Summary
רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.
Abstract
עם היישום הרחב של טכנולוגיות ריצוף, רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים התגלו בפרוקי רגליים, כולל יתושים. שתי הקטגוריות העיקריות של וירוסים חדשים אלה הקשורים ליתושים הם "וירוסים המועברים על ידי יתושים (MBVs)" ו"וירוסים ספציפיים ליתושים (MSVs)". נגיפים חדשים אלה עשויים להיות פתוגניים הן לבעלי חוליות והן ליתושים, או שהם יכולים פשוט להיות סימביוטיים עם יתושים. וירוסי ישויות חיוניים כדי לאשר את המאפיינים הביולוגיים של וירוסים אלה. לפיכך, תואר כאן פרוטוקול מפורט לבידוד והגברה של וירוסים מיתושים שנאספו בשטח. ראשית, דגימות היתושים הוכנו כסופרנאטים של הומוגנאטים של יתושים. לאחר צנטריפוגה פעמיים, הסופרנאטנטים חוסנו לקו תאי יתוש C6/36 או לקו תאי חוליות BHK-21 להגברת הנגיף. לאחר 7 ימים, הסופרנאטנטים נאספו כסופרנאטנטים P1 ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סופרנאטנטים P1 הועברו פעמיים נוספות בתאי C6/36 או BHK-21 בזמן שמצב התא נבדק מדי יום. כאשר התגלתה ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) על התאים, סופרנאטנטים אלה נאספו ושימשו לזיהוי נגיפים. פרוטוקול זה משמש כבסיס למחקר עתידי על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל MBV ו- MSVs.
Introduction
יתושים הם קבוצה של וקטורים פתוגניים חשובים של פרוקי רגליים. ישנם כ -3,500 מינים של יתושים במשפחה Culicidae 1,2. פיתוח טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה הוביל לגילוי רצפים חדשים דמויי וירוסים רבים ביתושים ממקומות שונים בעולם3. באופן כללי, ניתן לסווג את הנגיפים הקשורים ליתושים אלה לשתי קבוצות עיקריות: MBVs ו- MSVs.
MBVs הם קבוצה של וירוסים מגוונים שהם גורמים סיבתיים למחלות רבות של בני אדם או בעלי חיים, כגון וירוס קדחת צהובה (YFV), נגיף דנגי (DENV), וירוס דלקת המוח היפנית (JEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) ונגיף קדחת עמק השבר הסורי אפריקאי (RVFV)4. הם איימו באופן חמור על בריאות הציבור בכך שגרמו לתחלואה ותמותה קשות הן בבני אדם והן בבעלי חיים ברחבי העולם. MBVs מקיימים באופן טבעי מחזור חיים בין פונדקאים מגוונים באמצעות העברה מיתוש נגוע לפונדקאי תמים, כמו גם מפונדקאי נגוע בנגיף ויתוש האכלה5. לכן, נגיפים אלה יכולים להדביק הן שורות תאי יתושים והן שורות תאים של בעלי חוליות במעבדה1.
MSVs, הכוללים וירוס Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) ווירוס Chaoyang (CHAOV), הם תת-קבוצה של וירוסים ספציפיים לחרקים 1,6,7. בשנים האחרונות, חלה עלייה בגילוי של MSV חדשים, וחלק MSV אלה נמצאו כבעלי השפעה על העברת MBVs. לדוגמה, CxFV, אשר יכול להיות זיהום מתמשך ב Culex pipiens, יכול לדכא שכפול WNV בשלב מוקדם8. נגיף פלבי ספציפי נוסף לחרקים, נגיף סוכן איחוי תאים (CFAV), נמצא כמעכב את התפשטות נגיף DENV וזיקה (ZIKV) ביתושים Aedes aegypti 9. לפיכך, פרוטוקול זה הוא גישה שימושית לבידוד וירוסים הקשורים ליתושים ויכול לסייע במחקר נוסף על התפלגות פתוגנים הקשורים ליתושים ושליטה במחלות המועברות על ידי יתושים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דיגום ומיון יתושים
- לכדו את היתושים הבוגרים דרך מלכודות האור MXA-02 או מלכודות יתושים פחמן דו חמצני בשטח.
- הרגו את היתושים שנאספו על ידי טבילה בחנקן נוזלי10,11. העברתם למעבדה על ידי המערכת הלוגיסטית של שרשרת הקירור12.
הערה: קרח יבש שימש בעיקר במערכת הלוגיסטית של שרשרת הקור. - (אופציונלי) אם אתרי הדגימה היו בקרבת המעבדה, שלחו ישירות את היתושים החיים במלכודות הרשת למעבדה והרדימו אותם על ידי הקפאה בטמפרטורה של ≤-20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות4.
- בצע זיהוי מורפולוגי של היתושים שנאספו באמצעות ספר הכלים13 לסיווג וזיהוי יתושים.
הערה: במידת הצורך, ניתן להשתמש ברקוד DNA כדי לסווג ולזהות יתושים14,15. - בהתבסס על תאריכי הדגימה והאתרים, הקצו אותם לבריכות שונות, ולאחר מכן אחסנו אותם בצינורות של 2-5 מ"ל.
- ציירו טבלה כדי לתעד כל צינור עם מיני יתושים, מספר, קוד דגימה, תאריך ואתרים.
- הדפס את התוויות עם קודי דגימה והצמיד אותן לצינורות.
- שמור צינורות עם דגימות יתושים ב -80 ° C עד ניתוח נוסף.
2. טחינת יתושים
- הכניסו 20-50 יתושים לכל צינור סטרילי בנפח 2 מ"ל עם חרוזי קרמיקה בקוטר 3 מ"מ עם 1.5 מ"ל של תווך Roswell Park Memorial Institute (RPMI) המכיל 2% תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין B.
הערה: יש לשמור את הצינורות על מגש קרח או ניס. - הומוגניזציה של היתושים עם הומוגנייזר רקמות בטמפרטורה נמוכה על ידי טחינה במשך 30 שניות ב 70 הרץ ב 4 ° C במשך שלושה מחזורים16.
- צנטריפוגו את התערובות ב-15,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C והעבירו את הסופרנאטנטים לצינורות חדשים.
- צנטריפוגה את supernatants שוב ב 15,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את פסולת יתושים12,17.
הערה: במידת הצורך, ניתן לסנן את הסופרנאטנטים באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. - Aliquot את supernatants (P0) לתוך 2 מ"ל פקק בורג צינורות אחסון (200 μL לכל צינור) ולאחסן אותם ב -80 ° C.
3. הכנת תאים ואמצעי תחזוקת תרבית תאים
הערה: קו תאי יתוש C6/36 (חסר RNAi Aedes albopictus ) וקו תאי חוליות BHK-21 (כליה של אוגר תינוק) שימשו להגברה ולבידוד הנגיף.
- יש לחסן 1 × 106 תאי C6/36 לתוך בקבוק 2 בגודל 75 ס"מ עם 10 מ"ל של RPMI בינוני בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ב-28°C באינקובטור לח 5% CO2.
- חסן 1 × 106 BHK-21 תאים לתוך בקבוק 2 75 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 1% P / S ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 לח.
הערה: התאים עברו פעמיים או שלוש בשבוע17,18. - זרעו את התאים בתרביתשל 75 ס"מ 2 בקבוקים (C6/36 או BHK-21 תאים) לתוך לוחות 24 בארות (C6/36 לכל באר: 1.4 × 105; BHK-21 לכל באר: 0.8 × 105).
- הניחו את הצלחות עם 24 הבארות ב-28°C או 37°C למשך הלילה.
- התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ ואשרו אם מפגש התאים בכל באר הוא 80%-90%.
- הכינו את מדיום תחזוקת תרבית התאים (500 מ"ל).
הערה: עבור C6/36, המדיום היה RPMI בינוני בתוספת 2% FBS ו 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון. עבור BHK-21, המדיום היה DMEM בינוני בתוספת 2% FBS ו 2% פניצילין-סטרפטומיצין-Amphotericin B פתרון.
4. בידוד וירוסים
הערה: כל השלבים בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). דרישת רמת הבטיחות של מעבדת הבטיחות הביולוגית נקבעה על ידי הערכת סיכוני הבטיחות הביולוגית בהתבסס על תקנות של מדינות ואזורים שונים. התהליך חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית.
- הסר את מדיום תרבית התאים מלוחות 24 הקידוחים והוסף 100 μL של מדיום תחזוקת תרבית התא ו 100 μL של supernatant של הומוגנאט יתוש (P0) לכל באר.
- יש לדגור על הצלחות בטמפרטורה של 28°C או 37°C למשך 60 דקות ולנער אותן בעדינות כל 15 דקות כדי למנוע התייבשות תאים.
- הסירו את הסופרנאטנט ושטפו כל אחד מהם היטב בעדינות עם 600 מיקרוליטר של מדיום תחזוקת תרבית תאים כדי להסיר את הלכלוך לחלוטין.
- הוסף 800 μL של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים לכל באר ושמור את הצלחות באינקובטור 5% CO2 לח ב 28 ° C או 37 ° C במשך 7 ימים.
- עקוב אחר מצב התא של כל באר תחת המיקרוסקופ מדי יום15.
- אספו את הסופרנאטנטים של התאים (P1 supernatants) ביוםהשביעי ואחסנו את הסופרנאטנטים בטמפרטורה של -80°C.
- חזור על שלבים 4.1-4.6 2x כדי לקבל סופרנאטנטים P2 ו-P3.
הערה: בשלב 4.3, שטיפה עדינה של כל באר עם 600 מיקרוליטר של אמצעי תחזוקה של תרבית תאים הייתה אופציונלית עבור P2 ו-P3. - תלוי איזו באר מראה את ההשפעה הציטופתוגנית (CPE) - תאים מתים, פיקנוזיס, ומתנתקים מפני השטח; מיזוג עם תאים סמוכים ליצירת סינקטיה; או הופעתם של גופי הכללה גרעיניים או ציטופלזמיים – הוסיפו 300-400 מיקרוליטר של הסופרנאטנט של CPE זה היטב לכל באר של לוחות 6 בארות חדשים המכילים תאים (מפגש התאים היה 80%-90%) כדי להגביר מאוד את הנגיפים.
- אספו את הסופרנאטנטים והכניסו אותם לצינורות אחסון של 2 מ"ל פקק בורג (500 מיקרוליטר לצינור). אחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
הערה: לאחר שלושה דורות של מעבר רצוף בתאים, הדגימות שלא גרמו ל-CPE הושלכו. במידת הצורך, ניתן להגדיל את הדורות של מעברים רצופים בתאים.
5. איתור רצפים נגיפיים על ידי RT-PCR
- חלצו את סך כל הרנ"א מ-200 מיקרוליטר של הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות ערכת מיני RNA נגיפי16.
הערה: כאן, מערכת מיצוי חומצת גרעין אוטומטית שימשה לחילוץ RNA כולל בהתאם להוראות יצרן המכשיר. - המר את הרנ"א ל-cDNA בהתאם להוראות ערכת RT-PCR באמצעות מכשיר PCR.
- הוסף 15 μL של RNA מעורבב עם 1 μL של פריימרים אקראיים לתוך צינור PCR. מניחים את הצינור בטמפרטורה של 70°C למשך 5 דקות ולאחר מכן מניחים אותו על קרח למשך 5 דקות.
- הוסף 5 μL של 5x buffer ו 25 μL של תערובת (10 mM dNTP, 40 U/μL RNase inhibitor, ו 200 U/μL M-MLV) לתוך הצינור ומניחים את הצינור על 42 ° C במשך 60 דקות ו 95 ° C במשך 10 דקות.
- יש לאחסן את הצינור בטמפרטורה של -20°C.
- השתמש בערכת PCR ובפריימרים אוניברסליים (טבלה 1) כדי לזהות וירוסים באמצעות PCR.
- עבור arboviruses, להגדיר את מערכת התגובה PCR (סה"כ 30 μL) עם הרכיבים הבאים: 3 μL של 10x Taq buffer, 3 μL של dNTP (1mM), 1 μL של פריימר קדמי (10 μm), 1 μL של פריימר הפוך (10 μm), 0.3 μL של Taq (10 U/μL), 19.7 μL של ddH 2 O, ו2μL של cDNA.
- לזיהוי flaviviruses, להגדיר את תהליך התגובה כמו: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 52 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לזיהוי אלפא-וירוסים, הגדר את תהליך התגובה כ: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לזיהוי של bunyaviruses, להגדיר את תהליך התגובה כמו: שלב 1: 35 מחזורים של 94 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 שניות; שלב 2: 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- זהה את מוצרי הגברה PCR על ידי 1% אלקטרופורזה ג'ל agarose ולשלוח אותם לניתוח ריצוף.
הערה: אם התנאים מאפשרים זאת, הסופרנאטנטים יכולים לעבור ניתוח ריצוף של הדור הבא כדי לזהות וירוסים חדשים ולקבל את כל הגנום הנגיפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר שחוסנו עם הסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים (P0), תאי C6/36 הציגו מרחב בין-תאי רחב, ותאי פילינג נצפו בשעה 120 שעות (איור 1A) בהשוואה לתאים הלא מחוסנים (קבוצת ביקורת) באותו זמן (איור 1B). לאחר הדגירה על תאי BHK-21 עם סופרנאטנטים P3, CPE נראה בתאי BHK-21 לאחר 48 שעות (איור 1C) בניגוד לתאי הבקרה (איור 1D). PCR בוצע כדי לקבוע מינים ויראליים. הפריימרים האוניברסליים לזיהוי פלאווי-וירוסים, אלפא-וירוסים ובוני-וירוסים סונתזו באופן מסחרי (טבלה 1). מוצר PCR עבור וירוס הבוניהוירוס Ebinur Lake Virus הוגדר כבקרה חיובית ונוסף לנתיב 1. הפריימרים האוניברסליים עבור bunyaviruses, flaviviruses, ו alphaviruses שימשו כדי ליצור את מוצרי PCR עבור supernatant ויראלי, אשר נוספו לאחר מכן לתוך נתיב 2, 3, ו 4, בהתאמה. הגדלים המשוערים של מוצרי PCR עבור flaviviruses, alphaviruses, ו bunyaviruses היו 266 bp, 434 bp, ו 251 bp, בהתאמה. הפסים נראו רק בנתיב 2 ובשלט החיובי נתיב 1. כתוצאה מכך, סביר להניח שהווירוס בסופרנאטנטים הוא וירוס בוניה-וירוס (איור 2).
איור 1: תצפית CPE של תאים לאחר הדגירה עם סופרנאטנטים נגיפיים. המצב של תאי C6/36 ב-120 שעות לאחר ההדבקה (CPE) (A) וזה של תאי הבקרה בו זמנית (B). המצב של תאי BHK-21 ב 48 hpi (C) וזה של תאי הבקרה (D). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: CPE = אפקט ציטופתוגני; HPI = שעות לאחר ההדבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות PCR עבור סופרנאטנטים נגיפיים. נתיב 1 מייצג את השליטה החיובית של bunyaviruses (וירוס אגם אבינור). נתיבים 2-4 ייצגו את תוצאות ה-PCR של סופרנאטנטים על ידי שימוש בפריימרים אוניברסליים עבור bunyaviruses (251 bp), flaviviruses (266 bp) ו-alphaviruses (434 bp). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| נגיף | תחל | אוליגונוקלאוטיד ('5'→3') | גודל מוצר PCR (bp) | ||
| Flaviviruses | פורמולה 1 | TACAACATGATGGGAAAGAGAGAA | 266 | ||
| ו2 | GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC | ||||
| אלפא-וירוסים | M2W | YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW | 434 | ||
| cMw3 | ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC | ||||
| Bunyaviruses | BCS82C | ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC | 251 | ||
| BCS332V | TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT | ||||
טבלה 1: פריימרים אוניברסליים לזיהוי arbovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת שיטה זו הייתה להציע דרך מעשית לבידוד נגיפים הקשורים ליתושים באמצעות קווי תאים שונים. חיוני להוסיף את האנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין) לסופרנאטנטים של ההומוגנטים של היתושים כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים או פטריות. יתושים וסופרנאטנטים נגיפיים המתקבלים בשדה חייבים להיות בקירור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
צעד קריטי נוסף בפרוטוקול היה השחיקה. דגימות יתושים צריך להיות אבקה ביסודיות ומאוחסן על קרח. רקמות יתושים טחונות מספיק יכולות לגרום למוות תאי ועלולות להטות את ממצאי ניתוח CPE. לפני בידוד הנגיף, יש צורך להעסיק יתושים רגילים כדי לאשר את פרמטרי הטחינה. הטחינה חייבת להיעשות בטמפרטורות נמוכות כדי למנוע מהנגיף להפוך ללא פעיל במהלך התהליך.
גישה זו יכולה לבודד ולהגביר ביעילות וירוסים הקשורים ליתושים, אך היא מקובלת רק על וירוסים שעשויים להציג CPE בשורות תאים של יונקים או חרקים. גישה זו אינה מתאימה לנגיפים שאינם גורמים ל-CPE. באמצעות הפרוטוקול, אנו עשויים להשיג מועמדים נגיפיים המכילים רק סוג וירוס אחד או תערובת עם וירוסים שונים. חקירה נוספת - טיהור נגיפי, זיהוי מורפולוגי וניתוח פלאק - עדיין נדרשת כדי להשיג את הנגיף המטוהר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תוכנית המדע והטכנולוגיה של ווהאן (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z.
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E.
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , Suzhou University Press. (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
