Summary
본 프로토콜은 키토산-제니핀 마이크로겔의 제조를 위한 비에멀젼 기반 방법을 기술한다. 이러한 마이크로겔의 크기는 정밀하게 조절할 수 있으며, pH 의존적 팽윤을 표시하고, 생체내에서 분해되며, 시간이 지남에 따라 지속적으로 방출되는 치료 분자로 로딩될 수 있어 조직 공학 응용에 매우 적합합니다.
Abstract
키토산 마이크로젤은 광범위한 응용, 저비용 및 면역원성으로 인해 조직 공학에 상당한 관심을 받고 있습니다. 그러나 키토산 마이크로 젤은 일반적으로 독성이 강하고 환경에 해로운 유기 용매 헹굼이 필요한 에멀젼 방법을 사용하여 제조됩니다. 본 프로토콜은 유기 용매 린스없이 키토산-제니핀 마이크로겔을 제조하기 위한 신속하고, 세포독성이 없는, 비에멀젼-기반 방법을 제시한다. 본원에 기재된 마이크로겔은 정밀한 크기 조절을 통해 제조될 수 있다. 그들은 생체 분자의 지속적인 방출을 나타내므로 조직 공학, 생체 재료 및 재생 의학과 매우 관련이 있습니다. 키토산은 제니핀과 가교되어 하이드로겔 네트워크를 형성하고, 이어서 주사기 필터를 통과시켜 마이크로겔을 생성한다. 마이크로겔은 여과되어 다양한 크기를 만들 수 있으며, pH 의존적 팽윤을 나타내며 시간이 지남에 따라 효소적으로 분해됩니다. 이들 마이크로겔은 래트 성장 플레이트 손상 모델에 사용되었으며, 증가된 연골 조직 수복을 촉진하고 생체내에서 28일째에 완전한 분해를 나타내는 것으로 입증되었다. 저렴한 비용, 높은 편의성 및 세포 적합성 재료로 쉽게 제조 할 수 있기 때문에이 키토산 마이크로 젤은 조직 공학에서 흥미롭고 독특한 기술을 제시합니다.
Introduction
physis라고도 알려진 성장 판은 어린이의 성장을 매개하는 긴 뼈의 끝에 위치한 연골 구조입니다. 성장 플레이트가 손상되면 "뼈 막대"로 알려진 복구 조직이 형성 될 수 있으며, 이는 정상적인 성장을 방해하고 성장 결함이나 각형 기형을 유발할 수 있습니다. 역학 자료에 따르면 모든 어린 시절의 골격 손상의 15 % -30 %가 성장판과 관련이 있습니다. 보니 바 형성은 이러한 부상의 최대 30 %에서 발생하며, 성장 판 손상 및 관련 치료를 중요한 임상 징후 문제 1,2,3,4로 만듭니다. 뼈 막대 형성이 발생할 때, 가장 일반적인 치료 방법은 뼈 막대를 절제하고 실리콘 또는 지방 조직과 같은 삽입 물질을 삽입하는 것을 포함한다5. 그러나, 뼈 바 절제술 수술을 받는 환자들은 현재 부상당한 성장판6,7,8을 완전히 복구할 수 있는 치료법이 없기 때문에 완전한 회복을 위한 예후가 좋지 않은 경우가 많다. 이러한 단점에 비추어 볼 때, 뼈 막대의 형성을 방지하고 건강한 피씰 연골 조직을 재생시키는 데 모두 성장 판 부상을 치료하기위한 효과적인 전략이 절실히 필요합니다.
하이드로겔 마이크로입자, 또는 마이크로겔은 최근 치료제9의 지속적인 방출을 제공할 수 있는 주사용 스캐폴드로서 주목을 받고 있다. 높은 튜닝 가능성과 생체 적합성으로 인해 마이크로 젤은 생리 활성 인자 또는 세포 캡슐화에도 적합합니다. 마이크로겔은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 합성 중합체에서부터 알지네이트 또는 키토산10,11,12와 같은 천연 중합체에 이르기까지 다양한 물질로 제조될 수 있다. 키토산은 그람 음성 박테리아의 외막을 불안정하게 하는 능력과 같은 조직 공학에 몇 가지 유익한 효과가 있는 것으로 밝혀져 있으며, 이로써 내재된 항균 활성1 3,14를 제공한다. 추가적으로, 키토산은 비용 효율적이고, 세포-상호작용적이며, 아민 함유 구조를 사용하여 쉽게 변형된다. 키토산 기반 마이크로젤은 박테리아 감염을 예방하면서 조직 재생을 촉진할 수 있는 약물 전달 및 물질 신호전달을 위한 생체재료 전략을 약속합니다. 그러나, 키토산 마이크로겔은 종종 특별한 장비, 에멀젼 기술, 또는 세포독성 용매 헹굼을 필요로 하는 광범위한 기술로 제조된다. 예를 들어, 일부 연구는 에멀젼 기반 방법으로 키토산 마이크로 젤을 제조했지만, 이러한 프로토콜은 용매 헹굼과 세포독성 가교제를 필요로하므로 잠재적으로 임상 설정15,16으로의 번역을 부정 할 수 있습니다. 다른 연구에서는 특수 장비, 준비 및 훈련이 필요한 키토산 마이크로 젤을 제조하기 위해 마이크로 유체 공학 또는 전기 분무 접근법을 사용했습니다17,18. 키토산 마이크로겔은 또한 일반적으로 키토산 용액으로 가교결합제를 적하 처리하여 제조된다; 그러나, 이 방법은 용액 점도, 중합체 농도 및 유량에 크게 의존하여, 마이크로겔(19,20)의 크기 및 분산도를 제어하기 어렵게 만든다. 반대로, 본원에 기재된 마이크로겔 제조 방법은 전문 장비 또는 용매 헹굼을 필요로 하지 않으며, 이들 마이크로겔을 거의 모든 실험실 또는 환경에서 제조를 위해 실행 가능하게 만든다. 따라서, 이들 마이크로겔은 많은 응용을 위한 신속하고, 비용 효율적이며, 생산하기 쉬운 약물 전달 비히클을 위한 고도로 관련된 생체 물질을 나타낸다.
마이크로겔의 조성과 물질 특성을 조절함으로써 연구자들은 세포 미세 환경을 정밀하게 제어하여 물질 의존적 방식으로 세포 거동을 지시 할 수 있습니다. 마이크로겔은 자체적으로 사용되거나 벌크 생체재료 시스템과 결합하여 생체활성 인자의 연장된 방출 또는 천연 또는 외인성 세포에 대한 정확한 특수 신호전달과 같은 특정 기능을 부여할 수 있다. 생체 재료 및 마이크로 젤은 성장 플레이트 부상에 대한 매력적인 치료 방법으로 부상했습니다. 성장 플레이트 부상21,22,23,24,25를 치료하기 위해 알긴산염 및 키토산 기반 생체 재료 개발에 상당한 노력을 기울여 왔습니다. 성장 판 골화 및 뼈 신장의 역동적 인 시간적 특성으로 인해, 뼈 막대 형성의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 따라서, 쥐, 토끼 및 양 26,27,28에서와 같은 내연골 골화 및 뼈 바 형성의 메카니즘을 더 잘 해명하기 위해 몇몇 동물 모델이 개발되었다. 하나의 그러한 모델은 래트 성장 플레이트 손상 모델이며, 이는 래트 경골의 드릴 홀 결함을 사용하여 예측 가능하고 재현 가능한 방식으로 뼈 바를 생성하고 성장 플레이트29,30의 세 구역 모두에 걸쳐 인간 부상을 모방한다. 성장 플레이트 부상을 치료하기위한 몇 가지 생체 재료 기반 전략이이 모델을 사용하여 테스트되었습니다. 추가적으로, 키토산 마이크로겔을 제조하기 위한 두 가지 상이한 방법이 개발되었으며, 이는 지속적인 방식으로 치료제를 방출하는 주사 가능한 생체 재료 시스템으로서 사용될 수 있다10,31. 이들 마이크로겔은 래트 피씰 손상 모델에 사용되었으며, SDF-1a 및 TGF-b3을 방출할 때 개선된 연골 재생(31)을 보였다. 이 프로토콜에 제공된 기술은 이러한 키토산 마이크로겔을 제조하기 위해 개발된 방법을 기술하며, 이는 매우 다양한 조직 공학 응용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 최근의 연구들은 조절된 종양학적 약물 전달 응용을 위해 열- 또는 마젠토-반응성 키토산 마이크로겔을 사용하였다(32,33).
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Protocol
모든 동물 절차는 콜로라도 덴버 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 6주령의 수컷 Sprague-Dawley 래트를 본 연구에 사용하였다. 래트 성장 플레이트 손상 모델은 이전에 공개된 보고서(30)에 따라 작성되었다.
1. 키토산 고분자의 제조
- 정제되고 동결건조된 저분자량(LMW) 키토산을 시판되는 공급원으로부터 수득한다( 표 참조).
- 이중 증류수 495 mL(ddH2O)를 첨가하고 1 L 비이커에 교반 막대를 가한다. 키토산 5g을 첨가하고 (단계 1.1.) 잘 섞는다.
참고: 키토산은 생리적 pH에서 수용액에만 난용성이므로 키토산은 이 단계에서 쉽게 용해되지 않습니다. - 상기 제조된 키토산 용액에 빙초산 5 mL를 첨가한다.
- 50°C에서 유지되는 수조에서 설정된 비이커로 18시간 동안 300 rpm으로 덮고 저어준다.
- Büchner 플라스크 및 깔때기를 사용하여, 여과지의 크기 감소를 통해 키토산 용액을 여과한다: 22 μm, 8 μm, 및 2.7 μm ( 표 참조).
- 여과된 키토산 용액을 셀룰로스 투석 튜빙(표 자료 참조)에 첨가하고, 실온에서 4일 동안 ddH2O로 투석되도록 하고, 매일 ddH2O를 변화시킨다.
참고: 마지막 변경에는 초순수 ddH2O 물을 사용하십시오. - 투석된 키토산 용액을 비이커로 옮기고 1 M NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정한다.
- 키토산을 분취하여 원심분리 튜브에 넣고 실온에서 5분 동안 4000 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 폐기물 스트림으로 데칸트하고, 키토산을 ddH2O에 재현탁시키고,2x를반복한다.
- 동결시킨 다음 키토산 펠렛을 동결건조한다.
- 매일 동결 건조 된 제품을 제거하고 질량을 기록하십시오.
참고: 동결건조된 생성물의 질량이 더 이상 변하지 않을 때, 생성물은 완전히 건조되고 사용 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관될 수 있다.
- 매일 동결 건조 된 제품을 제거하고 질량을 기록하십시오.
2. 키토산 하이드로젤의 제조
- 2 mL의 6% 아세트산 및 120 mg의 정제된 키토산 (단계 1)을 10 mL 루어-락 주사기에 첨가하여 6% w/v 키토산 용액을 형성하였다.
- 여성 - 암 Luer-lock 커넥터를 사용하여 Luer-lock 주사기를 다른 동일한 주사기에 연결하고 용액을 30 초 동안 또는 키토산이 아세트산에 완전히 용해 될 때까지 앞뒤로 혼합하십시오.
- 가교결합하기 전에, 임의의 치료학적 또는 생체활성제를 키토산 용액에 첨가한다(필요하다면). 본 연구를 위해, 200 ng의 SDF-1a 및 TGF-b3 ( 물질의 표 참조)을 마이크로겔에 첨가하였다.
참고: SDF-1a 및 TGF-b3은 성장 플레이트 조직 재생과 관련된 생리활성 물질입니다. SDF-1a는 중간엽 줄기세포의 결손부위로의 이동을 촉진하고, TGF-b3은 연골형성 계통31 아래로 이들 줄기세포의 분화를 유도하는 연골형성 인자 역할을 한다.
참고: 키토산을 주사기 사이에 다시 섞어 치료제를 완전히 통합시킨다. - 100% 에탄올에서 100 mM의 제니핀의 스톡 가교결합제 용액( 물질표 참조)을 준비한다.
- 제조된 제니핀 용액 100 μL를 키토산 함유 주사기에 첨가하고(단계 2.4.), 다시 30초 동안 주사기 사이를 앞뒤로 혼합한다.
- 주사기로부터 혼합물을 35 mm 페트리 디쉬 상에 압출하고, 파라핀 필름으로 덮고, 가습된 분위기에서 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
참고 : 용액은 진한 파란색으로 변하여 키토산과 제니핀 사이의 가교 반응이 발생하여 키토산 마이크로 젤이 형성되었음을 나타냅니다. - 제조된 키토산 마이크로겔을 아래의 단계에 따라 여과한다.
- 주걱을 사용하여 하이드로 젤을 작은 조각으로 부드럽게 나눕니다.
참고 : 조각은 직경이 1-2cm 인 10mL 주사기 뒤쪽으로 옮길 수있을만큼 작아야합니다. - 원하는 메쉬 크기의 필터를 깨끗한 10mL 주사기 뒷면에 넣습니다.
참고: 마이크로겔의 일반적인 크기 범위는 50-200 μm 사이입니다. - 깨진 겔 조각을 필터가 장착된 주사기로 옮기고 6mL의ddH2O를첨가한다.
참고 : 키토산 젤은 수성 배지에서 크게 팽창하므로 젤 부피의 큰 변화가 예상됩니다. - Luer-lock 커넥터를 통해 주사기를 다른 깨끗한 10mL 주사기에 연결합니다.
- 젤 + 물 혼합물을 필터로 주사기를 통해 강제 실행하여 지정된 최대 직경의 마이크로 젤을 만듭니다.
- 첫 번째 여과 후, 필터가 들어있는 주사기의 뒷면을 열고 혼합물을 다시이 주사기로 밀어 넣습니다.
- 주사기의 뒷면을 교체하고 혼합물을 필터를 통해 다시 밀어 넣으십시오.
- 여과를 5-6x 반복하거나 필터를 통한 저항이 거의 없을 때까지 반복하십시오.
- 주걱을 사용하여 하이드로 젤을 작은 조각으로 부드럽게 나눕니다.
- 여과된 마이크로겔을 헹구고 정제한다.
- 여과된 겔 혼합물을 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, ddH2O로 총 부피를20mL까지 가져오고, 이어서 혼합물을 와류시켜 균질한 분산을 보장한다.
- 마이크로겔을 실온에서 5분 동안 100 x g 에서 원심분리하고, 상부 수성상을 데칸트한다.
- 마이크로겔을 70% 에탄올 10 mL에 재현탁시키고, 와류하고, UV 광 하에 1 h 동안 두어 멸균시킨다.
- 마이크로겔을 실온에서 5분 동안 1,000 x g에서 원심분리하고, 에탄올을 버리고, ddH2O로 3x 헹구었다.
3. 시험관 내 또는 생체내 응용을 위한 마이크로겔의 제조
참고: 본 연구를 위해, 성장 플레이트 손상에서의 연골 재생은 래트 모델에서 연구되었다. 자세한 내용은31 참조.
- 마이크로겔 펠릿을 ddH2O에 1:1로 재현탁시켜 마이크로겔은 4°C에서ddH2O에 현탁하여 최대 1개월동안 저장할 수 있다. 생체 활성제가 사용되는 경우, 마이크로겔은 즉시 사용되어야 한다.
- 이전에 공개된 보고서(30)에 따라 동물에 부상 부위를 생성한다.
- 손상 부위를 식염수로 플러시하고 동물을 처리하지 않은 상태로 유지하거나(대조 연구를 위해) 키토산 마이크로겔만 주입하거나 생체활성제가 로딩된 마이크로겔을 주입한다(단계 3.2.).
- 동물의 상처를 닫고 수술 후 진통제(30)를 투여한다.
- 수술 후 7일 또는 28일에,CO2 과다 복용에 의해 래트를 안락사시키고, 사지를 절제하고, 손상 부위(31)에서 조직 수복을 평가하기 위해 조직학을 수행한다.
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Representative Results
키토산 마이크로젤의 성공적인 제조는 제니핀과 키토산 사이의 가교 반응에 의존하며, 특히 키토산 중합체 사슬 상의 아민을 수반한다. 다른 마이크로겔 제조 기술과는 달리, 이 방법은 에멀젼 또는 용매 헹굼을 필요로 하지 않으며, 값싼 장비로 빠르고 쉽게 실시할 수 있다. 성공적인 마이크로겔 제조를 위한 특징적인 지표는 키토산과 제니핀이 혼합된 후 회백색에서 진한 파란색으로 뚜렷한 색상 변화입니다. 제니핀과 아민 함유 화합물, 예컨대 키토산 또는 다른 단백질 사이의 가교 반응은 문헌34에서 잘 특성화되었다. 요컨대, 가교 메카니즘은 키토산의 아미노기에 의한 친핵성 공격으로 간주되며, 여기서 제니핀은 안정한 축합 생성물(35)을 갖는 디알데히드로서 작용한다. 안정하고 응축된 제니핀의 짧은 사슬은 키토산 중합체 사이의 가교 교량으로서 작용한다. 가교 반응은 용액이 진한 파란색으로 변하게 하는데, 이는 산소 라디칼 유도된 중합 및 중간체 화합물의 탈수소화로 인해 발생하며, 이는 친핵성 공격(36)으로부터의 개환 반응을 따른다.
일단 마이크로겔이 여과되고 1:1 희석물 내에 재현탁되면, 이들은 다양한 생체재료 응용에 쉽게 사용될 수 있다. 최근 이러한 유제없는 키토산 마이크로젤을 사용하여 성장 플레이트 손상에서 연골 재생을 촉진하는 연구가 발표되었습니다. 마이크로겔은 본원에 기재된 바와 같이 제작되고 비어있거나 성장판 조직 재생에 관련된 생리활성제인 SDF-1a 및 TGF-b3로 비워 두거나 로딩되거나, SDF-1a는 중간엽 줄기세포의 결손부위로의 이동을 촉진하고, TGF-b3는 연골형성 계통 아래로 이들 줄기세포의 분화를 유도하는 연골형성 인자로서 작용하는TGF-b3, 38. 단백질의 방출 속도는 ELISA를 통해 시험관내에서 정량되었고, 이들 분자의 방출은 시간31에 걸쳐 지속되었다. 이어서, 마이크로겔을 생체내 래트 모델에서 손상된 성장 플레이트 내 로 주입하고, 주입된 마이크로겔은 생체내31에서 조기 보니바 형성을 방지하였다. 이러한 주사 가능하고 비용 효율적이며 생산이 간편한 키토산 마이크로젤은 많은 생체 재료 응용 분야에 쉽게 사용될 수 있습니다.
마이크로 겔 제조를 위한이 프로세스는 간단한 설정 및 응용 프로그램에 최적화되었지만 연구자가 염두에 두어야하는 몇 가지 문제가 여전히 발생할 수 있습니다. 중합체와 가교 성분의 불충분한 혼합은 제조 동안 상이한 결과에 대한 가장 가능성 있는 원인이다. 고체 키토산은 주사기 사이에 격렬하게 혼합되어야하며, 생성 된 키토산 용액은 제니핀 가교제가 첨가되기 전에 완전히 균질해야합니다. 용액이 균질하지 않으면 용액 중에 남아있는 고체 키토산 덩어리가 덩어리를 형성하고 고르지 않은 가교가 발생하여 효과적인 여과를 방지하고 직경이 상당히 다양한 폴리 분산 마이크로 젤을 생성합니다. 제조 중에 고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 파라핀 필름 또는 다른 증발 트래핑 기술로 방지되어야하는 가교 기간 동안 증발을 피하는 것입니다. 키토산 하이드로 젤이 마르면 물을 헹구는 동안 팽창하지 않으며 주사기를 통해 여과되지 않습니다. 마지막으로, 마이크로겔은 여과 공정 동안 과량의 물에 현탁되어야 하고, 사용하지 않을 때는 4°C에서 물에 저장되어야 한다. 마이크로겔은 적어도 1:1 희석물의 물에 현탁되지 않는 한 압출 또는 주사가능하지 않다.
도 1은 마이크로겔 제조 공정의 광범위한 개요를 나타낸다. 동일한 프로세스가 그림 2에 다시 묘사되어 있는데, 이 그림은 텍스트만으로는 이해하기 어려운 프로토콜 단계를 강조하면서 프로세스의 사진을 보여줍니다. 예를 들어, 도 2D는 와이어 메쉬 필터가 10 mL 주사기에 삽입되는 방법을 보여준다. 주사기 상단에 완전히 장착되면이 와이어 메쉬 필터는 전문 장비 나 용제없이 키토산 마이크로 젤을 빠르고 편리하게 여과 할 수 있습니다. 유사하게, 도 2E는 마이크로겔 제조를 위한 기초인 메쉬 필터를 통한 수화된 키토산 겔의 유동을 보여준다. 도 3은 이들 마이크로겔에 대한 우리의 이전 간행물로부터 적응되었고, 그들의 pH 의존적 팽윤 거동 및 메쉬 필터의 기공 크기에 의존하는 마이크로겔의 크기의 차이를 보여준다. 다양한 메쉬 크기는 제조업체에서 주문할 수 있으므로 마이크로 젤의 크기를 편리하게 제어 할 수 있습니다. 마이크로겔 크기에 대한 이러한 정밀한 제어는 잘 정의된 치료 부하 방출 속도로 약물 전달 시스템을 설계할 때 매우 중요합니다. 마이크로겔에 대한 이전의 연구는 또한 2-4주31에서 리소자임이 존재할 때 유의하게 분해된다는 것을 보여주었다. 마지막으로, 도 4는 SDF-1a 및 TGF-b3으로 로딩된 키토산 마이크로겔로 처리된 래트 성장 플레이트 손상 모델에서의 조직학 이미지(31)를 도시한다.
그림 1: 키토산 마이크로겔 제조의 개략적인 개요. 그림은 biorender.com 를 사용하여 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 마이크로겔 제조 공정의 사진. (A) 루어 락을 사용하여 연결된 주사기 중의 키토산 용액. (B) 키토산 겔을 35mm 페트리 접시에 압출. (c) 가교 후 키토산 겔의 회수 색상이 회백색에서 진한 파란색으로 변함. (d) 주사기의 노즐에 끼워진 와이어 메쉬 체를 보여주는 주사기 내부의 하향식도. (e) 키토산 겔을 메쉬 필터를 통해 압착하여 마이크로겔을 제조한다. (f) 마이크로겔을 원뿔형 튜브 내에 ddH2O의 1:1 희석액으로 저장하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 마이크로겔의 pH 의존적 팽윤 거동. (A) pH 변화에 반응한 마이크로겔의 팽윤 거동을 나타내는 페레트 직경의 정규 분포 그래프. (b) 200호 메쉬(상부 이미지: <75 μm 크기의 마이크로겔) 및 100호 메쉬(하부 이미지: 75-150 μm 크기의 마이크로겔)를 사용하여 제작된 마이크로젤의 형광 이미지. 도면은 참조(31)로부터의 허가를 받아 재인쇄된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: SDF-1a 및 TGF-b3이 로딩된 키토산 마이크로겔로 처리된 래트 성장 플레이트 손상 모델에서의 조직학 이미지. 무손상 (A) 및 (E), 미처리 (B) 및 (F), 마이크로겔 처리 (C) 및 (G), 마이크로겔 + SDF-1a 처리 (D) 및 (H), 및 마이크로겔 + TGF-b3 처리 (I ) 팔다리. 7일째 동물을 마이크로겔 + TGFb3으로 처리하였다. 알시안 블루 헤마톡실린(ABH)은 뼈를 오렌지색으로 염색하여 적색, 섬유성 조직을 분홍색, 및 연골 블루로 염색하였다. 마이크로겔은 진한 적색 섬유질 유사 조직으로 나타난다. 스케일 바 = 500 μm. 도면은 참조(31)로부터의 허가를 받아 재인쇄된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마이크로겔은 약물 전달 또는 세포 캡슐화9와 같은 다양한 목적을 위한 높은 수준의 적용성으로 인해 최근 몇 년 동안 널리 연구되고 있다. 마이크로 스케일 생체 재료 구축물의 제조 용이성은 연구자가 특정 크기와 시간 규모로 하이드로 겔 기반 전략을 개발할 수 있기 때문에 조직 공학에서 중요한 관련이 있습니다. 그러나 키토산 마이크로 젤을 제조하는 대부분의 방법은 값 비싼 장비와 시약, 유제 또는 세포 독성 용매 헹굼이 필요하므로 임상 용도로의 번역을 방해합니다 15,16,17,18,19,20. 이 마이크로 젤은 에멀젼 기술이나 용매 헹굼이 필요하지 않은 제조 편의성 측면에서 탁월합니다. 추가적으로, 이들 마이크로겔은 pH 의존성 팽윤 및 약물 로딩, 튜닝된 분해 거동, 및 치료제의 지속 방출과 같은 조직-조작된 구축물에 이상적인 특성을 보유한다.
이러한 키토산 마이크로젤을 제조하는 데 있어 가장 중요한 단계는 주사기 사이의 여과입니다. 이 마이크로겔은 벌크 하이드로젤로 시작하여 와이어 메쉬 필터를 사용하여 특정 크기 범위로 여과됩니다. 필터링이 없으면 마이크로겔의 적용 가능성, 기계적 특성 및 약물 방출 특성이 크게 다를 수 있습니다. 여과 단계는 하이드로젤의 크기에 대한 정밀한 제어를 허용하며, 또한 pH 의존적 팽윤 및 치료제의 지속 방출을 나타내는 마이크로겔의 높은 처리량 제조를 허용한다.
이 공정의 한계는 여과 단계가 완벽하게 구형 형상의 하이드로젤로 이어지지 않았다는 것이며, 이는 일부 적용에서 고려해야 할 중요한 요소가 될 수 있습니다. 이러한 이유로, 마이크로겔의 특징적인 크기는 Feret 직경(도 3)을 사용하여 기술되었으며, 이는 불규칙한 형상의 입자(39)를 정량화하는데 유용하다. 마이크로겔의 기하학적 구조가 완벽한 구체는 아니었지만, 입자의 평균 크기는 시린지 필터의 메쉬 크기에 따라 제어하기 쉬웠으며, 많은 용도에서 완벽하게 구형 입자를 갖는 것은 필요하지 않다. 마이크로겔의 다분산 지수 (PDI)는 큰 입자 집단으로부터 수득된 평균 페레트 직경에 대한 페레 직경의 표준 편차의 정방비 (n=74)를 사용하여 정량화하였다. PDI는 방정식을 사용하여 0.076으로 계산되었다.
PDI = (s/D)2
여기서 s는 평균 페레트 직경의 표준 편차이고 D는 평균 페레트 직경40입니다. 이 과정에서 수행 된 필터링과 불규칙한 모양의 입자에 대한 Feret 직경의 사용으로 인해이 입자의 다분산 지수는 단분산으로 간주 될 수있는 정도까지 상당히 낮았습니다.
미래의 연구를 위해, 주어진 연구 요구에 더 잘 맞도록 이 프로토콜에 대한 몇 가지 수정이 이루어질 수 있다. 예를 들어, SDF1-a 및 TGF-b3의 두 단백질 만이 이러한 마이크로겔을 사용한 조절 방출에 대해 연구되었습니다. 이전의 연구는 시험관 내에서 ~ 30 일까지 이러한 생리 활성 인자의 지속적인 방출을 보여주었습니다. 그러나 나노 입자, RNA 간섭 (RNAi) 분자, 다른 생물학적 제제 또는 소분자 약물과 같은 다른 관련 치료제도이 키토산 마이크로 겔 기술과 함께 적용될 때 방출 속도와 효능을 정량화하기 위해 탐구 될 수 있습니다. 미래에 조사 될 수있는 또 다른 변수는 마이크로 젤의 크기 범위를 변경하는 것인데, 이는 주사기 필터의 메쉬 크기를 변경함으로써 간단히 수행됩니다. 이것은 또한 마이크로겔로부터의 치료제의 방출 속도에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 가교결합의 화학을 변경하지 않고 방출 동역학을 편리하게 제어할 수 있게 한다. 또한, 이 프로토콜은 다량의 키토산 마이크로젤을 생산하기 위해 더 큰 주사기 및 필터 또는 진공 여과 기술을 사용하여 쉽게 확장할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 간행물에보고 된 연구는 국립 보건원 (National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소가 수상 번호 R03AR068087 및 R21AR071585와 Boettcher Foundation (#11219)이 MDK에 지원했습니다. CBE는 NIH / NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | SigmaAldrich | AX0073 | |
| BD Luer-Lock Syringe | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| Büchner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | 100 mm diameter |
| Chitosan (low molecular weight) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylation |
| Dialysis Membrane Tubing | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
| Ethanol | SigmaAldrich | 493538 | |
| Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
| Heracell 150i Incubator | ThermoFisher | 50116047 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Recombinant human SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
| Recombinant human TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
| Whatman Filter Paper Grade 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm pore size |
| Whatman Filter Paper Grade 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm pore size |
| Whatman Filter paper Grade 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2.7 mm pore size |
| Wire Mesh Sieve | McMaster-Carr | 9317T86 | No. 100 Mesh |
References
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