Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico
Summary
Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione, la purificazione e la quantificazione del virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo. Questo protocollo produce costantemente > 6 × 109 unità di formazione della placca / mL, fornendo quantità di virus appropriate per studi su animali in vivo . Vengono descritti ulteriori saggi di controllo della qualità per garantire la sicurezza in vivo .
Abstract
Il virus della malattia di Newcastle (NDV), noto anche come sierotipo 1 dell’ortoavulavirus aviario, è un virus a RNA a singolo filamento a senso negativo che è stato sviluppato sia come virus oncolitico che come vaccino vettore virale. NDV è un attraente agente terapeutico e profilattico grazie al suo consolidato sistema di genetica inversa, potenti proprietà immunostimolanti e un eccellente profilo di sicurezza. Quando somministrato come virus oncolitico o vaccino vettore virale, NDV suscita una robusta risposta immunitaria antitumorale o antigene-specifica, attivando sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario.
Date queste caratteristiche desiderabili, NDV è stato valutato in numerosi studi clinici ed è uno dei virus oncolitici più ben studiati. Attualmente, ci sono due studi clinici registrati che coinvolgono NDV: uno che valuta un vaccino ricombinante NDV-vectored per SARS-CoV-2 (NCT04871737), e un secondo che valuta un NDV ricombinante che codifica per Interleuchina-12 in combinazione con Durvalumab, un anticorpo antiPD-L1 (NCT04613492). Per facilitare l’ulteriore avanzamento di questo vettore virale altamente promettente, sono necessari metodi semplificati per generare NDV ricombinante (rNDV) ad alto titolo, di grado vivo.
Questo documento descrive una procedura dettagliata per amplificare l’rNDV in uova di gallina embrionate prive di patogeni specifici (SPF) e purificare l’rNDV dal liquido allantoico, con miglioramenti per ridurre la perdita durante la purificazione. Sono incluse anche le descrizioni dei test di controllo di qualità raccomandati, che dovrebbero essere eseguiti per confermare la mancanza di contaminanti e l’integrità del virus. Nel complesso, questa procedura dettagliata consente la sintesi, la purificazione e la conservazione di NDV ad alto titolo, di grado vivo, ricombinante, lentogeno e mesogenico per l’uso in studi preclinici.
Introduction
Newcastle Disease Virus, noto anche come Avian Orthoavulavirus-1, è un paramixovirus aviario avvolto con il potenziale per essere utilizzato sia come virus oncolitico che come vaccino viralevettore 1,2,3,4,5,6,7. Più recentemente, NDV progettato per esprimere la proteina spike di SARS-CoV-2 è stato caratterizzato come un vaccino intranasale efficace nei modellidi sfida di topo e criceto 7,8,9. Se usato come immunoterapia del cancro, si traduce nel reclutamento di cellule immunitarie innate, in particolare cellule natural killer, produzione di interferone di tipo I e generazione di cellule T antitumorali specifiche 10,11,12,13. Oltre a queste potenti proprietà immunostimolanti, NDV ha un forte profilo di sicurezza e un sistema di genetica inversa ben consolidato 14,15. Queste caratteristiche desiderabili hanno spinto la valutazione di NDV in numerosi studi clinici preclinici e umani (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Per far progredire ulteriormente questo vettore virale immunostimolante molto promettente, sono necessari metodi dettagliati per produrre e purificare NDV ultra-puro ad alto titolo che può essere somministrato in modo sicuro in vivo.
Poiché NDV è un paramyxovirus aviario, è più frequentemente amplificato nelle uova di gallina embrionate. Mentre ci sono sistemi basati su cellule disponibili per la propagazione di NDV, la maggior parte non è stata in grado di produrre titoli simili a quelli ottenuti nelle uova di gallina embrionate18. Tuttavia, ci sono alcuni inconvenienti nella produzione di NDV nelle uova, incluso il fatto che la produzione a base di uova è lunga e non facilmente scalabile, l’approvvigionamento di grandi quantità di uova di gallina SPF può essere problematico ed esiste il potenziale di contaminazione con allergeni dell’uovo 13,18,19,20 . Recentemente, un gruppo ha dimostrato che le cellule Vero cresciute in sospensione in mezzo privo di siero possono supportare la replicazione di NDV in titoli paragonabili a quelli ottenuti nelle uova, prima della purificazione21. Tuttavia, ciò ha richiesto il passaggio seriale del virus per adattare il virus alle cellule Vero e l’ottimizzazione di un metodo per purificare NDV dalle cellule Vero in sospensione è ancora richiesta21.
Come evidenziato in precedenza, i metodi utilizzati per purificare il virus di alto titolo e di grado in vivo variano a seconda del virus in questione22. Esiste un sistema di genetica inversa ben consolidato disponibile per la generazione di NDV ricombinante. Questo processo, che prevede l’uso di un clone di cDNA, plasmidi helper e un virus helper che esprime T7 RNA polimerasi, è stato precedentemente descritto in dettaglio 15,23. Questo protocollo può essere applicato a NDV lentogeno o mesogenico. Il virus descritto in questo protocollo è un NDV mesogenico ricombinante che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) dalla medusa Aequorea victoria inserita tra i geni virali P e M come unità di trascrizione individuale, poiché questo è stato precedentemente descritto come il sito ottimale per l’inserimento di transgeni estranei24.
I metodi allegati delineano la purificazione di NDV in base alle sue dimensioni, che vanno da 100 a 500 nm, e alla sua densità15. Ciò ha permesso la generazione di stock NDV in vivo e ad alto titolo in circa 3 settimane, a partire da quando le uova vengono ricevute fino ad avere un titolo finale. Vengono descritte le tecniche frequentemente utilizzate nella produzione su larga scala di virus a base di uova come la filtrazione a flusso tangenziale, la filtrazione di profondità e l’ultracentrifugazione del gradiente di densità, consentendo la traduzione di questi metodi in una produzione su larga scala. Le tecniche precedentemente descritte per la purificazione dell’NDV sono state migliorate mediante l’incorporazione di un tampone stabilizzante del virus, l’uso di iodixanolo durante l’ultracentrifugazione del gradiente di densità e la descrizione di varie misure di controllo della qualità per garantire la qualità in vivo 15. Ciò ha permesso la purificazione di NDV di grado in vivo raggiungendo titoli fino a 3 × 1010 PFU/mL da 0,8 a 1,0 L di liquido allantoico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I virus utilizzati come agenti terapeutici negli studi preclinici devono essere altamente purificati per evitare tossicità quando somministrati in vivo15. Se agenti avventizi o contaminanti non vengono rimossi, ciò può portare a gravi reazioni avverse che negano l’effetto terapeutico dell’agente virale28. Poiché l’NDV è prodotto in uova di gallina embrionate, ci sono diverse proteine dell’uovo contaminanti, come l’ovalbumina, che devono essere rimosse prima de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.G.E.Y è stato il destinatario di una borsa di studio di dottorato dell’Ontario Veterinary College e di una borsa di studio per laureati dell’Ontario. Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants a SKW (grant #304737) e LS (grant #401127).
Materials
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
| Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
| Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
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