Productie van High-titer Recombinant Newcastle Disease Virus uit Allantoic Fluid
Summary
Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor de productie, zuivering en kwantificering van high-titer recombinant Newcastle disease virus. Dit protocol levert consequent > 6 × 109 plaquevormende eenheden/ml op, wat virushoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor in vivo dierstudies. Aanvullende kwaliteitscontroletests om de veiligheid in vivo te waarborgen, worden beschreven.
Abstract
Newcastle disease virus (NDV), ook bekend als aviaire orthoavulavirus serotype-1, is een negatief zintuig, enkelstrengs RNA-virus dat zowel als een oncolytisch virus als een viraal gevectord vaccin is ontwikkeld. NDV is een aantrekkelijk therapeutisch en profylactisch middel vanwege het gevestigde omgekeerde geneticasysteem, krachtige immunostimulerende eigenschappen en een uitstekend veiligheidsprofiel. Bij toediening als een oncolytisch virus of een viraal gevectoreerd vaccin, lokt NDV een robuuste antitumor- of antigeenspecifieke immuunrespons uit, waardoor zowel de aangeboren als de adaptieve armen van het immuunsysteem worden geactiveerd.
Gezien deze wenselijke kenmerken is NDV geëvalueerd in tal van klinische onderzoeken en is het een van de best bestudeerde oncolytische virussen. Momenteel zijn er twee geregistreerde klinische onderzoeken met NDV: een evaluatie van een recombinant NDV-gevectoreerd vaccin voor SARS-CoV-2 (NCT04871737), en een tweede evaluatie van een recombinant NDV dat codeert voor Interleukine-12 in combinatie met Durvalumab, een antiPD-L1-antilichaam (NCT04613492). Om verdere vooruitgang van deze veelbelovende virale vector mogelijk te maken, zijn vereenvoudigde methoden nodig voor het genereren van high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV).
Dit artikel beschrijft een gedetailleerde procedure voor het versterken van rNDV in gespecificeerde pathogeenvrije (SPF) embryonale kippeneieren en het zuiveren van rNDV uit allantoïsche vloeistof, met verbeteringen om verlies tijdens zuivering te verminderen. Ook inbegrepen zijn beschrijvingen van de aanbevolen kwaliteitscontroletests, die moeten worden uitgevoerd om het gebrek aan verontreinigingen en virusintegriteit te bevestigen. Over het algemeen maakt deze gedetailleerde procedure de synthese, zuivering en opslag van high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogeen en mesogene NDV mogelijk voor gebruik in preklinische studies.
Introduction
Newcastle Disease Virus, ook bekend als Avian Orthoavulavirus-1, is een omhuld aviair paramyxovirus met het potentieel om zowel als een oncolytisch virus of een viraal gevectord vaccin 1,2,3,4,5,6,7 te worden gebruikt. Meest recent is NDV ontworpen om het spike-eiwit van SARS-CoV-2 tot expressie te brengen, gekarakteriseerd als een effectief intranasaal vaccin in muis- en hamsteruitdagingsmodellen 7,8,9. Wanneer het wordt gebruikt als kankerimmunotherapie, resulteert het in de rekrutering van aangeboren immuuncellen, met name natuurlijke killercellen, productie van type I interferon en de generatie van antitumorspecifieke T-cellen 10,11,12,13. Naast deze krachtige immunostimulerende eigenschappen heeft NDV een sterk veiligheidsprofiel en een goed ingeburgerd omgekeerd genetisch systeem14,15. Deze wenselijke kenmerken hebben geleid tot de evaluatie van NDV in talrijke preklinische en humane klinische onderzoeken (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Om deze veelbelovende, immuunstimulerende virale vector verder te bevorderen, zijn gedetailleerde methoden nodig voor het produceren en zuiveren van ultrazuivere NDV met hoge titer die veilig in vivo kan worden toegediend.
Omdat NDV een vogelparamyxovirus is, wordt het meestal versterkt in embryonale kippeneieren. Hoewel er op cellen gebaseerde systemen beschikbaar zijn voor het vermeerderen van NDV, zijn de meeste niet in staat geweest om titers te produceren die vergelijkbaar zijn met die in embryonale kippeneieren18. Niettemin zijn er enkele nadelen aan het produceren van NDV in eieren, waaronder het feit dat de productie op basis van eieren lang en niet gemakkelijk schaalbaar is, het inkopen van grote hoeveelheden SPF-kippeneieren problematisch kan zijn en er bestaat het potentieel voor besmetting met ei-allergenen 13,18,19,20 . Onlangs heeft een groep aangetoond dat Vero-cellen gekweekt in suspensie in serumvrij medium de replicatie van NDV naar titers kunnen ondersteunen die vergelijkbaar zijn met die in eieren, voorafgaand aan zuivering21. Dit vereiste echter seriële passaging van het virus om het virus aan te passen aan Vero-cellen, en de optimalisatie van een methode om NDV te zuiveren van suspensie Vero-cellen is nog steeds vereist21.
Zoals eerder benadrukt, variëren de methoden die worden gebruikt voor het zuiveren van hoogtiter, in vivo-grade virus afhankelijk van het virus in vraag22. Er is een goed ingeburgerd omgekeerd genetisch systeem beschikbaar voor het genereren van recombinant NDV. Dit proces, waarbij gebruik wordt gemaakt van een cDNA-kloon, helperplasmiden en een helpervirus dat T7-RNA-polymerase tot expressie brengt, is eerder in detail beschreven15,23. Dit protocol kan worden toegepast op lentogene of mesogene NDV. Het virus dat in dit protocol wordt beschreven, is een recombinant mesogeen NDV dat codeert voor het groene fluorescerende eiwit (GFP) van de kwal Aequorea victoria die tussen virale P- en M-genen is ingebracht als een individuele transcriptie-eenheid, omdat dit eerder is beschreven als de optimale plaats voor vreemde transgene insertie24.
Ingesloten methoden schetsen de zuivering van NDV op basis van de grootte, variërend van 100 tot 500 nm, en de dichtheid15. Dit heeft het mogelijk gemaakt om in vivo-grade, high-titer NDV-bestanden in ongeveer 3 weken te genereren, vanaf het moment dat de eieren worden ontvangen tot het hebben van een laatste titer. Technieken die vaak worden gebruikt bij de grootschalige productie van op eieren gebaseerde virussen, zoals tangentiële stromingsfiltratie, dieptefiltratie en ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt, worden beschreven, waardoor de vertaling van deze methoden naar grootschalige productie mogelijk wordt. Eerder beschreven technieken voor de zuivering van NDV zijn verbeterd door de opname van een virusstabiliserende buffer, het gebruik van iodixanol tijdens ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt en de beschrijving van verschillende kwaliteitscontrolemaatregelen om de kwaliteit van in vivo kwaliteit te waarborgen15. Dit heeft de zuivering mogelijk gemaakt van in vivo-grade NDV die titers bereiken tot 3 × 1010 PFU / ml van 0,8 tot 1,0 l allantoïsche vloeistof.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virussen die in preklinisch onderzoek als therapeutisch middel worden gebruikt, moeten sterk worden gezuiverd om toxiciteit te voorkomen wanneer ze in vivo worden toegediend 15. Als onvoorziene agentia of verontreinigingen niet worden verwijderd, kan dit leiden tot ernstige bijwerkingen die het therapeutische effect van het virale middel tenietdoen28. Aangezien NDV wordt geproduceerd in embryonale kippeneieren, zijn er verschillende verontreinigende ei-eiwitten, zo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.G.E.Y was de ontvanger van een Ontario Veterinary College PhD Scholarship en een Ontario Graduate Scholarship. Dit werk werd gefinancierd door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants aan SKW (grant #304737) en LS (grant #401127).
Materials
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
| Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
| Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
References
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).
- Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies. Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).
- Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains. Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).
- Matuszewska, K., et al. Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).
- McAusland, T. M., et al. Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).
- Warner, B. M., et al. Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease. iScience. 24 (11), 103219 (2021).
- Sun, W., et al. Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate. EBioMedicine. 62, (2020).
- Sun, W., et al. A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine. Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).
- Xu, Q., et al. Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo. International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).
- Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy. Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).
- Ricca, J. M., et al. Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy. Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).
- Zamarin, D., et al. Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy. Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).
- Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy. Biomedicines. 7 (3), (2019).
- Santry, L. A., et al. Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).
- Cassel, W. A., Murray, D. R. A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).
- Plitt, T., Zamarin, D. Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations. Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).
- Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).
- Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
- Hegde, N. R. Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).
- Fulber, J. P. C., et al. Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures. Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).
- Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018 (2016).
- Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).
- Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression. The Journal of General Virology. 96, 40-45 (2015).
- van Vloten, J. P., et al. Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).
- Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence. PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).
- Sheets, R. L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines. Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).
- Chung, E. H. Vaccine allergies. Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).
- Schirrmacher, V. Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate. Biomedicines. 4 (3), (2016).
- Ajamian, F., et al. CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).
- Axis-Shield. . Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).
- Mita, A., et al. Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations. Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).
- Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient. Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).
- Zhou, Y., et al. A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation. Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).
- Zhao, H., Peeters, B. P. H. Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication. Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).
- Cheng, X., et al. Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy. Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).
- Chen, T. -. F., Jang, J. -. W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , 1-14 (2007).
- Wang, Y., et al. Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity. PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).
