Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling af størrelsesstyrede og emulsionsfrie chitosan-genipinmikrogeler til vævstekniske applikationer

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857

Summary

Den foreliggende protokol beskriver en ikke-emulsionsbaseret metode til fremstilling af chitosan-genipin-mikrogeler. Størrelsen af disse mikrogeler kan styres præcist, og de kan vise pH-afhængig hævelse, nedbrydes in vivo og belastes med terapeutiske molekyler, der frigives over tid på en vedvarende måde, hvilket gør dem yderst relevante for vævstekniske applikationer.

Abstract

Chitosan mikrogeler er af betydelig interesse i vævsteknik på grund af deres brede vifte af applikationer, lave omkostninger og immunogenicitet. Imidlertid fremstilles chitosanmikrogeler almindeligvis ved hjælp af emulsionsmetoder, der kræver organiske opløsningsmiddelskylninger, som er giftige og skadelige for miljøet. Den foreliggende protokol præsenterer en hurtig, ikke-cytotoksisk, ikke-emulsionsbaseret metode til fremstilling af chitosan-genipin-mikrogeler uden behov for organiske opløsningsmiddelskylninger. De mikrogeler, der er beskrevet heri, kan fremstilles med præcis størrelseskontrol. De udviser vedvarende frigivelse af biomolekyler, hvilket gør dem yderst relevante for vævsteknik, biomaterialer og regenerativ medicin. Chitosan er tværbundet med genipin for at danne et hydrogelnetværk og passeres derefter gennem et sprøjtefilter for at producere mikrogelerne. Mikrogelerne kan filtreres for at skabe en række størrelser, og de viser pH-afhængig hævelse og nedbrydes over tid enzymatisk. Disse mikrogeler er blevet anvendt i en rottevækstpladeskademodel og blev påvist at fremme øget bruskvævsreparation og vise fuldstændig nedbrydning efter 28 dage in vivo. På grund af deres lave omkostninger, høje bekvemmelighed og lette fremstilling med cytokompatible materialer præsenterer disse chitosanmikrogeler en spændende og unik teknologi inden for vævsteknik.

Introduction

Vækstpladen, også kendt som fysen, er bruskstrukturen placeret i slutningen af lange knogler, der formidler vækst hos børn. Hvis vækstpladen bliver skadet, kan der dannes reparationsvæv kendt som en "benet bar", som afbryder normal vækst og kan forårsage vækstdefekter eller vinkeldeformiteter. Epidemiologiske data har vist, at 15% -30% af alle skeletskader i barndommen er relateret til vækstpladen. Knoglestangdannelse forekommer i op til 30% af disse skader, hvilket gør vækstpladeskader og deres tilhørende behandling til et signifikant klinisk manifestationsproblem 1,2,3,4. Når dannelse af benstang opstår, involverer den mest almindelige behandlingsvej resektionering af knoglestangen og indsættelse af et interpositionelt materiale, såsom silicium eller fedtvæv5. Patienter, der gennemgår knoglestangsresektionskirurgi, har dog ofte en dårlig prognose for fuld genopretning, da der i øjeblikket ikke er nogen behandling, der fuldt ud kan reparere en skadet vækstplade 6,7,8. I lyset af disse mangler er der et kritisk behov for effektive strategier til behandling af vækstpladeskader, både for at forhindre dannelsen af en benet stang og regenerere sundt fysealbruskvæv.

Hydrogelmikropartikler eller mikrogeler har for nylig fået interesse som injicerbare stilladser, der kan give vedvarende frigivelse af terapi9. På grund af deres høje tunbarhed og biokompatibilitet er mikrogeler også velegnede til bioaktiv faktor eller celleindkapsling. Mikrogeler kan være lavet af forskellige materialer, lige fra syntetiske polymerer, såsom polyethylenglycol (PEG), til naturlige polymerer som alginat eller chitosan 10,11,12. Chitosan har vist sig at have flere gavnlige virkninger for vævsteknik, såsom dets evne til at destabilisere den ydre membran af gramnegative bakterier og derved tilbyde iboende antimikrobiel aktivitet1 3,14. Derudover er chitosan omkostningseffektiv, celleinteraktiveret og let modificeret ved hjælp af sin aminholdige struktur. Chitosan-baserede mikrogeler lover en biomaterialestrategi for lægemiddellevering og materialesignalering, der kan fremme vævsregenerering og samtidig forhindre bakteriel infektion. Imidlertid fremstilles chitosanmikrogeler ofte med en bred vifte af teknikker, der kræver specielt udstyr, emulsionsteknikker eller cytotoksiske opløsningsmiddelskylninger. For eksempel har nogle undersøgelser fremstillet chitosanmikrogeler med emulsionsbaserede metoder, men disse protokoller kræver opløsningsmiddelskylninger og cytotoksiske tværbindinger, hvilket potentielt negerer deres oversættelse til kliniske indstillinger15,16. Andre undersøgelser har brugt mikrofluidik eller elektrospray-tilgange til fremstilling af chitosanmikrogeler, som kræver specielt udstyr, forberedelse og træning 17,18. Chitosanmikrogeler fremstilles også almindeligvis med en dråbevis proces med tværbinding til chitosanopløsning; Denne metode er imidlertid stærkt afhængig af opløsningsviskositet, polymerkoncentration og strømningshastighed, hvilket gør det vanskeligt at kontrollere størrelsen og dispersiteten af mikrogelerne19,20. Omvendt kræver metoden til mikrogelfremstilling, der er beskrevet heri, intet specialudstyr eller opløsningsmiddelskylninger, hvilket gør disse mikrogeler levedygtige til fremstilling i næsten ethvert laboratorium eller indstilling. Derfor repræsenterer disse mikrogeler yderst relevante biomaterialer til et hurtigt, omkostningseffektivt og let at producere lægemiddelleveringsmiddel til mange applikationer.

Ved at modulere en mikrogels sammensætning og materialeegenskaber kan forskere få præcis kontrol over det cellulære mikromiljø og dermed styre celleadfærd på en materialeafhængig måde. Mikrogeler kan anvendes alene eller kombineres med bulkbiomaterialesystemer for at give specifikke funktionaliteter, såsom forlænget frigivelse af bioaktive faktorer eller præcis speciel signalering til indfødte eller eksogene celler. Biomaterialer og mikrogeler har vist sig som attraktive behandlingsmuligheder for vækstpladeskader. Der er dedikeret en betydelig indsats til at udvikle alginat- og chitosanbaserede biomaterialer til behandling af vækstpladeskader 21,22,23,24,25. På grund af den dynamiske tidsmæssige karakter af vækstpladeforbening og knogleforlængelse forstås mekanismen for dannelse af benstang ikke fuldt ud. Derfor er der udviklet flere dyremodeller for bedre at belyse mekanismerne for endokondral ossifikation og dannelse af benstang, såsom hos rotter, kaniner og får 26,27,28. En sådan model er en rottevækstpladeskademodel, der bruger en borehulsdefekt i rotteskinnebenet til at producere en benstang på en forudsigelig og reproducerbar måde og efterligner menneskelige skader på tværs af alle tre zoner i vækstpladen29,30. Flere biomaterialebaserede strategier til behandling af vækstpladeskader er blevet testet ved hjælp af denne model. Derudover er der udviklet to forskellige metoder til fremstilling af chitosanmikrogeler, som kan bruges som et injicerbart biomaterialesystem, der frigiver terapi på en vedvarende måde10,31. Disse mikrogeler er blevet anvendt i en rotte physeal skade model, og de viste forbedret brusk regenerering31 ved frigivelse af SDF-1a og TGF-b3. Teknikkerne i denne protokol beskriver metoder, der er udviklet til at fremstille disse chitosanmikrogeler, som derefter kan anvendes i en lang række vævstekniske applikationer. For eksempel har nylige undersøgelser brugt termo- eller magento-responsive chitosanmikrogeler til kontrollerede onkologiske lægemiddelleveringsapplikationer 32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee. 6 uger gamle han-Sprague-Dawley rotter blev brugt til denne undersøgelse. Modellen med rottevækstpladeskader blev oprettet efter en tidligere offentliggjort rapport30.

1. Fremstilling af chitosanpolymeren

  1. Opnå renset og lyofiliseret lavmolekylær (LMW) chitosan fra kommercielt tilgængelige kilder (se Tabel over materialer).
  2. Der tilsættes 495 ml dobbeltdestilleret vand (ddH20) og en omrøringsstang til et 1 L bægerglas. Tilsæt 5 g chitosan (trin 1.1.) og bland godt.
    BEMÆRK: Chitosan er kun sparsomt opløseligt i en vandig opløsning ved fysiologisk pH, så chitosanen opløses ikke let på dette trin.
  3. Tilsæt 5 ml iseddike til den ovenfor fremstillede chitosanopløsning.
  4. Rør dækket ved 300 o / min i 18 timer med bægerglasset sat i et vandbad holdt ved 50 ° C.
  5. Brug en Büchner-kolbe og -tragt til at filtrere chitosanopløsningen gennem faldende størrelser af filterpapir: 22 μm, 8 μm og 2,7 μm (se materialetabellen).
  6. Tilsæt den filtrerede chitosanopløsning til cellulosedialyseslange (se Materialetabel) og lad dialysere iddH20ved stuetemperatur i 4 dage, og skift ddH20 hverdag.
    BEMÆRK: Brug ultrarent ddH2O vand til den sidste ændring.
  7. Overfør den dialyserede chitosanopløsning til et bægerglas, og pH-værdien justeres til 8,0 ved hjælp af 1 M NaOH.
  8. Aliquot chitosan i centrifugerør og centrifuge ved 4000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  9. Dekanter supernatanten til en affaldsstrøm, og genophæng chitosanen i ddH2O, gentag 2x.
  10. Frys og derefter lyofiliser chitosan pellet.
    1. Fjern hver dag det lyofiliserede produkt og registrer massen.
      BEMÆRK: Når massen af det lyofiliserede produkt ikke længere ændrer sig, tørres produktet fuldt ud og kan opbevares ved -20 °C, indtil det er klar til brug.

2. Fremstilling af chitosanhydrogel

  1. Tilsæt 2 ml 6% eddikesyre og 120 mg renset chitosan (trin 1) til en 10 ml Luer-lock sprøjte for at danne en 6% w/v chitosanopløsning.
  2. Tilslut Luer-lock-sprøjten til en anden identisk sprøjte ved hjælp af et luerlås-stik med hun-hun, og bland opløsningen frem og tilbage i 30 s, eller indtil chitosanen er helt opløst i eddikesyren.
  3. Før tværbinding tilsættes ethvert terapeutisk eller bioaktivt middel til chitosanopløsningen (hvis nødvendigt). Til denne undersøgelse blev 200 ng SDF-1a og TGF-b3 (se tabel over materialer) tilsat mikrogelerne.
    BEMÆRK: SDF-1a og TGF-b3 er bioaktive agenser, der er relevante for regenerering af vækstpladevæv. SDF-1a fremmer migration af mesenkymale stamceller til defektstedet, og TGF-b3 tjener som en kondrogen faktor til at inducere differentiering af disse stamceller ned ad den kondrogene slægt31.
    BEMÆRK: Bland chitosanen igen mellem sprøjterne for fuldt ud at inkorporere det terapeutiske.
  4. Der fremstilles 100 mM stamtværbindingsopløsning af genipin (se materialetabellen) i 100 % ethanol.
  5. Der tilsættes 100 μL af den tilberedte genipinopløsning (trin 2.4.) til den chitosanholdige sprøjte, og blandes igen frem og tilbage mellem sprøjterne i 30 s.
  6. Ekstrudere blandingen fra sprøjten på en 35 mm petriskål, dække den med paraffinfilm og inkubere den ved 37 °C natten over i en befugtet atmosfære.
    BEMÆRK: Opløsningen bliver mørkeblå, hvilket indikerer, at tværbindingsreaktionen mellem chitosan og genipin har fundet sted, hvilket fører til dannelsen af chitosanmikrogel.
  7. Filtrer den tilberedte chitosanmikrogel ved at følge nedenstående trin.
    1. Bryd forsigtigt hydrogelen i mindre stykker ved hjælp af en spatel.
      BEMÆRK: Stykkerne skal være små nok til at blive overført til bagsiden af en 10 ml sprøjte, ~ 1-2 cm i diameter.
    2. Anbring et filter med den ønskede maskestørrelse på bagsiden af en ren 10 ml sprøjte.
      BEMÆRK: Det typiske størrelsesområde for mikrogeler er mellem 50-200 μm.
    3. Overfør de ødelagte gelstykker til sprøjten, der er forsynet med filteret, og tilsæt 6 mlddH20.
      BEMÆRK: Chitosangelen vil svulme betydeligt op i det vandige medium, så der forventes en stor ændring i gelvolumenet.
    4. Tilslut sprøjten via et Luer-lock-stik til en anden ren 10 ml sprøjte.
    5. Tving gel + vandblandingen gennem sprøjten med filteret for at skabe mikrogeler med en specificeret maksimal diameter.
      1. Efter den første filtrering skal du åbne bagsiden af sprøjten, der indeholder filteret, og ekstrudere blandingen tilbage i denne sprøjte.
      2. Udskift bagsiden af sprøjten og tving blandingen gennem filteret igen.
      3. Gentag filtreringen 5-6x, eller indtil der er ringe modstand gennem filteret.
  8. Skyl og rens de filtrerede mikrogeler.
    1. Overfør den filtrerede gelblanding til et 50 ml konisk rør, bring det samlede volumen op til 20 ml medddH20, og hvirvel derefter blandingen for at sikre homogen dispersion.
    2. Centrifugering af mikrogelerne ved 100 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og dekantering af den øvre vandige fase.
    3. Resuspend mikrogelerne i 10 ml 70% ethanol, hvirvel, og læg dem under UV-lys i 1 time for at sterilisere.
    4. Centrifugering af mikrogelerne ved 1.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, kassér ethanolen og skyl 3x med ddH20.

3. Fremstilling af mikrogeler til in vitro- eller in vivo-anvendelser

BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev bruseregenerering i vækstpladeskader undersøgt i en rottemodel. Yderligere oplysninger findes i reference31.

  1. Resuspend mikrogelpillerne 1:1 iddH20. Mikrogeler kan opbevares i op til 1 måned suspenderet i ddH20 ved 4 °C. Hvis der anvendes et bioaktivt middel, skal mikrogelerne anvendes straks.
  2. Opret skadestedet i dyret efter en tidligere offentliggjort rapport30.
  3. Skyl skadestedet med saltvand og hold enten dyret ubehandlet (til kontrolundersøgelse) eller injicer kun chitosanmikrogelerne eller mikrogelerne fyldt med de bioaktive stoffer (trin 3.2.).
  4. Luk såret i dyret og administrer postkirurgiske analgetika30.
  5. På dag 7 eller 28 efter operationen aflives rotten ved overdosis af CO2 , punktafgiftspligtige lemmerne og udføres histologi for at vurdere vævsreparationen på skadestedet31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket fremstilling af chitosanmikrogeler er afhængig af tværbindingsreaktionen mellem genipin og chitosan, der specifikt involverer aminerne på chitosanpolymerkæderne. I modsætning til andre mikrogelfremstillingsteknikker kræver denne metode ikke emulsioner eller opløsningsmiddelskylninger og kan hurtigt og nemt udføres med billigt udstyr. En kendetegnende indikator for vellykket mikrogelfabrikation er den tydelige farveændring fra offwhite til mørkeblå, efter at chitosan og genipin er blevet blandet. Tværbindingsreaktionen mellem genipin og aminholdige forbindelser, såsom chitosan eller andre proteiner, er blevet velkarakteristisk i litteraturen34. Kort sagt anses tværbindingsmekanismen for at være et nukleofilt angreb fra aminogrupperne af chitosan, hvor genipin virker som et dialdehyd med stabile kondensationsprodukter35. De korte kæder af stabil, kondenseret genipin fungerer som tværbindingsbroer mellem chitosanpolymererne. Tværbindingsreaktionen får opløsningen til at blive mørkeblå, sandsynligvis på grund af iltradikalinduceret polymerisation og dehydrogenering af mellemliggende forbindelser, som følger ringåbningsreaktionen fra nukleofilt angreb36.

Når mikrogelerne er blevet filtreret og resuspended i en 1:1 vandfortynding, kan de let anvendes i forskellige biomaterialeapplikationer. Arbejdet er for nylig blevet offentliggjort ved hjælp af disse emulsionsfrie chitosanmikrogeler til fremme af bruskregenerering i vækstpladeskader. Mikrogelerne blev fremstillet som beskrevet heri og enten holdt tomme eller fyldt med SDF-1a og TGF-b3, som er bioaktive stoffer, der er relevante for regenerering af vækstpladevæv, hvor SDF-1a fremmer migration af mesenkymale stamceller til defektstedet, og TGF-b3 tjener som en kondrogen faktor til at inducere differentiering af disse stamceller ned ad den kondrogene slægt37, 38. Frigivelseshastigheden af proteinerne blev kvantificeret in vitro via ELISA, og frigivelsen af disse molekyler blev opretholdt over tid31. Derefter blev mikrogelerne injiceret i en vækstpladeskade i en in vivo-rottemodel , og de injicerede mikrogeler forhindrede tidlig dannelse af benstang in vivo31. Disse injicerbare, omkostningseffektive og enkle at producere chitosanmikrogeler kunne let anvendes i mange biomaterialeapplikationer.

Selvom denne proces til mikrogelfabrikation er optimeret til enkel opsætning og applikationer, kan der stadig opstå flere problemer, som forskere bør være opmærksomme på. Utilstrækkelig blanding af polymer- og tværbindingskomponenterne er den mest sandsynlige årsag til forskellige resultater under fremstillingen. Den faste chitosan skal blandes kraftigt mellem sprøjterne, og den resulterende chitosanopløsning skal være fuldstændig homogen, før genipin-tværbindingen tilsættes. Hvis opløsningen ikke er homogen, vil de faste chitosanstykker, der er tilbage i opløsningen, danne klumper, og ujævn tværbinding vil forekomme, hvilket forhindrer effektiv filtrering og resulterer i polydispergerede mikrogeler med signifikant varierende diametre. En anden vigtig faktor at overveje under fremstillingen er at undgå fordampning i tværbindingsperioden, hvilket skal forhindres med paraffinfilm eller andre fordampningsfangstteknikker. Hvis chitosanhydrogelen tørrer ud, vil den ikke svulme op under vandskylningerne, og den filtreres ikke gennem sprøjten. Endelig skal mikrogelerne suspenderes i overskydende vand under filtreringsprocessen og opbevares i vand ved 4 °C, når de ikke er i brug. Mikrogelerne kan ikke ekstruderes eller injiceres, medmindre de suspenderes i mindst 1:1 fortynding af vand.

Figur 1 viser en bred oversigt over mikrogelfremstillingsprocessen. Den samme proces er afbildet igen i figur 2, som viser fotografier af processen og understreger de protokolfaser, der er vanskelige at forstå ud fra tekst alene. For eksempel viser figur 2D , hvordan et trådnetfilter indsættes i 10 ml sprøjten. Når det er helt siddende mod toppen af sprøjten, giver dette trådnetfilter mulighed for hurtig og bekvem filtrering af chitosanmikrogelerne uden specialudstyr eller opløsningsmidler. Tilsvarende viser figur 2E strømmen af hydreret chitosangel gennem maskefilteret, som er grundlaget for mikrogelfremstilling. Figur 3 blev tilpasset fra vores tidligere publikation om disse mikrogeler og viser deres pH-afhængige hævelsesadfærd og forskellene i mikrogelernes størrelse afhængig af porestørrelsen på maskefilteret. Forskellige maskestørrelser kan bestilles fra producenten, hvilket giver mulighed for bekvem kontrol over mikrogelernes størrelse. Denne præcise kontrol over mikrogelstørrelsen er meget vigtig, når man designer lægemiddelafgivelsessystemer med veldefinerede terapeutiske belastningsfrigivelseshastigheder. Tidligere arbejde med mikrogeler viste også, at de nedbrydes signifikant i nærvær af lysozym ved 2-4 uger31. Endelig viser figur 4 histologibilleder31 i en rottevækstpladeskademodel behandlet med chitosanmikrogelerne fyldt med SDF-1a og TGF-b3.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over chitosan mikrogel fabrikation. Figuren blev oprettet ved hjælp af biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fotografier af mikrogelfremstillingsprocessen. (A) Chitosanopløsning i sprøjter forbundet ved hjælp af Luer-lås. B) Ekstrudering af chitosingel til en 35 mm petriskål. (C) Hentning af chitosan gel efter tværbinding af farveændring fra offwhite til mørkeblå. (D) Top-down-visning inde i sprøjten, der viser trådnetsigten, der er monteret mod sprøjtens dyse. (E) Chitosan gel blev presset gennem et maskefilter for at producere mikrogeler. (F) Mikrogeler blev opbevaret i en 1:1 fortynding af ddH20 i et konisk rør. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: pH-afhængig hævelsesadfærd af mikrogelerne. (A) Normalfordelingsgraf for Feretdiameteren, der viser hævelsesadfærd af mikrogelerne som reaktion på pH-ændringer. (B) Fluorescerende billeder af mikrogeler fremstillet ved hjælp af nr. 200 mesh (øverste billede: mikrogeler i <75 μm størrelse) og nr. 100 mesh (nederste billede: 75-150 μm størrelse mikrogeler). Figuren er genoptrykt med tilladelse fra reference31. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Histologibilleder i en model for skade på rottevækstpladen behandlet med chitosanmikrogelerne fyldt med SDF-1a og TGF-b3. 10x histologiske billeder, der viser vækstpladereparationsvæv af intakt (A) og (E), ubehandlet (B) og (F), mikrogelbehandlet (C) og (G), mikrogel + SDF-1a behandlet (D) og (H) og mikrogel + TGF-b3 behandlet (I ) lemmer. Ingen dag 7 dyr blev behandlet med microgel + TGFb3. Alcian blå hæmatoxylin (ABH) pletter knoglen orange til rød, det fibrøse væv lyserødt og brusk blåt. Mikrogelen fremstår som et mørkerødt fibrøst væv. Skalastænger = 500 μm. Figuren er genoptrykt med tilladelse fra reference31. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrogeler er blevet bredt undersøgt i de senere år på grund af deres høje anvendelighed til forskellige formål, såsom lægemiddellevering eller celleindkapsling9. Den lette fremstilling af mikroskala biomaterialekonstruktioner er af væsentlig relevans inden for vævsteknik, da det giver forskere mulighed for at udvikle hydrogelbaserede strategier på en bestemt størrelse og tidsskala. Imidlertid kræver de fleste metoder til fremstilling af chitosanmikrogeler dyrt udstyr og reagenser, emulsioner eller cytotoksiske opløsningsmiddelskylninger, hvilket forhindrer deres oversættelse til klinisk brug 15,16,17,18,19,20. Disse mikrogeler udmærker sig med hensyn til deres betydelige bekvemmelighed ved fremstilling, der ikke kræver emulsionsteknikker eller opløsningsmiddelskylninger. Derudover bevarer disse mikrogeler de ideelle egenskaber til en vævskonstrueret konstruktion, såsom pH-afhængig hævelse og lægemiddelbelastning, afstemt nedbrydningsadfærd og vedvarende frigivelse af terapi.

Det mest kritiske trin i fremstillingen af disse chitosanmikrogeler er filtreringen mellem sprøjter. Disse mikrogeler starter som bulkhydrogel og filtreres til et bestemt størrelsesområde ved hjælp af trådnetfiltre. Uden filtrering ville mikrogelernes anvendelighed, mekaniske egenskaber og lægemiddelfrigivelsesegenskaber være væsentligt forskellige. Filtreringstrinnet giver mulighed for præcis kontrol over hydrogelernes størrelse, og det giver også mulighed for fremstilling af mikrogeler med høj kapacitet, der udviser pH-afhængig hævelse og vedvarende frigivelse af terapi.

En begrænsning af denne proces er, at filtreringstrinnet ikke førte til hydrogeler med en perfekt sfærisk form, hvilket kan være en vigtig faktor at overveje for nogle applikationer. Af denne grund blev mikrogelernes karakteristiske størrelse beskrevet ved anvendelse af feretdiameter (figur 3), hvilket er nyttigt til kvantificering af uregelmæssigt formede partikler39. Selvom mikrogelernes geometri ikke var en perfekt kugle, var partiklernes gennemsnitlige størrelse let at kontrollere baseret på sprøjtefilterets maskestørrelse, og for mange applikationer er det ikke nødvendigt at have perfekt sfæriske partikler. Mikrogelernes polydispersitetsindeks (PDI) blev kvantificeret ved hjælp af kvadratforholdet mellem standardafvigelsen for feretdiameter og den gennemsnitlige feretdiameter opnået fra en stor population af partikler (n = 74). PDI blev beregnet som 0,076 ved hjælp af ligningen

PDI = (s/D)2

hvor s er standardafvigelsen for den gennemsnitlige feretdiameter, og D er den gennemsnitlige feretdiameter40. På grund af filtreringen udført under denne proces og brugen af Feret-diameteren for uregelmæssigt formede partikler var polydispersitetsindekset for disse partikler ret lavt, i det omfang de kunne betragtes som monodisperse.

Til fremtidig forskning kan der foretages flere ændringer af denne protokol for bedre at passe til det givne forskningsbehov. For eksempel er kun to proteiner, SDF1-a og TGF-b3, blevet undersøgt for deres kontrollerede frigivelse med disse mikrogeler. Tidligere arbejde har vist vedvarende frigivelse af disse bioaktive faktorer op til ~ 30 dage in vitro. Imidlertid kan andre relevante terapier, såsom nanopartikler, RNA-interfererende (RNAi) molekyler, andre biologiske lægemidler eller småmolekylelægemidler, også undersøges for at kvantificere deres frigivelseshastighed og effektivitet, når de anvendes med denne chitosanmikrogelteknologi. En anden variabel, der kan undersøges i fremtiden, er at ændre mikrogelernes størrelsesområde, hvilket gøres ved blot at ændre maskestørrelsen på sprøjtefilteret. Dette kan også have en betydelig indvirkning på frigivelseshastigheden af terapi fra mikrogelerne, hvilket giver mulighed for bekvem kontrol over frigivelseskinetik uden at ændre kemien ved tværbinding. Derudover kan denne protokol let skaleres op ved hjælp af større sprøjter og filtre eller vakuumfiltreringsteknikker til fremstilling af store mængder chitosanmikrogeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases fra National Institute of Health under tildelingsnumre R03AR068087 og R21AR071585 og af Boettcher Foundation (# 11219) til MDK. CBE blev støttet af NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
  2. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
  3. Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
  4. Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
  5. Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
  6. Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).
  7. Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
  8. Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
  9. Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
  10. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  11. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
  12. Kim, P. -H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
  13. Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
  14. Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
  15. Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
  16. Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
  17. Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
  18. Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
  19. Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
  20. Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
  21. Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
  22. Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
  23. Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
  24. Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
  25. Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
  26. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
  27. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
  28. Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
  29. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
  30. Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
  31. Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
  32. Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
  33. Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
  34. Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
  35. Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
  36. Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
  37. Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
  38. Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
  39. Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
  40. Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).

Tags

Bioengineering udgave 182
Fremstilling af størrelsesstyrede og emulsionsfrie chitosan-genipinmikrogeler til vævstekniske applikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stager, M. A., Erickson, C. B.,More

Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter