Summary

Undersøke effekten av plantevernmidler på Caenorhabditis elegans Neurons

Published: May 27, 2022
doi:

Summary

Unge voksne Caenorhabditis elegans nematoder er utsatt for forskjellige konsentrasjoner av kommersielle plantevernmidler eller andre toksiske stoffer i 2-24 timer. Deretter kan forskjellige nevroner visualiseres ved hjelp av fluorescerende uttrykkende stammer. Dette papiret demonstrerer hvordan man eksponerer nematoder for plantevernmidler og vurderer nevronskader.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en kraftig modellorganisme som brukes i mange forskningslaboratorier for å forstå konsekvensene av eksponering for kjemiske miljøgifter, plantevernmidler og et bredt utvalg av giftige stoffer. Disse nematodene er enkle å jobbe med og kan brukes til å generere nye forskningsfunn, selv i bachelorbiologilaboratoriet. En fler ukers laboratorieserie med autentiske, studentdrevne forskningsprosjekter trener studentene i et verktøysett med teknikker og tilnærminger i atferdsmålinger, cellebiologi og mikroskopi som de deretter bruker på prosjektene sine. En teknikk i verktøysettet kvantifiserer prosentandelen nevroner som utviser nevrodegenerativ skade etter eksponering for et kjemisk toksisk middel som et plantevernmiddel. Unge voksne C. elegans nematoder kan bli utsatt for forskjellige konsentrasjoner av kommersielt tilgjengelige plantevernmidler eller andre typer toksiske stoffer i 2-24 timer. Deretter kan studenter på lavere nivå visualisere forskjellige nevronundertyper ved hjelp av fluorescerende uttrykkende stammer av C. elegans. Disse teknikkene krever ikke sofistikert bildebehandlingsprogramvare og er effektive ved selv lave forstørrelser, noe som gjør behovet for dyr konfektmikroskopi unødvendig. Dette papiret demonstrerer hvordan man behandler nematodene med plantevernmidler og hvordan man skal avbilde og score nevronene. Det gir også en enkel protokoll for mikroskopi og analyse av nevronmorfologi. Materialene som brukes til denne teknikken er billige og lett tilgjengelige i de fleste lavere biologiavdelinger. Denne teknikken kan kombineres med atferdsmessige tiltak som bevegelse, basal slowing eller egglegging for å gjennomføre en potensielt publiserbar serie eksperimenter og gi studenter en autentisk forskningsopplevelse til en svært lav pris.

Introduction

Caenorhabditis elegans er en utmerket modellorganisme for laboratoriekursopplæring i biovitenskapelige kurs for introduksjons- og mellomnivåstudenter. Denne laboratorieprosedyren kan brukes som en del av en flerukemodul som utforsker ulike effekter av ofte brukte plantevernmidler på C. elegans oppførsel og cellebiologi. Studentene kan lære å designe og gjennomføre selvstendige prosjekter som lærer dem dataanalyse og presentasjonsevner. Dette dokumentet fokuserer på protokollene for å utsette C. elegans for plantevernmidler blandinger og deretter observere og analysere effekten på nevron morfologi.

Plen kjemiske plantevernmidler blandinger er mye brukt til bolig- og landbruksbruk og kan kjøpes hos enhver lokal hagebutikk. Det er økende bekymring for sikkerheten til disse kjemikaliene for mennesker og dyreliv 1,2,3. Studentene kan lese den vitenskapelige litteraturen og velge et plantevernmiddel for eksperimentell evaluering og på den måten lære om grunnleggende biologi og nevrobiologi, samt viktige laboratorieferdigheter som eksperimentell design og analyse, og generelle laboratorieferdigheter som pipettering og seriell fortynning, dissekering av mikroskopi, fluorescerende mikroskopi, digital fotografering og figurproduksjon.

Protokollene beskrevet i dette dokumentet kan stå alene i et mellomnivåkurs i biologi eller nevrovitenskap eller være en del av en flerukemodul som også kan omfatte målinger av atferd styrt av bestemte grupper nevroner. For eksempel er beskrevet i denne protokollen en vurdering av morfologien til kolinerge nevroner som styrer bevegelse ved hjelp av en stamme nematode som uttrykker GFP (LX 929) i kolinerge nevroner4. Disse stammene kan oppnås for svært lave priser fra Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammer som uttrykker GFP i dopaminerge nevroner (OH 7457), kolinerge nevroner (LX 929) eller mCherry uttrykt i alle nevroner (PVX4) er alle gode valg. Studentene kunne også måle bevegelse og innhente data for å følge vurderingen av morfologi. En fullstendig beskrivelse av et flerukes studentgruppeprosjekt finner du i Susman5.

Dette studentgruppeprosjektet er ganske billig og enkelt å sette opp for grupper på fire studenter. Materialene som trengs inkluderer et dissekerende mikroskop, tilgang til et fluorescens sammensatt mikroskop som kan ha et vedlagt digitalt kamera, Petri-plater og tilgang til nematode vekstagar, vekstbegrensede bakterier (stamme OP50, fra CGC), en gassflamme Bunsen brenner eller en alkohollampe, en autoklav, platinatråd og generelle laboratorieforsyninger som mikropipettere, mikroskoplys, lysbilder, deksler og pasteurpipetter i glass. Avhengig av det kjemiske toksiske middelet som undersøkes av studentgruppene, kan det hende at trinnene i protokollen må skje under en avtrekkshette eller med hansker. Denne protokollen bruker kjemiske blandinger som er vannløselige (ikke flyktige), og alle prosedyrer for sikker håndtering anbefalt av produsenten følges.

Protocol

All bruk av hvirvelløse dyr var i samsvar med institusjonens retningslinjer for dyrepleie og bruk. 1. Tilberedning av plantevernmiddelbelagte Petri-plater Forbered agar Petri retter (6 cm diameter fungerer best) ved hjelp av standard prosedyrer6.MERK: Disse kan gjøres måneder i forveien og oppbevares i kjøleskapet til bruk. Ta platene til romtemperatur (RT) på benken. I de fleste tilfeller bør studentgruppene få en tallerken for hve…

Representative Results

Metodene og protokollene som er beskrevet i denne artikkelen gir viktige laboratorieferdigheter for studenter på mellomnivå i biologi eller nevrovitenskap. Studentene kan få viktig erfaring med å utvikle et selvstendig prosjekt og gjennomføre et eksperiment av sitt eget design som kan gi nye resultater. Figur 3 viser et optimalt resultat av et studentprosjekt som til slutt ble en del av en publisert artikkel3. Selv om de fleste studentprosjekter ikke resulterer i…

Discussion

Protokollene som er beskrevet i dette manuskriptet, fungerer vellykket alene eller som en del av et flerukes uavhengig studentgruppeprosjekt. Protokollene er også egnet til frittstående, en ukes utforskende opplevelser. Nematodestammene er billige og enkle å vedlikeholde i forskningslaboratoriet. Elevene kan lett lære å plukke ormer med et ormplukk eller hvordan de kan bevege seg ved å skylle plater med vann og la dem slå seg ned med tyngdekraften. Eksperimentene kan utføres i løpet av en enkelt laboratorieperio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbeidet beskrevet i dette manuskriptet ble gjort for en mellomnivåklasse i nevrovitenskap. Midler til reagenser og forsyninger ble gitt av biologiavdelingen ved Vassar College. Mikroskopene og det digitale bildesystemet ble også levert av biologiavdelingen ved Vassar College. Forfatteren takker alle de mange studentene som tok dette kurset.

Materials

Agar Fisher Scientific BP97445
Agarose Fisher Scientific MP1AGAH0250
Alcohol lamp Fisher Scientific  17012826
Bunsen burner Fisher Scientific 17-012-820
C. elegans strains C. elegans Genetics Center
CaCl Fisher Scientific 10035-04-8
Cholesterol Fisher Scientific AAA1147030
Coverslips Fisher Scientific 12-545-AP
Digital camera Nikon These can vary depending on the requirement
Dissecting scope Nikon SMZ745
E. coli strain (OP50) C. elegans Genetics Center
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Fluorescent scope Nikon These can vary depending on the requirement
Imaging software Nikon These can vary depending on the requirement
Inoculation loop Fisher Scientific  131045
LB Broth Base Fisher Scientific BP9723-500
MgSO4 Fisher Scientific 10034-99-8
Microfuge tubes Fisher Scientific  05408129
Microscope slides Fisher Scientific 22-265446
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20A
Petri dishes Fisher Scientific AS4050
Pipette tips Fisher Scientific 94060316
Pipetters Fisher Scientific 14-386-319
Platinum wire Genesee Scientific 59-1M30P
Potassium Phosphate buffer Fisher Scientific AAJ61413AP
Sodium azide Fisher Scientific AC447810250

References

  1. Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
  2. Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
  3. Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
  4. Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
  5. Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
  6. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  7. Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
  8. Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
  9. Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
  10. Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).

Play Video

Cite This Article
Raley-Susman, K. M. Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons. J. Vis. Exp. (183), e63845, doi:10.3791/63845 (2022).

View Video