifieke transgene muismodellen, maakt visualisatie van individuele fibroblastlijnen over het hele wondherstelproces mogelijk. Over het algemeen helpt dit protocol onderzoekers bij het begrijpen van fundamentele processen en mechanismen van wondherstel, waarbij de effecten van modulatoren op wondgenezingsresultaten direct worden onderzocht.
Introduction
Wondgenezing is een proces van herstel van gebroken wonden. Weefselletsels bij ongewervelde dieren resulteren in gedeeltelijke of volledige regeneratie. Daarentegen reageren zoogdieren op diep letsel door littekens, een proces dat is afgestemd op het snel afdichten van wonden met dichte pluggen van matrixvezels die het doorgebroken gebied minimaliseren en tegelijkertijd de gewonde site permanent vervormen 1,2,3. Grote brandwonden op de huid of diepe open wonden bij zoogdieren resulteren in pathologische fenotypen zoals hypertrofische of keloïde littekens 4,5. Deze uitbundige littekens veroorzaken een enorme belasting voor klinische en wereldwijde gezondheidszorgsystemen. Alleen al in de VS kost littekenbeheer jaarlijks ongeveer $ 10 miljard 6,7. Daarom is de ontwikkeling van relevante methodologieën nodig om de fundementale processen en mechanismen die betrokken zijn bij littekenvorming beter te begrijpen.
In de afgelopen jaren heeft een breed scala aan studies bij muizen heterogene fibroblastpopulaties onthuld met verschillende functionele potenties op basis van hun oorsprong op bepaalde huidlocaties 8,9,10. In de achterhuid identificeerden Rinkevich et al., 2015, dat een specifieke fibroblastpopulatie met een vroege embryonale expressie van Engrailed-1 (En1), epf (engrailed positive fibroblast) genoemd, bijdraagt aan cutane littekens bij verwonding. Omgekeerd draagt een andere fibroblastlijn zonder voorgeschiedenis van ingebakken expressie, Engrailed negative fibroblast (ENF), niet bij aan littekenvorming8. Het in kaart brengen van deze En1-afstammingslijnen met behulp van Cre-gestuurde transgene muislijnen gekruist naar fluorescentie reporter muislijnen zoals R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) maakt visualisatie van EPF- en ENF-populaties mogelijk.
Het bestuderen van fibroblastmigratie in vivo gedurende meerdere dagen wordt beperkt door ethische en technische beperkingen. Bovendien is het technisch een technische uitdaging om samengestelde, virale en neutraliserende antilichaambibliotheekschermen te moduleren om routes te moduleren die betrokken zijn bij littekens. Eerder gebruikte in vitro of ex vivo modellen missen het vermogen om fibroblastmigratie en littekenvorming in echte huidmicro-omgevingen, uniformiteit in littekenontwikkeling en weefselcomplexiteit die in vivo huidomgevingen emuleertte visualiseren 11,12. Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een ex vivo littekentest genaamd SCAD (SCar-achtig weefsel in A Dish)13,14. Deze eenvoudige test kan worden uitgevoerd door een huid van 2 mm van volledige dikte met de epidermis, de dermis en de subcutane fasciaregio's te exciëren en deze gedurende maximaal 5 dagen te kweken in dmso-media met serumsupplement. Littekens gegenereerd door SCAD repliceren op betrouwbare wijze transcriptomische en proteomische kenmerken van in vivo littekens. Bovendien maken SCADs gegenereerd uit relevante transgene muislijnen (bijv. En1-muizen) gekruist met fluorescerende reportermuislijnen de visualisatie van fibroblastmigratiedynamiek en littekenontwikkeling met een ongekende resolutie mogelijk. Bovendien kan dit model eenvoudig worden aangepast voor toepassingen met een hoge doorvoer (bijv. compound library, antilichaambibliotheek of virale screening)13,14. In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om SCADs en daaropvolgende downstream verwerkingstoepassingen te genereren om cellulaire en matrixdynamiek in littekenontwikkeling te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het onderstaande model geeft een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de generatie van SCAD-assay zoals kort beschreven in Jiang et al., 202013. SCAD-monsterpreparaten werden uitgevoerd na het offeren van de dieren volgens de internationale en de richtlijnen van de regering van Opper-Beieren. Dieren werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van het Helmholtz Centre München. De kamers werden onderhouden met een optimale luchtvochtigheid en constante temperatuur met een lichtcyclus van 12 uur. Dieren werden ad libitum voorzien van voedsel en water.
1. SCAD weefselpreparaat
- Offer pasgeboren pups op postnatale dag 0 of dag 1 (P0 of P1).
- Snijd voorzichtig ten minste 1,5 cm x 1,5 cm volledige dikte dorsale rughuid tot de skeletspierlaag met behulp van een steriel chirurgisch scalpel.
- Pel de huid met behulp van steriele gebogen tang, zodat de oppervlakkige fascia intact is met de onderliggende panniculus carnosus spier.
- Was het weggesneden weefsel met 50-100 ml koude DMEM / F-12-media om besmettelijk bloed te verwijderen.
- Was eenmaal met Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) om de levensvatbaarheid van weefsel en cellen te behouden.
- Plaats de huid ondersteboven (oppervlakkige fascia bovenop) in een petrischaaltje van 10 cm met DMEM/F12-media.
- Met behulp van een wegwerp 2 mm biopsy punch, snijd volledige dikte ronde huidstukken, ervoor zorgen dat oppervlakkige fascia intact is met onderliggende panniculus carnosus spier tot de epidermis om SCAD weefsels te genereren.
- Bereid en vul 200 μL DMEM/F12 (zonder fenolrood) complete media-DMEM/F12 media aangevuld met 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM niet-essentiële aminozuren en 1x Penicilline/streptomycine in individuele putjes van een 96-well plaat.
- Breng met behulp van een steriele tang zorgvuldig individueel SCAD-weefsel ondersteboven (fascia naar boven gericht) over en dompel het volledig onder in de putten van een 96-well plaat.
- Breng de plaat over naar een celkweekincubator die onder standaardomstandigheden wordt onderhouden (37 °C, 21% (v/v) zuurstof, 5% (v/v) C02 en 95% vochtigheid).
2. SCAD - Weefselkweek
- Kweek SCADs in een incubator gedurende maximaal 5 dagen.
- Vervang op dag 2 en dag 4 van de kweek de media door 200μl verse voorverwarmde DMEM / F12 complete media om voortdurende levensvatbaarheid van cellen en weefsels te garanderen. Vervang behandelingsstoffen tijdens elke mediawissel.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u 10 μL media in de put laat om te voorkomen dat weefsels aan de putjes blijven plakken. - Bereid SCADs voor op de volgende experimenten: Live imaging (sectie 3) en Tissue Harvesting en 2D/3D immunofluorescentiekleuring (sectie 4).
3. Live beeldvorming van SCADs
- Bereid een minimum van 30 ml van 2% -3% (w / v) laagsmeltende agarose-oplossing in PBS in een glazen fles door deze in een magnetron te verwarmen totdat deze kookt.
- Breng de fles onmiddellijk over en koel de vloeibare agarose-oplossing in een waterbad van 40 °C.
- Breng het SCAD-weefsel met fascia/scar naar boven gericht over op het midden van een schotel van 35 mm.
- Sluit de SCAD in bij kamertemperatuur (RT) door met behulp van een Pasteur pipet langzaam 40 °C vloeibare agarose over te brengen op de 35 mm schotel. Agarose polymeriseert binnen 2 min.
- Voeg 2 ml voorverwarmde DMEM/F12 complete media toe (zonder fenolrode indicator).
- Verkrijg time-lapse-beelden van dag 0 SCADs tot 48 uur met behulp van een confocale of een multifotonenmicroscoop uitgerust met een geschikt incubatiesysteem ingesteld op 37 °C, 21% (v/v) zuurstof, 5% (v/v) C02 en 95% vochtigheid.
4. Weefseloogst en 2D/3D immunofluorescentiekleuring
- Was de weefsels op relevante tijdstippen door de media te vervangen door steriel PBS.
- Breng met behulp van een steriele tang zorgvuldig afzonderlijke SCADs over naar microcentrifugebuizen van 1,5 ml die 500 μL 2% paraformaldehyde bevatten om de weefsels 's nachts bij 4 °C te fixeren.
- Was de weefsels driemaal met PBS en ga verder met 2D/3D immunofluorescentiekleuring.
- 3D immunofluorescentie kleuring
- Permeabiliseer de weefsels door te incuberen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 500 μL PBS aangevuld met 0,2% gelatine, 0,5% Triton-X100 en 0,01% Thimerosal (PBSGT) bij RT gedurende 24 uur.
- Bereid een voldoende hoeveelheid primaire antilichamen volgens de instructies van de fabrikant en incubeer SCAD-weefsels in 150 μL PBSGT-oplossing gedurende 24 uur bij RT.
OPMERKING: Als de optimale antilichaamconcentratie voor immuunfluorescentie niet door de fabrikant wordt gemeld, moet eerdere antilichaamtitratie worden uitgevoerd op controleweefsels met verschillende concentraties (bijv. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Was de SCADs voorzichtig drie keer met PBS om het ongebonden primaire antilichaam te verwijderen.
- Incubateer weefsel met 1:1000 relevante Alexa Fluor secundaire antilichamen in PBS 's nachts bij RT.
- Was het weefsel gedurende 30 minuten in PBS driemaal voorzichtig om overtollige ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.
- Breng het weefsel over op een 35 mm glazen bodemschaal voor confocale of multifoton beeldvorming.
OPMERKING: Bij gebruik van onderdompelingsdoelstellingen in water, integreer de SCADs in 2% laag smeltpunt agarose om het weefsel te immobiliseren om driften tijdens beeldacquisitie te voorkomen
- 2D immunofluorescentie kleuring
- Breng het weefsel over naar een cryo-mal en vul voorzichtig met optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding om het weefsel volledig onder te dompelen.
- Pas de oriëntatie van het weefsel voorzichtig aan en zorg voor de afwezigheid van luchtbellen om een doorsnede of een verticale sectie te verkrijgen.
- Plaats de vorm 20-30 min op droogijs en incubeer het blok een nacht op -80 °C.
- Stel de bladtemperatuur in op -25 °C en de temperatuur van het monsterblok op -17 °C. Bereid een cryosectie van 6 μm voor met behulp van een cryostaat, breng de secties over op een hechtingsschuif en bewaar de dia's in een vriezer van -20 °C.
- Spoel de glaasjes driemaal in PBS en incubeer de glaasjes in 5% Bovine Serum Albumin (BSA) w/v in PBST (PBS aangevuld met 0,05% Tween) gedurende 1 uur.
- Voeg een geschikte hoeveelheid primair antilichaam toe aan 150μl PGST en incubeer een nacht bij 4 °C
OPMERKING: Als de optimale antilichaamconcentratie voor immuunfluorescentie niet door de fabrikant wordt gerapporteerd, moet eerdere antilichaamtitratie worden uitgevoerd op controlesecties met verschillende concentraties (bijv. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Was de secties voorzichtig drie keer met PBS om het ongebonden primaire antilichaam te verwijderen.
- Incubeer weefsel met 1:1000 relevante Alexa Fluor secundaire antilichamen in PBS gedurende 2 uur bij RT.
- Was het weefsel gedurende 5 minuten in PBS driemaal voorzichtig om overtollige ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.
- Monteer de dia's met een montagemedium met DAPI en droog de dia's in het donker bij RT.
- Stel de secties voor met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het genereren van SCADs kan worden onderverdeeld in drie essentiële stappen: het oogsten van de huid van P0-P1-muizen, het genereren van biopsieponsen van volledige dikte en de daaropvolgende kweek van individuele scads tot 5 dagen in 96-well platen. Als uitlezing kan deze test verder worden toegepast om de ruimtelijke en temporele aspecten van littekens te analyseren. De ruimtelijke analyse maakt gebruik van 2D- en 3D-immuunlabeling van weefsels om ruimtelijke lokalisatie van cellulaire en matrixcomponenten in zich ontwikkelend littekenweefsel te bestuderen. Spatiotemporale studies maken visualisatie van deze ex-situ littekens mogelijk met behulp van weefselintrinsieke of extrinsieke fluorescerende eiwitten die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van relevante 3D time-lapse beeldvormingsmodaliteiten.
De cruciale stappen in deze test zijn het opzetten van het experiment door zorgvuldig biopsieponsen van volledige dikte te genereren, de aanwezigheid van een fasciale "gelei" -laag te garanderen en het weefsel volledig ondersteboven ondergedompeld te kweken (epidermis naar de onderkant van de 96-putplaten). Dit maakt de ontwikkeling van uniforme littekens, vergelijkbare migratiedynamiek van relevante fibroblastpopulaties en huidcontractie tussen SCADs mogelijk (figuur 1A). De veelzijdigheid van SCAD-assay maakt het mogelijk om het weefsel over het hele spectrum van littekenontwikkeling te oogsten. Als het doel van het experiment bijvoorbeeld is om de vroege dynamiek van littekens te bestuderen, kan ruimtelijke en spatiotemporale analyse worden beperkt tot D1 of D2 van de SCAD-cultuur (figuur 1B).
Representatieve full-mount bright-field beelden van SCADs op dag 0 en dag 5 zijn weergegeven in respectievelijk figuur 2A en figuur 2A'. Voor 2D-analyse is het essentieel om de SCADs in OCT in te bedden in loodrechte oriëntatie zonder luchtbellen om intactheid van weefsel na sectie te garanderen. Deze weefselsecties kunnen verder worden onderworpen aan histologische analyse (bijv. Masson trichrome kleuring-Figuur 2B,2B') of Immunofluorescentiekleuring (Figuur 2C,2C') op de cryosecties van En1 Cre,R26mTmG muis dorsale dermis; EPF in groen en ENF in rood vanaf vroeg (figuur 2D) en laat stadium litteken (figuur 2D').
3D- en 3D-time-lapse-beeldvorming van littekens vereist het detecteren van fluorescentiesignalen diep in het weefsel (400-800 μm). Excitatie in nabij-infrarode golflengten met behulp van twee-foton excitatie maakt dergelijke metingen mogelijk zonder de noodzaak van weefselverwijdering, een methodologie die vaak wordt gebruikt in 3D-beeldvorming om weefsel transparant te maken door lichtverstrooiing en -absorptie te minimaliseren 15,16,17. We gebruikten een rechtopstaande Multiphoton microscoop uitgerust met een 25x water-dippend objectief in combinatie met een afstembare laser. Weefsels werden onderworpen aan 3D-immuunkleuring met behulp van relevante sondes. Voor 3D-beeldvorming werd het weefsel ingebed in een 2% laagsmeltende agarose-oplossing om drift in weefsel te immobiliseren of te voorkomen (figuur 3A) aangevuld met PBSGT om overeen te komen met de brekingsindex die nodig is voor het wateronderdompelingsdoel. Representatief beeld in figuur 3B en figuur 3B' toont exclusieve lokalisatie van N-Cadherine-eiwit (roze / magenta-Alexa fluor 647) op de littekenplaats van een dag 5 SCAD van een En1Cre, R26mTmG-achterhuid; EPF in groen en ENF in rood. Voor 3D time-lapse beeldvorming werd een kleine wijziging aangebracht in de bovenstaande opstelling door het weefsel in te bedden in een 2% laag smeltende agarose-oplossing bedekt met DMEM / F12-media zonder fenolrode indicator in plaats van PBS. Om de juiste omstandigheden voor "levend" SCAD-weefsel tijdens de beeldvorming te garanderen, werd een geschikte incubatiekamer toegevoegd, zodat alle fenotypen correct worden geregistreerd tijdens beeldvorming (figuur 3C). Representatieve snapshots van vroege fibroblastzwermen worden getoond in figuur 3D, figuur 3D' en figuur 3D'' over de eerste 12 h/vroege stadia van littekenontwikkeling.
Figuur 1: Schematische workflow van SCAD-assay. (A) Terughuid van postnatale dag 0 / dag 1 pups worden weggesneden, waardoor de weefselintegriteit wordt gewaarborgd die de volgende dermale lagen bevat: Epidermis (E), papillaire en reticulaire dermis (PD en RD), en Fascia-laag (F), gevolgd door 2 mm biopsieponsen om dag 0 SCADs te verkrijgen. (B) SCADs kunnen vervolgens gedurende maximaal 5 dagen worden gekweekt met een optionele intermitterende oogst/weefselfixatiestap op basis van de aard van individuele experimenten (gestippelde pijlen) met een cultuurmediaveranderingsstap op dag 2 en dag 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: 2D immunofluorescentiekleuring. Representatieve 2D-uitlezingen om littekens in een vroeg en laat stadium te bestuderen met behulp van (A en A') Helder veldbeeld met hele montage op dag 0 (A) en dag 5 (A'). (B en B') Masson's trichrome kleuring van verticale weefselsecties om handtekeningen van weefsel littekenvorming-weefselcontractie en accumulatie van ECM in de littekenkern (geel gevulde driehoek) op dag 0 (B) en dag 5 (B') te onthullen. (C en C') Immunofluorescentieanalyse van dag 0 (C) en dag 5 (C') SCADs gegenereerd uit En1 Cre,R26mTmG achterhuid. EPF's worden weergegeven in groen, ENF in rood en DAPI in blauw vanaf het litteken in het vroege (D) en het late stadium (D'). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematische opstelling en representatieve uitlezingen van SCADs voor 3D-spatio- en spatiotemporale analyse. (A) Schematische weergave van het inbedden van de SCADs in 2% lage smelttemperatuur agarosegel onder een rechtopstaande fluorescerende microscoop en (B) representatief beeld van een 3D-immunofluorescente gekleurde dag 5 SCAD gegenereerd uit En1 Cre,R26mTmG muis dermis en immuun-gekleurd met N-Cadherine antilichaam (Magenta). EFF's worden in het groen weergegeven en de ENF's in het rood. (C) Schematische weergave 3D imaging SCAD setup uitgerust met een incubatiekamer: 37 °C, 21% (v/v) zuurstof, 5% (v/v) C02 en 95% vochtigheid. (D) Representatieve resultaten van live beeldvorming die vroege gebeurtenissen van progressie van fibroblastzwermen (witte stippelcirkel) laten zien in de eerste 12 uur van dag 0 en dag 1 stadium SCAD. (E) Grafische weergave van eencellige gevolgde cellulaire trajecten van individuele fibroblasten bij D, D' en D''. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn al verschillende modellen ontwikkeld om littekenvorming na letsel te begrijpen. Hoewel er in dit opzicht veel vooruitgang is geboekt, zijn de werkelijke mechanismen nog steeds niet duidelijk. In tegenstelling tot de vorige techniek bevat het SCAD-model alle celtypen en cutane lagen, waardoor de complexiteit van native skin18,19 behouden blijft. Deze methodologie is in staat om fundamentele datasets te genereren die belangrijk zijn voor het begrijpen van moleculaire mechanismen die littekenvorming stimuleren. De test is ontworpen op een manier die eenvoudig, minimalistisch is, maar toch in staat is om fundamentele en functionele uitlezingen te produceren die cruciaal zijn voor het begrijpen van fibroblastmigratie, ECM-afzetting, epidermale / spiercontractie13,14. Het is relatief minder complex dan in vivo opstellingen en afwijkingen ten opzichte van het monster kunnen worden geminimaliseerd. Verder kan deze test eenvoudig worden gekoppeld aan analysepijplijnen met hoge doorvoer. Waarin het hele spectrum of bibliotheken van remmers of activatoren zoals chemische verbindingen, neutraliserende antilichamen, siRNA of virale methodologieën die littekens verminderen of bevorderen, relatief gemakkelijk kunnen worden toegepast op minimale hoeveelheden weggesneden weefsels. Met betrekking tot de beperking van dit ex vivo littekenmodel kan deze test niet worden toegepast op het bestuderen van fenotypische of dynamische aspecten van a) niet-residente immuunzwermen in littekenontwikkeling b) vascularisatie c) littekenrijping omdat weefsel niet levensvatbaar is na 5 dagen na het letsel.
Voordat biopsie excisie slaat, is het belangrijk dat er geen restbloed in het weefsel achterblijft, omdat dit de werking van het experiment kan verstoren. We raden aan om het weefsel indien nodig meer dan eens met HBSS te wassen om ervoor te zorgen dat eventueel restbloed uit het weefsel wordt geëlimineerd. Ook moet het veranderen van media op afwisselende dagen met speciale zorg worden uitgevoerd, omdat de dermale en epidermale lagen kunnen scheiden vanwege de kleine omvang van het weefsel. Daarom is het noodzakelijk om de procedure van tevoren goed te oefenen voordat u met daadwerkelijke experimenten begint. Om herhaalde scheiding van de weefsellagen te voorkomen, stellen we voor dat tijdens mediaverandering 10 μl restmedia kan worden bewaard voordat ze worden vervangen door verse media om het weefsel te stabiliseren en de verandering in oppervlaktespanning op het weefsel veroorzaakt door de media die aan de put zijn toegevoegd, te minimaliseren.
Voor 2D-analysepijplijnen raden we aan om het weefsel een paar minuten te balanceren met vloeistofoptimale snijtemperatuurverbinding bij kamertemperatuur voordat het weefsel in een blok wordt gemonteerd. Dit voorkomt weefselscheiding door ijskristalvorming tijdens het doorsnijden. 3D/3D time-lapse beeldvormingspijplijnen moeten adequaat worden aangepast op basis van de beschikbare microscoopmodaliteit. Voor een rechtopstaande microscoop (met of zonder wateronderdompelingsobjectief) voorkomt het inbedden van het weefsel in agarose of het gebruik van secondelijm de fysieke verschuiving van weefsel tijdens beeldvorming. Wateronderdompelingsdoelstellingen maken 3D / 3D time-lapse-beeldvorming mogelijk met behulp van PBS of kleurloze media (zonder fenolrood). Voor een omgekeerde microscoop kan weefsel op een glazen bodem / beeldvormingsplaat worden geplaatst en worden geïmmobiliseerd met behulp van een druppel agarose bij lage smelttemperatuur en bedekt met geschikte media om de levensvatbaarheid tijdens live beeldvorming te garanderen. In beide modaliteiten kan een compatibel incubatiesysteem worden gebruikt om de juiste temperatuur, vochtigheid en gastoevoer tijdens het afbeelden te garanderen.
Kortom, het SCAD-model maakt de identificatie en karakterisering mogelijk van nieuwe moleculaire signalen en mechanistische routes die betrokken zijn bij de wondgenezing van zoogdieren13,14. Het protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het genereren van SCADs en potentiële downstream toepassingen en analyse om inzicht te geven in littekenontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We erkennen alle co-auteurs van Jiang et al. 2020 voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van SCAD-methodologie13. We bedanken Dr. Steffen Dietzel en de Bioimaging-kernfaciliteit aan de Ludwig-Maximilans-Universität voor de toegang tot het Multiphoton-systeem. Y.R. werd ondersteund door de Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), de European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) en de LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
