Summary
このプロトコルは、「A DishのSCar様組織」またはSCADと呼ばれる皮膚筋膜外植体の生成を記述する。このモデルは、瘢痕形成中の単一線維芽細胞の前例のない視覚化を可能にする。
Abstract
深部組織創傷の封入に対する哺乳類の世界的な応答は、特殊な筋膜線維芽細胞によって媒介される瘢痕形成および組織収縮によるものである。瘢痕形成および創傷治癒障害の臨床的意義にもかかわらず、創傷治癒における筋膜線維芽細胞動態の我々の理解は、皮膚創傷などの複雑な環境における線維芽細胞振り付けおよび動態の直接可視化を可能にする関連アッセイの欠如のために大雑把である。この論文は、皮膚創傷の複雑な環境をエミュレートするSCADまたは「A Dish内のSCar様組織」を使用して 、その場で 皮膚瘢痕を生成するためのプロトコルを提示する。このアッセイでは、2mmの全厚皮膚を切除し、培地中で5日間逆さまに培養し、その間に瘢痕および皮膚拘縮が均一に発達する。この方法論は、線維芽細胞系譜特異的トランスジェニックマウスモデルと相まって、創傷修復プロセス全体にわたる個々の線維芽細胞系統の視覚化を可能にする。全体として、このプロトコルは、創傷修復の基本的なプロセスとメカニズムを理解する上で研究者を支援し、創傷治癒結果に対するモジュレーターの効果を直接探求する。
Introduction
創傷治癒は、破られた創傷の修復のプロセスである。無脊椎動物の組織損傷は、部分的または完全な再生をもたらす。対照的に、哺乳動物は、損傷部位1、2、3を永久に変形させるマトリックス繊維の緻密なプラグで創傷を迅速に密封するように調整されたプロセスである瘢痕化によって深い傷害に応答する。哺乳類における大きな皮膚火傷または深く開いた創傷は、肥厚性またはケロイド瘢痕などの病理学的表現型をもたらす4,5。これらの熱狂的な傷跡は、臨床および世界の医療システムに多大な負担を引き起こします。米国だけでも、瘢痕管理には年間約100億ドルの費用がかかります6,7。したがって、瘢痕形成に関与する基礎プロセスおよびメカニズムをよりよく理解するために、関連する方法論の開発が必要である。
近年、マウスにおける広範囲の研究により、特定の皮膚位置におけるそれらの起源に基づいて、別個の機能的効力を有する不均一な線維芽細胞集団が明らかになった8、9、10。背部皮膚において、Rinkevich et al., 2015は、EPF(Engrailed 陽性線維芽細胞)と呼ばれるEngrailed-1(En1)の初期胚性発現を有する特定の線維芽細胞集団が、創傷時の皮膚瘢痕化に寄与することを同定した。逆に、エングレイル発現の病歴のない別の線維芽細胞系統、エングレイルドネガティブ線維芽細胞(ENF)は、瘢痕形成8に寄与しない。R26 mTmG(En1Cre x R26mTmG)などの蛍光レポーターマウス系統に交差したCre駆動トランスジェニックマウス系統を用いたこれらのEn1系統の運命マッピングは、EPFおよびENF集団の可視化を可能にする。
数日間にわたるインビボでの線維芽細胞移動を研究することは、倫理的および技術的制約によって制限される。さらに、化合物、ウイルスおよび中和抗体ライブラリーをスクリーニングして、瘢痕化に関与する経路を調節することは技術的に困難である。以前に使用されていたインビトロまたはエキソビボモデルは、本物の皮膚微小環境における線維芽細胞移動および瘢痕形成、瘢痕発生における均一性、ならびにインビボ皮膚環境をエミュレートする組織の複雑さを視覚化する能力を欠いている11、12。上記の制限を克服するために、我々はSCAD(A Dish中のSCar様組織)13,14と呼ばれるエクスビボ瘢痕化アッセイを開発しました。この簡単なアッセイは、表皮、真皮、および皮下筋膜領域を含む2mmの全厚皮膚を切除し、血清補充DMSO培地中で最大5日間培養することによって行うことができる。SCADから生成された瘢痕は、インビボ瘢痕のトランスクリプトームおよびプロテオミクスの特徴を確実に複製する。さらに、蛍光レポーターマウス系統と交配した関連するトランスジェニックマウス系統(例えば、En1マウス)から生成されたSCADは、線維芽細胞遊走ダイナミクスおよび瘢痕発生を前例のない解像度で視覚化することを可能にする。さらに、このモデルは、あらゆるハイスループットアプリケーション(例えば、化合物ライブラリー、抗体ライブラリー、またはウイルススクリーニング)に容易に適合させることができる13、14。この記事では、SCADを生成するための最適化されたプロトコルと、その後のダウンストリーム処理アプリケーションを使用して、瘢痕発生における細胞およびマトリックスのダイナミクスを研究します。
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Protocol
以下に提示されるモデルは、Jiang et al., 202013に簡単に記載されているように、SCADアッセイの生成の詳細なステップバイステップの説明を提供する。SCADサンプル調製は、国際およびオーバーバイエルン州政府のガイドラインに従って動物を犠牲にした後に実施した。動物はミュンヘンのヘルムホルツセンターの動物施設で飼育されました。部屋は12時間の光サイクルで最適な湿度と一定の温度で維持されました。動物には食物と水を 自由摂取させた。
1. SCAD組織調製
- 生後0日目または1日目(P0またはP1)に新生児の仔を犠牲にする。
- 滅菌外科用メスを用いて骨格筋層まで少なくとも1.5cm×1.5cmの全厚背部背部皮膚を慎重に切除する。
- 滅菌湾曲した鉗子を使用して皮膚を剥がし、表在筋膜が根底にあるパンニクルス・カルノーサス筋で無傷であることを確認する。
- 摘出した組織を50~100mLの冷たいDMEM/F-12培地で洗浄し、汚染された血液を除去します。
- ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)で一度洗って、組織と細胞の生存率を維持します。
- DMEM/F12培地を含む10cmのペトリ皿に皮膚を逆さま(上部に表在筋膜)置きます。
- 使い捨ての2mm生検パンチを用いて、全厚の丸い皮膚片を切除し、表皮まで下層のパンニクルス・カルノーサス筋で表在筋膜が無傷であることを確認し、SCAD組織を生成する。
- 10% FBS、1x GlutaMAX、1x MEM 非必須アミノ酸、および 1x ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した 200 μL の DMEM/F12 完全培地 (フェノールレッドなし) を 200 μL の完全培地 DMEM/F12 を調製し、96 ウェルプレートの個々のウェルに充填します。
- 滅菌鉗子を使用して、個々のSCAD組織を逆さま(筋膜が上を向いて)96ウェルプレートのウェルに慎重に移し、完全に沈めます。
- プレートを標準条件(37°C、21%(v/v)酸素、5%(v/v)C02、および湿度95%)で維持された細胞培養インキュベーターに移す。
2. SCAD - 組織培養
- SCADをインキュベーター内で最大5日間培養する。
- 培養2日目および4日目に、培地を200μlの新鮮な予め加温したDMEM/F12完全培地と交換し、細胞および組織の生存率条件の継続を確保します。各培地交換中に処理化合物を交換してください。
注: 組織がウェルに付着しないように、ウェルに 10 μL の培地を必ず残してください。 - ライブイメージング(セクション3)、組織採取および2D/3D免疫蛍光染色(セクション4)の実験用にSCADを準備します。
3. SCADのライブイメージング
- 2%-3%(w/v)低融点アガロース溶液をPBS中の最低30mLをガラス瓶に調製し、それを電子レンジで加熱して沸騰させる。
- 直ちにボトルを移し、液体アガロース溶液を40°Cの水浴中で冷却した。
- 筋膜/瘢痕を上向きにしてSCAD組織を35mm皿の中心に移す。
- パスツールピペットを用いて40°Cの液体アガロースを35mmディッシュ上にゆっくりと移すことによって、室温(RT)でSCADを埋め込む。アガロースは2分以内に重合する。
- 2 mL の加温済み DMEM/F12 完全培地 (フェノールレッド指示薬なし) を加えます。
- 37°C、21%(v/v)酸素、5%(v/v)C02、および湿度95%に設定された適切なインキュベーションシステムを備えた共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を使用して、0日目のSCADの最大48時間のタイムラプス画像を取得します。
4. 組織採取と2D/3D免疫蛍光染色
- 培地を滅菌PBSで交換することにより、関連する時点で組織を洗浄する。
- 滅菌鉗子を使用して、個々のSCADを500μLの2%パラホルムアルデヒドを含む1.5mL微量遠心チューブに慎重に移し、組織を4°Cで一晩固定した。
- PBSで組織を3回洗浄し、2D/3D免疫蛍光染色を続行します。
- 3D免疫蛍光染色
- 0.2% ゼラチン、0.5% Triton-X100、および 0.01% チメロサール (PBSGT) を添加した 500 μL の PBS を含む 1.5 mL の微量遠心チューブで RT で 24 時間インキュベートすることにより、組織を透過処理します。
- メーカーの指示に従って適切な量の一次抗体を調製し、SCAD組織を150μLのPBSGT溶液中でRTで24時間インキュベートする。
注:免疫蛍光に対する最適な抗体濃度が製造業者によって報告されていない場合、様々な濃度(例えば、1:50、1:200、1:500、1:1000)を使用して、対照組織に対して事前の抗体滴定を行う必要がある。 - SCADをPBSで3回穏やかに洗浄し、結合していない一次抗体を除去した。
- 1:1000の関連するAlexa Fluor二次抗体と共に組織をPBS中でRTで一晩インキュベートする。
- PBSで組織を30分間穏やかに3回洗浄し、過剰の未結合二次抗体を除去した。
- 共焦点または多光子イメージングのために、組織を35mmのガラス底皿に移す。
メモ:水浸漬対物レンズを使用する場合は、SCADを2%の低融点アガロースに埋め込んで組織を固定化し、画像取得中のドリフトを防ぎます。
- 2D免疫蛍光染色
- 組織をクライオモールドに移し、最適な切断温度(OCT)化合物を穏やかに充填して組織を完全に浸漬します。
- 組織の向きを穏やかに調整し、気泡が存在しないことを確認し、断面または垂直断面を得る。
- 金型をドライアイス上に 20 ~ 30 分間置き、ブロックを -80 °C で一晩インキュベートします。
- ブレード温度を-25°C、試料ブロック温度を-17°Cに設定します。 クライオスタットを用いて6μmのクライオセクションを作製し、接着スライド上に移し、-20°Cの冷凍庫に保管する。
- スライドをPBSで3回すすぎ、スライドをPBST(0.05%トゥイーンを添加したPBS)中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)w/vで1時間インキュベートします。
- 150μl PGSTに適量の一次抗体を加え、4°Cで一晩インキュベートした。
注:免疫蛍光に最適な抗体濃度が製造業者によって報告されていない場合は、さまざまな濃度(例えば、1:50、1:200、1:500、1:1000)を使用して、対照切片に対して事前の抗体滴定を行う必要があります。 - 切片をPBSで3回穏やかに洗浄し、結合していない一次抗体を除去した。
- PBS中の1:1000の関連するAlexa Fluor二次抗体と共に組織をRTで一晩2時間インキュベートする。
- PBS中で組織を5分間穏やかに3回洗浄し、過剰の未結合二次抗体を除去した。
- DAPIを含むマウント媒体でスライドをマウントし、RTで暗闇の中でスライドを乾燥させます。
- 蛍光顕微鏡を用いて切片を画像化する。
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Representative Results
SCADの生成は、P0-P1マウスから背部皮膚を採取すること、全厚生検パンチを生成すること、およびその後の個々のスカッドを96ウェルプレートで最大5日間培養することの3つの重要なステップに分けることができる。読み出しとして、このアッセイは、瘢痕化の空間的および時間的側面を分析するためにさらに適用することができる。空間解析では、組織の2Dおよび3D免疫標識を利用して、発達中の瘢痕組織内の細胞およびマトリックス成分の空間的局在を研究します。時空間研究は、関連する3Dタイムラプスイメージングモダリティを使用して視覚化することができる組織内因性または外因性蛍光タンパク質を使用して、これらの元 現場 瘢痕の視覚化を可能にする。
このアッセイの重要なステップは、全厚生検パンチを慎重に生成し、筋膜「ゼリー」層の存在を確認し、組織を完全に逆さまにして培養することによって実験を設定することです(表皮は96ウェルプレートの底に面しています)。これにより、均一な瘢痕の発生、関連する線維芽細胞集団の同等の遊走ダイナミクス、およびSCAD全体の皮膚収縮が可能になります(図1A)。SCADアッセイの汎用性により、瘢痕発生の全スペクトルにわたって組織を採取することができます。例えば、実験の目的が瘢痕化の初期ダイナミクスを研究することである場合、空間的および時空間的分析はSCAD培養のD1またはD2に限定することができる(図1B)。
0日目および5日目におけるSCADの代表的な全マウント明視野画像を、それぞれ図2Aおよび図2A ́に示す。2D解析では、切片化後の組織の無傷性を確保するために、OCTにSCADを気泡のない垂直方向で埋め込むことが不可欠です。これらの組織切片は、さらに、En1Cre、R26 mTmGマウス背側真皮からの凍結切片上の組織学的分析(例えば、Masson trichrome staining-Figure 2B,2B')または免疫蛍光染色(図2C,2C')に供することができる;初期のEPFは緑色で、ENFは赤色で(図2D)および後期段階の瘢痕(図2D ́)から。
瘢痕の3Dおよび3Dタイムラプスイメージングでは、組織の奥深く(400〜800μm)の蛍光信号を検出する必要があります。2光子励起を用いた近赤外波長での励起は、光散乱および吸収を最小限に抑えることによって組織を透明にするために3Dイメージングで一般的に使用される方法論である組織透明化を必要とせずにそのような測定を可能にする15,16,17。我々は、25倍の水浸漬対物レンズを備えた直立多光子顕微鏡を、調整可能なレーザーと組み合わせて使用した。組織を、関連するプローブを用いて3D免疫染色に供した。3Dイメージングの場合、組織を2%低融点アガロース溶液に包埋し、組織内のドリフトを固定化または防止し(図3A)、水浸漬目的に必要な屈折率に合わせるためにPBSGTをトッピングしました。図3Bおよび図3B'の代表的な画像は、En1Cre、R26mTmG背部皮膚からの5日目SCADの瘢痕部位におけるN-カドヘリンタンパク質(ピンク/マゼンタ-アレクサ蛍光647)の排他的な局在を示す。EPF は緑、ENF は赤です。3Dタイムラプスイメージングでは、PBSの代わりにフェノールレッドインジケータなしのDMEM/F12培地をトッピングした2%低融点アガロース溶液に組織を埋め込むことにより、上記の設定に若干の変更が加えられました。イメージング中にSCAD組織を「生きている」ための適切な条件を確保するために、適切なインキュベーションチャンバを追加して、イメージング中にすべての表現型が正しく記録されるようにしました(図3C)。初期の線維芽細胞群の代表的なスナップショットを、瘢痕発生の最初の12時間/初期段階にわたる図3D、図3D'および図3D'に示す。
(A)生後0日目/1日目の仔の背部皮膚を切除し、以下の真皮層を含む組織の完全性を保証する:表皮(E)、乳頭および網状真皮(PDおよびRD)、および筋膜層(F)に続いて2mm生検パンチを当てて、0日目のSCADを得る。(B)SCADはその後、2日目および4日目に培養培地交換ステップを有する個々の実験の性質(点線矢印)に基づいて、オプションの断続的な収穫/組織固定ステップで最大5日間培養することができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2D免疫蛍光染色。0日目(A)および5日目(A ́)における明視野全マウント画像(AおよびA ́)を用いて早期および後期段階の瘢痕を研究するための代表的な2D読み出し。(BおよびB ')マッソンによる垂直組織切片のトリクローム染色により、0日目(B)および5日目(B')の瘢痕コア(黄色で塗りつぶされた三角形)における組織瘢痕組織収縮およびECMの蓄積のシグネチャが明らかになった。(CおよびC ́)0日目(C)および5日目(C ́)の免疫蛍光分析は、En1Cre、R26mTmG背部皮膚から生成されたSCADである。EPFは緑色で、ENFは赤色で、DAPIは初期(D)および後期段階(D')の瘢痕から青色で示されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3D時空間解析のためのSCADの概略セットアップと代表的な読み出し。(A)直立蛍光顕微鏡下での2%低融点アガロースゲルにSCADを埋め込んだ模式図、および(B)En1 Cre,R26mTmGから生成された3D免疫蛍光染色された5日目SCADの代表画像 マウス真皮をN-カドヘリン抗体(マゼンタ社製)で免疫染色した。EPFは緑色で、ENFは赤色で示されています。(C)インキュベーションチャンバを備えた3DイメージングSCADセットアップの概略図:37°C、21%(v/v)酸素、5%(v/v)C02、および95%湿度。(d)SCADの0日目および1日目の段階の最初の12時間における線維芽細胞群(白い破線の円)の進行の初期事象を示すライブイメージングの代表的な結果。(e)D、D'およびD''における個々の線維芽細胞の単一細胞追跡細胞軌道のグラフ表現。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
傷害後の瘢痕形成を理解するために、いくつかのモデルがすでに開発されている。この点で多くの進歩がもたらされましたが、実際のメカニズムはまだ明らかではありません。前の技術とは対照的に、SCADモデルは、すべての細胞型および皮膚層を組み込んでおり、それによって天然皮膚の複雑さを維持している18、19。この方法論は、瘢痕形成を促進する分子メカニズムを理解する上で重要な基本的なデータセットを生成することができる。このアッセイは、シンプルでミニマルでありながら、線維芽細胞の遊走、ECM沈着、表皮/筋肉収縮を理解するために不可欠な基本的かつ機能的な読み出しを生成することができる方法で設計されています13,14。これは、in vivoセットアップよりも比較的複雑ではなく、サンプルに対する偏差を最小限に抑えることができます。さらに、このアッセイは、ハイスループット分析パイプラインと容易に組み合わせることができる。ここで、瘢痕化を軽減または促進する化学化合物、中和抗体、siRNA、またはウイルス方法論などの阻害剤または活性化剤の全スペクトルまたはライブラリーを、最小限の量の切除組織に比較的容易に適用することができる。このエクスビボ瘢痕モデルの制限に関して、このアッセイは、a)瘢痕発生における非常駐免疫群の表現型または動的側面の研究には適用できないb)血管新生c)組織が損傷後5日を超えて生存できないため瘢痕成熟。
生検が切除をパンチする前に、実験の進行を妨げる可能性があるため、組織に残留血液が残っていないようにすることが重要です。必要に応じてHBSSで組織を複数回洗浄し、組織からの残留血液が除去されていることを確認することをお勧めします。また、隔日に培地を交換することは、組織のサイズが小さいために真皮層と表皮層が分離する可能性があるため、特別な注意を払って行う必要があります。そのため、実際の実験を始める前に、事前に適切に手順を実践することが不可欠です。組織層の繰り返し分離を避けるために、我々は、組織を安定化させ、ウェルに添加された培地によって引き起こされる組織の表面張力の変化を最小限に抑えるために、培地交換中に、新鮮な培地と交換する前に10μlの残留培地を保持することができることを示唆する。
2D解析パイプラインでは、組織をブロックに取り付ける前に、室温で液体の最適な切断温度化合物で組織を数分間平衡化することをお勧めします。これにより、切片化中の氷結晶形成による組織分離が防止される。3D/3Dタイムラプスイメージングパイプラインは、利用可能な顕微鏡モダリティに基づいて適切に変更する必要があります。直立顕微鏡(水浸漬対物レンズの有無にかかわらず)の場合、組織をアガロースに埋め込むか、スーパーグルーを使用すると、イメージング中の組織の物理的なシフトを防ぐことができます。水浸漬対物レンズは、PBSまたは無色の媒体(フェノールレッドなし)を使用して3D/3Dタイムラプスイメージングを可能にします。倒立顕微鏡の場合、組織をガラス底/イメージングプレート上に置き、低融点アガロースの一滴を使用して固定化し、ライブイメージング中の生存率を確保するために適切な媒体をトッピングすることができます。どちらのモダリティでも、互換性のあるインキュベーションシステムを使用して、イメージング中に適切な温度、湿度、およびガス供給を確保することができます。
結論として、SCADモデルは、哺乳類創傷治癒に関与する新規な分子手がかりおよび機構的経路の同定および特徴付けを可能にする13、14。このプロトコルは、SCADの生成と潜在的なダウンストリームアプリケーションと分析の詳細な説明を提供し、瘢痕の発生に関する洞察を提供します。
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Disclosures
すべての著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
我々は、SCAD方法論13の開発に貢献したJiang et al. 2020のすべての共著者に謝意を呈する。我々は、多光子システムへのアクセスについて、シュテフェン・ディーツェル博士とルートヴィヒ・マクシミランス大学のバイオイメージングコア施設に感謝する。Y.R.は、Else-Kröner-Fresenius-Stiftung(2016_A21)、European Research Council Consolidator Grant(ERC-CoG 819933)、LEO Foundation(LF-OC-21-000835)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
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