إنتاج فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار من سائل ألانتويك
Summary
نقدم هنا إجراء مفصلا لإنتاج وتنقية وتحديد كمية فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار. ينتج عن هذا البروتوكول باستمرار > 6 × 109 وحدات لتشكيل اللويحات / مل ، مما يوفر كميات الفيروس المناسبة للدراسات الحيوانية في الجسم الحي . يتم وصف اختبارات مراقبة الجودة الإضافية لضمان السلامة في الجسم الحي .
Abstract
فيروس مرض نيوكاسل (NDV) ، المعروف أيضا باسم النمط المصلي لفيروس orthoavulavirus الطيور -1 ، هو فيروس RNA سلبي ، وحيد تقطعت به السبل تم تطويره كفيروس محلل للأورام ولقاح ناقل للفيروسات. NDV هو عامل علاجي ووقائي جذاب بسبب نظامه الوراثي العكسي الراسخ ، وخصائص التحفيز المناعي القوية ، وملف تعريف السلامة الممتاز. عندما يتم إعطاؤه كفيروس محلل للأورام أو لقاح ناقل للفيروسات ، يثير NDV استجابة مناعية قوية مضادة للورم أو مستضد خاص ، مما ينشط كل من الأذرع الفطرية والتكيفية لجهاز المناعة.
بالنظر إلى هذه الخصائص المرغوبة ، تم تقييم NDV في العديد من التجارب السريرية وهو واحد من أكثر الفيروسات المحللة للأورام التي تمت دراستها جيدا. حاليا، هناك تجربتان سريريتان مسجلتان تشملان NDV: واحدة تقيم لقاحا مؤتفيا ناقلا من NDV ل SARS-CoV-2 (NCT04871737)، والثانية تقيم ترميز NDV المؤتلف Interleukin-12 بالاشتراك مع Durvalumab، وهو جسم مضاد مضاد PD-L1 (NCT04613492). ولتيسير إحراز مزيد من التقدم في هذا الناقل الفيروسي الواعد للغاية، هناك حاجة إلى أساليب مبسطة لتوليد NDV المؤتلف من الدرجة العالية في الجسم الحي (rNDV).
تصف هذه الورقة إجراء مفصلا لتضخيم rNDV في بيض دجاج جنيني محدد خال من مسببات الأمراض (SPF) وتنقية rNDV من سائل الألانتويك ، مع تحسينات لتقليل الخسارة أثناء التنقية. وتشمل أيضا وصفا لاختبارات مراقبة الجودة الموصى بها، والتي ينبغي إجراؤها للتأكد من نقص الملوثات وسلامة الفيروسات. بشكل عام ، يتيح هذا الإجراء التفصيلي توليف وتنقية وتخزين NDV عالي العيار ، في درجة الجسم الحي ، المؤتلف ، lentogenic ، و mesogenic NDV للاستخدام في الدراسات قبل السريرية.
Introduction
فيروس مرض نيوكاسل ، المعروف أيضا باسم Avian Orthoavulavirus-1 ، هو فيروس باراميكسو الطيور المغلف مع إمكانية استخدامه كفيروس محلل للأورام أو لقاح ناقل للفيروسات1،2،3،4،5،6،7. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم NDV للتعبير عن بروتين سبايك من SARS-CoV-2 وقد تم وصفه بأنه لقاح فعال داخل الأنف في نماذج تحدي الفئران والهامستر7،8،9. عند استخدامه كعلاج مناعي للسرطان ، فإنه يؤدي إلى تجنيد الخلايا المناعية الفطرية ، وتحديدا الخلايا القاتلة الطبيعية ، وإنتاج الإنترفيرون من النوع الأول ، وتوليد الخلايا التائية المضادة للأورام10،11،12،13. بالإضافة إلى هذه الخصائص المناعية القوية ، فإن NDV لديه ملف تعريف أمان قوي ونظام وراثي عكسي راسخ14,15. وقد دفعت هذه الخصائص المرغوبة إلى تقييم NDV في العديد من التجارب السريرية قبل السريرية والبشرية (NCT04871737 ، NCT01926028 ، NCT04764422) 16,17. وللمضي قدما في هذا الناقل الفيروسي الواعد للغاية والمحفز للمناعة، هناك حاجة إلى طرق مفصلة لإنتاج وتنقية NDV عالي العيار وفائق النقاء الذي يمكن إعطاؤه بأمان في الجسم الحي.
نظرا لأن NDV هو فيروس باراميكسو للطيور ، فإنه يتم تضخيمه في أغلب الأحيان في بيض الدجاج الجنيني. في حين أن هناك أنظمة قائمة على الخلايا متاحة لنشر NDV ، إلا أن معظمها لم يتمكن من إنتاج عيارات مماثلة لتلك التي تحققت في بيض الدجاج الجنيني18. ومع ذلك ، هناك بعض العيوب في إنتاج NDV في البيض ، بما في ذلك حقيقة أن الإنتاج القائم على البيض طويل وغير قابل للتطوير بسهولة ، ويمكن أن يكون الحصول على كميات كبيرة من بيض الدجاج SPF مشكلة ، وهناك احتمال للتلوث بمسببات الحساسية للبيض 13،18،19،20 . في الآونة الأخيرة ، أظهرت إحدى المجموعات أن خلايا Vero المزروعة في تعليق في وسط خال من المصل يمكن أن تدعم تكرار NDV إلى عيارات مماثلة لتلك التي تحققت في البيض ، قبل التنقية21. ومع ذلك ، فإن هذا يتطلب مرورا تسلسليا للفيروس لتكييف الفيروس مع خلايا Vero ، ولا يزال تحسين طريقة لتنقية NDV من خلايا Vero المعلقة مطلوبا21.
كما هو موضح سابقا ، تختلف الطرق المستخدمة لتنقية العيار العالي ، في الفيروس الحي ، اعتمادا على الفيروس في السؤال22. هناك نظام وراثي عكسي راسخ متاح لتوليد NDV المؤتلف. هذه العملية ، التي تنطوي على استخدام استنساخ cDNA ، والبلازميدات المساعدة ، وفيروس مساعد يعبر عن بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ، تم وصفها مسبقا بالتفصيل15,23. يمكن تطبيق هذا البروتوكول إما على NDV العدسي أو الميزوجيني. الفيروس الموصوف في هذا البروتوكول هو NDV ميزوجينيك مؤتلف يشفر بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) من قنديل البحر Aequorea victoria المدرج بين جينات P و M الفيروسية كوحدة نسخ فردية ، حيث تم وصف هذا سابقا بأنه الموقع الأمثل لإدخال الجينات المحورة الأجنبية24.
تحدد الطرق المرفقة تنقية NDV بناء على حجمها ، الذي يتراوح من 100 إلى 500 نانومتر ، وكثافته15. وقد سمح ذلك بتوليد مخزون NDV عالي العيار من الجسم الحي في حوالي 3 أسابيع ، بدءا من وقت استلام البيض إلى الحصول على عيار نهائي. يتم وصف التقنيات المستخدمة بشكل متكرر في الإنتاج الواسع النطاق للفيروسات القائمة على البيض مثل ترشيح التدفق العرضي ، وترشيح العمق ، والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، مما يتيح ترجمة هذه الأساليب إلى إنتاج على نطاق أوسع. تم تحسين التقنيات الموصوفة سابقا لتنقية NDV من خلال دمج مخزن مؤقت مثبت للفيروسات ، واستخدام اليوديكسانول أثناء الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، ووصف مختلف تدابير مراقبة الجودة لضمان الجودة في الجسم الحي 15. وقد سمح ذلك بتنقية NDV في الجسم الحي وصولا إلى عيارات تصل إلى 3 × 1010 PFU / mL من 0.8 إلى 1.0 لتر من السائل الألانتويك.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجب أن تكون الفيروسات المستخدمة كعوامل علاجية في الدراسات قبل السريرية عالية النقاء لتجنب السمية عند إعطائها في الجسم الحي15. إذا لم تتم إزالة العوامل أو الملوثات المغامرة ، فقد يؤدي ذلك إلى ردود فعل سلبية شديدة تنفي التأثير العلاجي للعامل الفيروسي28. نظرا لأ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
حصل J.G.E.Y على منحة دكتوراه من كلية أونتاريو البيطرية ومنحة دراسية للدراسات العليا في أونتاريو. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا Discovery Grants إلى SKW (المنحة رقم 304737) و LS (المنحة رقم 401127).
Materials
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
| Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
| Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
References
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
- Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
- Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
- Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
- McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
- Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
- Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
- Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
- Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
- Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
- Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
- Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
- Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
- Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
- Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
- Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
- Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
- Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
- Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
- Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
- Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
- Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
- Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, 40-45 (2015).
- van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
- Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
- Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
- Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
- Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
- Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
- Axis-Shield. . Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
- Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
- Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
- Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
- Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
- Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
- Chen, T. -. F., Jang, J. -. W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , 1-14 (2007).
- Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).
