アラントイック液からの高力価組換えニューカッスル病ウイルスの生産
Summary
ここでは、高力価組換えニューカッスル病ウイルスの生産、精製、および定量のための詳細な手順を提供します。このプロトコールは一貫して>6×109 プラーク形成単位/ mLを産生し、 in vivo 動物実験に適したウイルス量を提供する。 インビボでの 安全性を確保するためのさらなる品質管理アッセイが記載されている。
Abstract
ニューカッスル病ウイルス(NDV)は、鳥オルソアブラウイルス血清型-1としても知られており、腫瘍溶解性ウイルスおよびウイルスベクターワクチンの両方として開発されたネガティブセンスの一本鎖RNAウイルスである。NDVは、その確立された逆遺伝学システム、強力な免疫刺激特性、および優れた安全性プロファイルのために、魅力的な治療および予防剤である。腫瘍溶解性ウイルスまたはウイルスベクターワクチンとして投与された場合、NDVは堅牢な抗腫瘍または抗原特異的免疫応答を惹起し、免疫系の先天性アームと適応アームの両方を活性化する。
これらの望ましい特性を考えると、NDVは数多くの臨床試験で評価されており、最もよく研究されている腫瘍溶解性ウイルスの1つです。現在、NDVに関する2つの登録臨床試験があります:1つはSARS-CoV-2(NCT04871737)の組換えNDVベクターワクチンを評価し、もう1つは抗PD-L1抗体であるDurvalumab(NCT04613492)と組み合わせてインターロイキン-12をコードする組換えNDVを評価します。この非常に有望なウイルスベクターのさらなる進歩を促進するために、高力価 のインビボグレードの組換えNDV(rNDV)を生成するための単純化された方法が必要である。
この論文では、特定の病原体フリー(SPF)受精鶏卵でrNDVを増幅し、アラント液からrNDVを精製するための詳細な手順を説明し、精製中の損失を減らすための改善を加えています。また、推奨される品質管理アッセイの説明も含まれており、汚染物質の欠如とウイルスの完全性を確認するために実行する必要があります。全体として、この詳細な手順は、前臨床試験で使用するための高力価、 インビボグレード、組換え、レントゲン、およびメソゲンNDVの合成、精製、および保存を可能にします。
Introduction
Avian Orthoavulavirus-1としても知られるニューカッスル病ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスまたはウイルスベクターワクチン1,2,3,4,5,6,7の両方として使用される可能性のあるエンベロープ鳥パラミクソウイルスである。ごく最近、SARS−CoV−2のスパイクタンパク質を発現するように操作されたNDVは、マウスおよびハムスターチャレンジモデルにおいて有効な鼻腔内ワクチンとして特徴付けられている7、8、9。癌免疫療法として使用される場合、それは自然免疫細胞、具体的にはナチュラルキラー細胞の動員、I型インターフェロンの産生、および抗腫瘍特異的T細胞の生成をもたらす10、11、12、13。これらの強力な免疫刺激特性に加えて、NDVは強力な安全性プロファイルおよび十分に確立された逆遺伝学系を有する14、15。これらの望ましい特性は、多数の前臨床試験およびヒト臨床試験(NCT04871737、NCT01926028、NCT04764422)16、17におけるNDVの評価を促している。この非常に有望な免疫刺激性ウイルスベクターをさらに進めるためには、インビボで安全に投与できる高力価の超高純度NDVを産生および精製するための詳細な方法が必要である。
NDVは鳥類パラミクソウイルスであるため、受精した鶏卵で最も頻繁に増幅されます。NDVを伝播するために利用可能な細胞ベースの系がある一方で、そのほとんどは、受精したニワトリの卵で達成されたものと同様の力価を産生することができなかった18。それにもかかわらず、卵ベースの生産が長く、容易に拡張可能ではないという事実、大量のSPF鶏卵の調達が問題となる可能性があること、および卵アレルゲンによる汚染の可能性が存在することを含む、卵でNDVを生産することにはいくつかの欠点がある13,18,19,20.最近、あるグループは、無血清培地中の懸濁液中で増殖したVero細胞が、精製前に卵で達成されたものに匹敵する力価へのNDVの複製を支持できることを示した21。しかしながら、これにはウイルスをVero細胞に適応させるためにウイルスの連続継代が必要であり、そして懸濁液Vero細胞からNDVを精製する方法の最適化は依然として必要である21。
先に強調したように、高力価の インビボグレードウイルスを精製するために使用される方法は、問題22のウイルスによって異なる。組換えNDVの生成に利用可能な十分に確立された逆遺伝学システムがある。このプロセスは、cDNAクローン、ヘルパープラスミド、およびT7 RNAポリメラーゼを発現するヘルパーウイルスの使用を含む、15、23で以前に詳細に説明されている。このプロトコルは、レントゲン性またはメソゲン性NDVのいずれかに適用することができる。このプロトコールに記載されるウイルスは、個々の転写単位としてウイルスP遺伝子とM遺伝子の間に挿入されたクラゲ Aequorea victoria 由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする組換えメソゲンNDVであり、これは以前に外来導入遺伝子挿入の最適部位として記載されている24。
密閉された方法は、100〜500nmの範囲のサイズおよびその密度15に基づいてNDVの精製を概説する。これにより、卵を受け取ったときから最終力価になるまで、約3週間でin vivoグレードの高力価NDVストックを生成することができました。タンジェンシャルフローろ過、デプスろ過、密度勾配超遠心法などの卵ベースのウイルスの大規模生産に頻繁に使用される技術が記載されており、これらの方法のより大規模な生産への変換が可能です。NDVの精製のための以前に記載された技術は、ウイルス安定化緩衝液の組み込み、密度勾配超遠心分離中のヨウジキサノールの使用、およびインビボグレードの品質を確保するための様々な品質管理措置の説明によって改善された15。これにより、0.8 ~ 1.0 Lのアラントウ液から3 ×10 10 PFU/mLまでの力価に達するin vivoグレードNDVの精製が可能になりました。
Protocol
Representative Results
Discussion
前臨床試験で治療薬として使用されるウイルスは、インビボで投与された場合の毒性を避けるために高度に精製されなければならない15。冒険的な薬剤または夾雑物が除去されない場合、これはウイルス剤28の治療効果を否定する重篤な有害反応をもたらし得る。NDVは受精鶏卵で産生されるため、前臨床または臨床モデル29においてインビボで使用…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.G.E.Y.は、オンタリオ獣医大学博士奨学金とオンタリオ州大学院奨学金の受給者でした。この研究は、カナダ自然科学・工学研究評議会ディスカバリー助成金(SKW(助成金#304737)とLS(助成金#401127)から資金提供されました。
Materials
| 0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
| 1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
| 10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
| 15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
| Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
| Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
| Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
| Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
| Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
| L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
| Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
| Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
| Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
| Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |
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