Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak > 6 × 109 plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.
Kuş ortoavulavirüs serotip-1 olarak da bilinen Newcastle hastalığı virüsü (NDV), hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı olarak geliştirilmiş negatif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür. NDV, iyi kurulmuş ters genetik sistemi, güçlü immünostimülatör özellikleri ve mükemmel güvenlik profili nedeniyle çekici bir terapötik ve profilaktik ajandır. Onkolitik bir virüs veya viral vektörlü bir aşı olarak uygulandığında, NDV, bağışıklık sisteminin hem doğuştan gelen hem de adaptif kollarını aktive eden sağlam bir antitümör veya antijene özgü bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır.
Bu arzu edilen özellikler göz önüne alındığında, NDV çok sayıda klinik çalışmada değerlendirilmiştir ve en iyi çalışılmış onkolitik virüslerden biridir. Şu anda, NDV’yi içeren iki kayıtlı klinik çalışma vardır: biri SARS-CoV-2 (NCT04871737) için rekombinant NDV vektörlü bir aşıyı değerlendirirken, ikincisi bir antiPD-L1 antikoru (NCT04613492) olan Durvalumab ile kombinasyon halinde Interlökin-12’yi kodlayan bir rekombinant NDV’yi değerlendirmektedir. Bu son derece umut verici viral vektörün daha da ilerlemesini kolaylaştırmak için, yüksek titreli, in vivo dereceli, rekombinant NDV (rNDV) üretmek için basitleştirilmiş yöntemlere ihtiyaç vardır.
Bu yazıda, belirtilen patojensiz (SPF) embriyonlanmış tavuk yumurtalarında rNDV’nin güçlendirilmesi ve rNDV’nin allantoik sıvıdan arındırılması için ayrıntılı bir prosedür açıklanmakta ve saflaştırma sırasında kaybı azaltmak için iyileştirmeler yapılmaktadır. Ayrıca, kirletici madde eksikliğini ve virüs bütünlüğünü doğrulamak için yapılması gereken önerilen kalite kontrol tahlillerinin açıklamaları da dahildir. Genel olarak, bu ayrıntılı prosedür, klinik öncesi çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek titreli, in vivo-grade, rekombinant, lentojenik ve mezojenik NDV’nin sentezini, saflaştırılmasını ve depolanmasını sağlar.
Avian Orthoavulavirus-1 olarak da bilinen Newcastle Hastalığı Virüsü, hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı 1,2,3,4,5,6,7 olarak kullanılma potansiyeline sahip zarflı bir kuş paramiksovirüsüdür. Son zamanlarda, SARS-CoV-2’nin başak proteinini ifade etmek için tasarlanan NDV, fare ve hamster meydan okuma modelleri 7,8,9’da etkili bir burun içi aşı olarak karakterize edilmiştir. Bir kanser immünoterapisi olarak kullanıldığında, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin, özellikle doğal öldürücü hücrelerin, tip I interferon üretiminin ve antitümöre özgü T hücrelerinin10,11,12,13 üretilmesinin işe alınmasıyla sonuçlanır. Bu güçlü immünostimülatör özelliklere ek olarak, NDV güçlü bir güvenlik profiline ve iyi kurulmuş bir ters genetik sisteme sahiptir14,15. Bu arzu edilen özellikler, çok sayıda klinik öncesi ve insan klinik çalışmasında NDV’nin değerlendirilmesini sağlamıştır (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Bu son derece umut verici, bağışıklık uyarıcı viral vektörü daha da ilerletmek için, in vivo olarak güvenle uygulanabilen yüksek titreli, ultra saf NDV’nin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı yöntemlere ihtiyaç vardır.
NDV bir kuş paramiksovirüsü olduğundan, embriyonlanmış tavuk yumurtasında en sık çoğaltılır. NDV’yi yaymak için hücre bazlı sistemler mevcut olsa da, çoğu embriyonlanmış tavuk yumurtasında elde edilene benzer titreler üretememiştir18. Bununla birlikte, yumurta bazlı üretimin uzun olması ve kolayca ölçeklendirilememesi, büyük miktarlarda SPF tavuk yumurtası tedarik edilmesinin sorunlu olabileceği ve yumurta alerjenleri ile kontaminasyon potansiyelinin bulunması da dahil olmak üzere yumurtalarda NDV üretmenin bazı dezavantajları vardır13,18,19,20 . Son zamanlarda, bir grup, serumsuz ortamda süspansiyonda yetiştirilen Vero hücrelerinin, NDV’nin saflaştırma21’den önce yumurtalarda elde edilenlerle karşılaştırılabilir titrelere replikasyonunu destekleyebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu, virüsü Vero hücrelerine adapte etmek için virüsün seri geçişini gerektiriyordu ve NDV’yi süspansiyon Vero hücrelerinden arındırmak için bir yöntemin optimizasyonu hala gereklidir21.
Daha önce de vurgulandığı gibi, yüksek titreli, in vivo dereceli virüsü arındırmak için kullanılan yöntemler, soru22’deki virüse bağlı olarak değişir. Rekombinant NDV’nin üretimi için iyi kurulmuş bir ters genetik sistemi mevcuttur. Bir cDNA klonu, yardımcı plazmidler ve T7 RNA polimerazı eksprese eden bir yardımcı virüsün kullanımını içeren bu süreç, daha önceayrıntılı olarak 15,23 olarak tanımlanmıştır. Bu protokol lentojenik veya mezojenik NDV’ye uygulanabilir. Bu protokolde tanımlanan virüs, viral P ve M genleri arasına yerleştirilen denizanası Aequorea victoria’dan gelen yeşil floresan proteinini (GFP) bireysel bir transkripsiyon birimi olarak kodlayan rekombinant bir mezojenik NDV’dir, çünkü bu daha önce yabancı transgen yerleştirme24 için en uygun yer olarak tanımlanmıştır.
Kapalı yöntemler, NDV’nin saflaştırılmasını, 100 ila 500 nm arasında değişen boyutuna ve yoğunluğuna15 göre özetlemektedir. Bu, yumurtaların alındığı andan itibaren son bir titreye sahip olmaya kadar yaklaşık 3 hafta içinde in vivo dereceli, yüksek titreli NDV stoklarının üretilmesine izin vermiştir. Teğetsel akış filtrasyonu, derinlik filtrasyonu ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme gibi yumurta bazlı virüslerin büyük ölçekli üretiminde sıklıkla kullanılan teknikler tanımlanmıştır ve bu yöntemlerin daha büyük ölçekli üretime çevrilmesini sağlar. NDV’nin saflaştırılması için daha önce tarif edilen teknikler, virüs stabilize edici bir tamponun dahil edilmesi, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme sırasında iyodiksantal kullanımı ve in vivo-grade kalite15’i sağlamak için çeşitli kalite kontrol önlemlerinin tanımlanması ile geliştirilmiştir. Bu, 0,8 ila 1,0 L allantoik sıvıdan 3 × 1010 PFU / mL’ye kadar ulaşan titrelere ulaşan in vivo dereceli NDV’nin saflaştırılmasına izin vermiştir.
Preklinik çalışmalarda terapötik ajanlar olarak kullanılan virüsler, in vivo15 uygulandığında toksisiteyi önlemek için yüksek oranda saflaştırılmalıdır. Maceracı ajanlar veya kirleticiler uzaklaştırılmazsa, bu viral ajanın terapötik etkisini reddeden ciddi advers reaksiyonlara yol açabilir28. NDV embriyonlanmış tavuk yumurtasında üretildiğinden, preklinik veya klinik modellerde in vivo kullanılmadan önce çıkarılması gerek…
The authors have nothing to disclose.
J.G.E.Y, Ontario Veteriner Koleji Doktora Bursu ve Ontario Yüksek Lisans Bursu aldı. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından SKW’ye (hibe #304737) ve LS’ye (hibe #401127) Keşif Hibeleri tarafından finanse edilmiştir.
0.25% Trypsin | HyClone | SH30042.02 | |
1 mL Slip-Tip Syringe | BD | 309659 | |
10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 302995 | |
10% Povidone Iodine Solution | LORIS | 109-08 | |
15 mL Conical Tubes | Thermo-Fisher | 14955240 | |
18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle | BD | 305196 | |
25 G x 5/8 in Needle | BD | 305122 | |
2-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
4% Paraformaldehyde-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
5 mL Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
96 Well Tissue Culture Plate – Flat Bottom | Greiner Bio One | 655180 | |
Acetic Acid, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
Agarose | Froggabio | A87-500G | |
Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
Allegra X-14 Centrifuge | Beckman Coulter | B08861 | |
Ammonium Persulfate | BioRad | 161-0700 | |
Bleach (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
Broad, unserrated tipped forceps | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
Centramate Cassette Holder | PALL | CM018V | |
ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
CO2 Incubator | Thermo-Fisher | ||
Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
DF1 Cells | ATCC | CRL-12203 | |
Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
Digital 1502 Sportsman Egg Incubator | Berry Hill | 1502W | |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
Egg Candler | Berry Hill | A46 | |
Ethanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 | |
Fine Point High Precision Forceps | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
Fluorescent Microscope | ZEISS AXIO | Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein | |
Freeze Dry System Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging of Agarose Gels | |
Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Thermo-Fisher | 4368814 | |
High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
Humidity Kit | Berry Hill | 3030 | |
Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile) |
L-Lysine Monohydrochloride | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Peristaltic Pump with digital display |
Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Platinum-Cured Silicone |
MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
Methanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast and running appartus |
Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
Normal Goat Serum | Abcam | AB7481 | |
NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System | Thermo-Fisher | B1A | |
PBS 10X Solution | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
PowePac 300 | BioRad | Model 1655050 – for Agarose gel electrophoresis | |
Q5 High Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
Sodium Hydroxide (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
Specific pathogen free eggs | CFIA | NA | Supplier will vary depending on location |
Sucrose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
Supracap 50 Depth Filter | PALL | SC050V100P | |
Surgical Scissors | Thermo-Fisher | 08-951-5 | |
Sw41Ti Rotor | Beckman Coulter | 331362 | Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes | Beckman Coulter | 359472 | |
TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in) | Beckman Coulter | 344059 | |
Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
Tubing Screw Clamp | PALL | 88216 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
Utility Pressure Gauges | Cole-Parmer | 68355-06 |