Summary

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Published: May 25, 2022
doi:

Summary

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg > 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Abstract

Das Newcastle-Disease-Virus (NDV), auch bekannt als Vogelorthoavulavirus-Serotyp-1, ist ein einzelsträngiges RNA-Virus mit negativem Sinn, das sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff entwickelt wurde. NDV ist aufgrund seines gut etablierten reverse-genetischen Systems, seiner starken immunstimulierenden Eigenschaften und seines ausgezeichneten Sicherheitsprofils ein attraktives therapeutisches und prophylaktisches Mittel. Bei der Verabreichung als onkolytisches Virus oder viral-vektorisierter Impfstoff löst NDV eine robuste Antitumor- oder Antigen-spezifische Immunantwort aus, die sowohl den angeborenen als auch den adaptiven Arm des Immunsystems aktiviert.

Angesichts dieser wünschenswerten Eigenschaften wurde NDV in zahlreichen klinischen Studien untersucht und ist eines der am besten untersuchten onkolytischen Viren. Derzeit gibt es zwei registrierte klinische Studien mit NDV: eine zur Bewertung eines rekombinanten NDV-vektorisierten Impfstoffs für SARS-CoV-2 (NCT04871737) und eine zweite zur Bewertung eines rekombinanten NDV, das Interleukin-12 kodiert, in Kombination mit Durvalumab, einem AntiPD-L1-Antikörper (NCT04613492). Um die Weiterentwicklung dieses vielversprechenden viralen Vektors zu erleichtern, sind vereinfachte Methoden zur Erzeugung von rekombinantem NDV (rNDV) mit hohem Titer-, In-vivo-Grad erforderlich.

Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Amplifikation von rNDV in spezifizierten pathogenfreien (SPF) embryonierten Hühnereiern und zur Reinigung von rNDV aus Allantoikflüssigkeit mit Verbesserungen zur Verringerung des Verlusts während der Reinigung. Ebenfalls enthalten sind Beschreibungen der empfohlenen Qualitätskontrollassays, die durchgeführt werden sollten, um den Mangel an Kontaminanten und die Virusintegrität zu bestätigen. Insgesamt ermöglicht dieses detaillierte Verfahren die Synthese, Reinigung und Speicherung von hochtiteren, in vivo gradigen, rekombinanten, lentogen und mesogenen NDV für den Einsatz in präklinischen Studien.

Introduction

Newcastle Disease Virus, auch bekannt als Avian Orthoavulavirus-1, ist ein umhülltes aviäres Paramyxovirus mit dem Potenzial, sowohl als onkolytisches Virus als auch als viral-vektorisierter Impfstoff 1,2,3,4,5,6,7 verwendet zu werden. In jüngster Zeit wurde NDV, das zur Expression des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 entwickelt wurde, als wirksamer intranasales Impfstoff in den Maus- und Hamster-Challenge-Modellen 7,8,9 charakterisiert. Wenn es als Krebsimmuntherapie verwendet wird, führt es zur Rekrutierung angeborener Immunzellen, insbesondere natürlicher Killerzellen, zur Produktion von Typ-I-Interferon und zur Erzeugung von antitumorspezifischen T-Zellen10,11,12,13. Zusätzlich zu diesen starken immunstimulierenden Eigenschaften hat NDV ein starkes Sicherheitsprofil und ein gut etabliertes umgekehrtes Genetiksystem14,15. Diese wünschenswerten Eigenschaften haben zur Bewertung von NDV in zahlreichen präklinischen und humanklinischen Studien geführt (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Um diesen vielversprechenden, immunstimulierenden viralen Vektor weiter voranzubringen, sind detaillierte Methoden zur Herstellung und Reinigung von hochtiterem, hochreinem NDV erforderlich, das sicher in vivo verabreicht werden kann.

Da NDV ein Vogelparamyxovirus ist, wird es am häufigsten in embryonierten Hühnereiern amplifiziert. Während es zellbasierte Systeme zur Vermehrung von NDV gibt, waren die meisten nicht in der Lage, Titer zu produzieren, die denen ähneln, die in embryonierten Hühnereiern18 erreicht wurden. Dennoch gibt es einige Nachteile bei der Herstellung von NDV in Eiern, einschließlich der Tatsache, dass die Produktion auf Eibasis langwierig und nicht leicht skalierbar ist, die Beschaffung großer Mengen von SPF-Hühnereiern problematisch sein kann und das Potenzial für eine Kontamination mit Eiallergenen besteht13,18,19,20 . Kürzlich hat eine Gruppe gezeigt, dass Vero-Zellen, die in Suspension in serumfreiem Medium gezüchtet wurden, die Replikation von NDV zu Titern unterstützen können, die mit denen vergleichbar sind, die in Eiern vor der Reinigungerreicht wurden 21. Dies erforderte jedoch eine serielle Übertragung des Virus, um das Virus an Vero-Zellen anzupassen, und die Optimierung einer Methode zur Reinigung von NDV aus Suspensions-Vero-Zellen ist immer noch erforderlich21.

Wie bereits erwähnt, variieren die Methoden zur Reinigung von High-Titer-In-vivo-Viren je nach dem betreffenden Virus22. Für die Erzeugung rekombinanter NDV steht ein gut etabliertes System der umgekehrten Genetik zur Verfügung. Dieser Prozess, bei dem ein cDNA-Klon, Helferplasmide und ein Helfervirus verwendet werden, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert, wurde zuvor ausführlich beschrieben 15,23. Dieses Protokoll kann entweder auf lentogene oder mesogene NDV angewendet werden. Das in diesem Protokoll beschriebene Virus ist ein rekombinantes mesogenes NDV, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria kodiert, das zwischen viralen P- und M-Genen als individuelle Transkriptionseinheit eingefügt wurde, da dies zuvor als optimaler Ort für die Insertion von Fremdtransgenen beschrieben wurde24.

Geschlossene Methoden beschreiben die Reinigung von NDV basierend auf seiner Größe, die von 100 bis 500 nm reicht, und seiner Dichte15. Dies ermöglichte die Erzeugung von In-vivo-haltigen, hochtiteren NDV-Beständen in etwa 3 Wochen, beginnend mit dem Empfang der Eier bis hin zu einem endgültigen Titer. Es werden Techniken beschrieben, die häufig bei der großtechnischen Produktion von Viren auf Eibasis verwendet werden, wie z. B. Tangentialflussfiltration, Tiefenfiltration und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, die die Übertragung dieser Methoden auf die Produktion in größerem Maßstab ermöglichen. Zuvor beschriebene Techniken zur Reinigung von NDV wurden durch den Einbau eines virusstabilisierenden Puffers, die Verwendung von Iodixanol während der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und die Beschreibung verschiedener Qualitätskontrollmaßnahmen zur Sicherstellung der In-vivo-Qualität verbessert 15. Dies hat die Reinigung von In-vivo-Qualität NDV ermöglicht, die Titer von bis zu 3 × 1010 PFU / ml von 0,8 bis 1,0 L Allantoikflüssigkeit erreicht.

Protocol

Alle Arbeiten, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom University of Guelph Animal Care Committee in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care genehmigt. Alle Arbeiten werden in einem Labor für BioSafety Level 2 (BSL2) in Kanada durchgeführt, in dem mesogene NDV ein Erreger der Risikogruppe 2 ist. Alle Schritte zur Amplifikation und Reinigung von NDV sollten aus Sicherheits- und Sterilitätsgründen in einer biologischen Sicherheitswerkbank vom Typ IIA durchgeführt werden. <p class="jov…

Representative Results

Ernte von AllantoikflüssigkeitDa Allantoikflüssigkeit aus embryonierten Hühnereiern gewonnen wird, sollte sie klar und transparent erscheinen. Wenn die Flüssigkeit undurchsichtig und gelb erscheint, deutet dies auf das Vorhandensein von Verunreinigungen hin. Die Einbeziehung dieser allantoischen Flüssigkeit während der Reinigung behindert den Reinigungsprozess, da der Druck schnell ansteigt und 10 psi überschreitet, was zur Scherung des Virus und zum Verlust des infektiösen Virus führt. Alla…

Discussion

Viren, die in präklinischen Studien als Therapeutika verwendet werden, müssen bei der Verabreichung in vivo15 stark gereinigt werden, um Toxizität zu vermeiden. Wenn zufällige Agenzien oder Verunreinigungen nicht entfernt werden, kann dies zu schweren Nebenwirkungen führen, die die therapeutische Wirkung des viralen Wirkstoffszunichte machen 28. Da NDV in embryonierten Hühnereiern hergestellt wird, gibt es mehrere kontaminierende Eiproteine wie Eieralbumin, d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.G.E.Y erhielt ein PhD-Stipendium des Ontario Veterinary College und ein Ontario Graduate Scholarship. Diese Arbeit wurde durch Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants an SKW (Grant # 304737) und LS (Grant # 401127) finanziert.

Materials

0.25% Trypsin HyClone SH30042.02
1 mL Slip-Tip Syringe BD 309659
10 mL Luer-Lok Syringe BD 302995
10% Povidone Iodine Solution LORIS 109-08
15 mL Conical Tubes Thermo-Fisher 14955240
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle BD 305180
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle BD 305196
25 G x 5/8 in Needle BD 305122
2-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 03446I-100
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 BioRad 1610158
4% Paraformaldehyde-PBS Thermo-Fisher J19943-K2
5 mL Luer-Lok Syringe BD 309646
96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom Greiner Bio One 655180
Acetic Acid, Glacial Thermo-Fisher A38-212
Agarose Froggabio A87-500G
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse Invitrogen A11001
Allegra X-14 Centrifuge Beckman Coulter B08861
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Bleach (5%) Thermo-Fisher 36-102-0599
Broad, unserrated tipped forceps Thermo-Fisher 09-753-50
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich 114405-25G
Centramate Cassette Holder PALL CM018V
ChemiDoc XRS+ BioRad 1708265
CO2 Incubator Thermo-Fisher
Coomassie Brilliant Blue R-259 Thermo-Fisher BP101-50
DF1 Cells ATCC CRL-12203
Diet Gel Recovery ClearH2O, INC 72-01-1062
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator Berry Hill 1502W
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125-500G
Egg Candler Berry Hill A46
Ethanol (70%) Thermo-Fisher BP82031GAL
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O Thermo-Fisher BP2482-500
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) Cole-Parmer 06349-50
Fetal Bovine Serum Gibco 12483-020
Fine Point High Precision Forceps Thermo-Fisher 22-327379
Fluorescent Microscope ZEISS AXIO Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein
Freeze Dry System Freezone 4.5 LABCONCO
GiBOX Gel Imager Syngene Imaging of Agarose Gels
Glycerol Thermo-Fisher G33-1
Glycine Thermo-Fisher BP381-5
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Thermo-Fisher 4368814
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium Cytiva SH30022.01
Humidity Kit Berry Hill 3030
Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)
L-Lysine Monohydrochloride Sigma-Aldrich 62929-100G-F
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT Cole-Parmer 41507-44
Masterflex L/S Digital Drive Cole-Parmer RK-07522-20 Peristaltic Pump with digital display
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing Cole-Parmer RK-07514-10
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 Cole-Parmer 96420-16 BioPharm Platinum-Cured Silicone
MC Pro 5 Thermocycler Eppendorf EP950040025
Methanol Thermo-Fisher A412-4
Mini Protean Tetra Cell BioRad 1658000EDU SDS-PAGE cast and running appartus
Mouse-Anti-NDV Novus Biologicals NBP2-11633 Clone 6H12
Normal Goat Serum Abcam AB7481
NP-40 Thermo-Fisher 85124
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K PALL OS100T02
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System Thermo-Fisher B1A
PBS 10X Solution Thermo-Fisher BP399-20
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 Sigma-Aldrich 81300-1KG
PowePac 300 BioRad Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis
Q5 High Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492S
QIA Amp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
RedSafe Thermo-Fisher 50999562
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL Thermo-Fisher 66380
Sodium Dodecyl Sulfate Thermo-Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide (Pellets) Thermo-Fisher S318-10
Specific pathogen free eggs CFIA NA Supplier will vary depending on location
Sucrose Thermo-Fisher S5-3
Supracap 50 Depth Filter PALL SC050V100P
Surgical Scissors Thermo-Fisher 08-951-5
Sw41Ti Rotor Beckman Coulter 331362 Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750 Rotor Beckman Coulter 369702
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes Beckman Coulter 359472
TEMED Invitrogen 15524-010
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) Beckman Coulter 344059
Tris Base Thermo-Fisher BP152-5
Tubing Screw Clamp PALL 88216
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379-1L
Utility Pressure Gauges Cole-Parmer 68355-06

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Yates, J. G. E., Leacy, A., Pham, P. H., Zielinska, N., Tusnadi, E. A., Susta, L., Wootton, S. K. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (183), e63817, doi:10.3791/63817 (2022).

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