Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av størrelseskontrollerte og emulsjonsfrie Chitosan-Genipin-mikrogeler for vevsteknikkapplikasjoner

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Den nåværende protokollen beskriver en ikke-emulsjonsbasert metode for fabrikasjon av chitosan-genipin mikrogeler. Størrelsen på disse mikrogelene kan kontrolleres nøyaktig, og de kan vise pH-avhengig hevelse, forringe in vivo og være lastet med terapeutiske molekyler som frigjøres over tid på en vedvarende måte, noe som gjør dem svært relevante for vevsteknikk.

Abstract

Chitosan mikrogeler er av betydelig interesse for vevsteknikk på grunn av deres brede spekter av applikasjoner, lav pris og immunogenisitet. Imidlertid fremstilles chitosanmikrogeler ofte ved hjelp av emulsjonsmetoder som krever organiske løsningsmiddelskyllinger, som er giftige og skadelige for miljøet. Den nåværende protokollen presenterer en rask, ikke-cytotoksisk, ikke-emulsjonsbasert metode for fremstilling av chitosan-genipinmikrogeler uten behov for organiske løsningsmiddelskyllinger. Mikrogelene som er beskrevet her, kan fremstilles med presis størrelseskontroll. De viser vedvarende frigjøring av biomolekyler, noe som gjør dem svært relevante for vevsteknikk, biomaterialer og regenerativ medisin. Chitosan er krysskoblet med genipin for å danne et hydrogelnettverk, og passerer deretter gjennom et sprøytefilter for å produsere mikrogelene. Mikrogelene kan filtreres for å skape en rekke størrelser, og de viser pH-avhengig hevelse og nedbrytning over tid enzymatisk. Disse mikrogelene har vært ansatt i en rottevekstplateskademodell og ble demonstrert for å fremme økt bruskvevsreparasjon og for å vise fullstendig nedbrytning ved 28 dager in vivo. På grunn av deres lave kostnader, høy bekvemmelighet og enkel fabrikasjon med cytokompatible materialer, presenterer disse chitosan mikrogelene en spennende og unik teknologi innen vevsteknikk.

Introduction

Vekstplaten, også kjent som fysen, er bruskstrukturen som ligger på slutten av lange bein som formidler vekst hos barn. Hvis vekstplaten blir skadet, kan reparasjonsvev kjent som en "benaktig bar" dannes, noe som avbryter normal vekst og kan forårsake vekstfeil eller vinkeldeformiteter. Epidemiologiske data har vist at 15% -30% av alle barndoms skjelettskader er relatert til vekstplaten. Benete bardannelse forekommer i opptil 30% av disse skadene, noe som gjør vekstplateskader og deres tilhørende behandling til et betydelig klinisk manifestasjonsproblem 1,2,3,4. Når benete bardannelse oppstår, innebærer den vanligste behandlingsgaten å reseksjon av benete bar og sette inn et interposisjonelt materiale, for eksempel silisium eller fettvev5. Imidlertid har pasienter som gjennomgår benete bar reseksjonskirurgi ofte en dårlig prognose for full gjenoppretting, da det for tiden ikke er noen behandling som fullt ut kan reparere en skadet vekstplate 6,7,8. I lys av disse manglene er det et kritisk behov for effektive strategier for behandling av vekstplateskader, både for å forhindre dannelse av en benaktig bar og regenerere sunt fysealt bruskvev.

Hydrogel-mikropartikler, eller mikrogeler, har nylig fått interesse som injiserbare stillaser som kan gi vedvarende frigjøring av terapeutiskestoffer 9. På grunn av deres høye tunabilitet og biokompatibilitet er mikrogeler også godt egnet for bioaktiv faktor eller celleinnkapsling. Mikrogeler kan være laget av ulike materialer, alt fra syntetiske polymerer, for eksempel polyetylenglykol (PEG), til naturlige polymerer som alginat eller chitosan 10,11,12. Chitosan har vist seg å ha flere gunstige effekter for vevsteknikk, for eksempel dens evne til å destabilisere den ytre membranen av gram-negative bakterier, og dermed tilby iboende antimikrobiell aktivitet1 3,14. I tillegg er chitosan kostnadseffektiv, celle-interaktiv og enkelt modifisert ved hjelp av sin aminholdige struktur. Chitosan-baserte mikrogeler lover en biomaterialestrategi for legemiddellevering og materialsignalering som kan fremme vevregenerering samtidig som bakteriell infeksjon forhindres. Imidlertid er chitosanmikrogeler ofte fremstilt med et bredt spekter av teknikker som krever spesialutstyr, emulsjonsteknikker eller cytotoksiske løsningsmiddelskyllinger. For eksempel har noen studier fabrikkert chitosanmikrogeler med emulsjonsbaserte metoder, men disse protokollene krever løsningsmiddelskylling og cytotoksiske krysskoblinger, noe som potensielt negerer oversettelsen til kliniske innstillinger15,16. Andre studier har brukt mikrofluidikk eller elektrospray tilnærminger for å fremstille chitosan mikrogeler, som krever spesialutstyr, forberedelse og trening17,18. Chitosan mikrogeler er også ofte laget med en dråpevis prosess med crosslinker i chitosan løsning; Denne metoden er imidlertid svært avhengig av løsningsviskositet, polymerkonsentrasjon og strømningshastighet, noe som gjør det vanskelig å kontrollere størrelsen og dispergeringen av mikrogelene19,20. Omvendt krever metoden for mikrogelproduksjon beskrevet heri ikke noe spesialutstyr eller løsningsmiddelskylling, noe som gjør disse mikrogelene levedyktige for fabrikasjon i nesten alle laboratorier eller omgivelser. Derfor representerer disse mikrogelene svært relevante biomaterialer for et raskt, kostnadseffektivt og lett å produsere legemiddelleveringskjøretøy for mange bruksområder.

Ved å modulere en mikrogels sammensetning og materielle egenskaper, kan forskere få presis kontroll over det cellulære mikromiljøet, og dermed lede celleadferd på en materialavhengig måte. Mikrogeler kan brukes på egen hånd eller kombineres med bulk biomaterialer for å gi spesifikke funksjoner, for eksempel utvidet frigjøring av bioaktive faktorer eller presis spesiell signalering for innfødte eller eksogene celler. Biomaterialer og mikrogeler har dukket opp som attraktive behandlingsveier for vekstplateskader. Betydelig innsats har vært dedikert til å utvikle alginat- og chitosanbaserte biomaterialer for å behandle vekstplateskader 21,22,23,24,25. På grunn av den dynamiske temporale naturen til vekstplate ossifikasjon og benforlengelse, er mekanismen for benaktig bardannelse ikke fullt ut forstått. Derfor er flere dyremodeller utviklet for bedre å belyse mekanismene for endokondriell ossifikasjon og benete bardannelse, som hos rotter, kaniner og sauer 26,27,28. En slik modell er en rottevekstplateskademodell, som bruker en borehullsfeil i rottetibia for å produsere en benaktig bar på en forutsigbar og reproduserbar måte og etterligner menneskelige skader på tvers av alle tre sonene i vekstplaten29,30. Flere biomaterialebaserte strategier for behandling av vekstplateskader er testet med denne modellen. I tillegg er det utviklet to forskjellige metoder for fremstilling av chitosanmikrogeler, som kan brukes som et injiserbart biomaterialesystem som frigjør terapeutiske midler på en vedvarende måte 10,31. Disse mikrogelene har vært ansatt i en rottefyseal skademodell, og de viste forbedret bruskregenerering31 når de slapp SDF-1a og TGF-b3. Teknikkene i denne protokollen beskriver metoder utviklet for å fremstille disse chitosan mikrogelene, som deretter kan brukes i et bredt spekter av vevsteknikkapplikasjoner. For eksempel har nyere studier brukt termo- eller magento-responsive chitosanmikrogeler for kontrollerte onkologiske legemiddelleveringsapplikasjoner32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee. 6 uker gamle mannlige Sprague-Dawley rotter ble brukt til den nåværende studien. Rottevekstplateskademodellen ble opprettet etter en tidligere publisert rapport30.

1. Fremstilling av chitosanpolymeren

  1. Få renset og lyofilisert lavmolekylær (LMW) chitosan fra kommersielt tilgjengelige kilder (se Materialfortegnelser).
  2. Tilsett 495 ml dobbeltdestillert vann (ddH2O) og en rørestang til et 1 L beger. Tilsett 5 g chitosan (trinn 1.1.) og bland godt.
    MERK: Chitosan er bare sparsomt løselig i en vandig løsning ved fysiologisk pH, slik at chitosan ikke vil oppløses lett på dette trinnet.
  3. Tilsett 5 ml glasial eddiksyre til den overlagde chitosanoppløsningen.
  4. Rør dekket ved 300 rpm i 18 timer med begeret satt i et vannbad holdt ved 50 °C.
  5. Bruk en Büchner-kolbe og trakt til å filtrere chitosanløsningen gjennom synkende størrelser på filterpapir: 22 μm, 8 μm og 2,7 μm (se Materialtabellen).
  6. Tilsett den filtrerte chitosanløsningen i cellulosedialyseslange (se Materialtabell) og la den dialyze i ddH2O ved romtemperatur i 4 dager, og endre ddH2O hver dag.
    MERK: Bruk ultrapure ddH2O vann til siste skift.
  7. Overfør den dialyzed chitosan-løsningen til et beger og juster pH til 8.0 ved hjelp av 1 M NaOH.
  8. Aliquot chitosan i sentrifuge rør og sentrifuge på 4000 x g i 5 min ved romtemperatur.
  9. Dekanter supernatanten til en avfallsstrøm og resuspend chitosan i ddH2O, gjentatt 2x.
  10. Frys og deretter lyofilisere chitosan pellet.
    1. Hver dag fjerner du det lyofiliserte produktet og registrerer massen.
      MERK: Når massen av det lyofiliserte produktet ikke lenger endres, tørkes produktet helt og kan oppbevares ved -20 °C til det er klart til bruk.

2. Fabrikasjon av chitosan hydrogel

  1. Tilsett 2 ml 6% eddiksyre og 120 mg renset chitosan (trinn 1) til en 10 ml Luer-lock sprøyte for å danne en 6% m / v chitosanoppløsning.
  2. Koble Luer-lock sprøyten til en annen identisk sprøyte ved hjelp av en hunn-kvinnelig Luer-lock-kontakt og bland oppløsningen frem og tilbake i 30 s, eller til chitosan har fullstendig oppløst i eddiksyren.
  3. Før krysskobling, legg til terapeutisk eller bioaktivt middel til chitosanoppløsningen (om nødvendig). For den nåværende studien ble 200 ng SDF-1a og TGF-b3 (se Materialfortegnelse) lagt til mikrogelene.
    MERK: SDF-1a og TGF-b3 er bioaktive midler som er relevante for regenerering av vekstplatevev. SDF-1a fremmer migrasjon av mesenchymale stamceller til defektstedet, og TGF-b3 fungerer som en kondrogen faktor for å indusere differensiering av disse stamcellene ned den kondrogene avstamningen31.
    MERK: Bland chitosan igjen mellom sprøytene for å inkorporere det terapeutiske fullt ut.
  4. Forbered 100 mM av lager crosslinker løsning av genipin (se Tabell over materialer) i 100% etanol.
  5. Tilsett 100 μL av den tilberedte genipinoppløsningen (trinn 2.4.) i den chitosanholdige sprøyten, og bland igjen frem og tilbake mellom sprøyter i 30 s.
  6. Ekstruder blandingen fra sprøyten på en 35 mm Petri-tallerken, dekk den med parafinfilm og inkuber den ved 37 °C over natten i en fuktet atmosfære.
    MERK: Løsningen blir mørkeblå, noe som indikerer at krysskoblingsreaksjonen mellom chitosan og genipin har oppstått, noe som fører til dannelsen av chitosan microgel.
  7. Filtrer den tilberedte chitosanmikrogelen ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Bryt hydrogelen forsiktig i mindre biter ved hjelp av en slikkepott.
      MERK: Brikkene skal være små nok til å overføres til baksiden av en 10 ml sprøyte, ~ 1-2 cm i diameter.
    2. Plasser et filter med ønsket maskestørrelse på baksiden av en ren 10 ml sprøyte.
      MERK: Det typiske størrelsesområdet for mikrogeler er mellom 50-200 μm.
    3. Overfør de ødelagte gelstykkene inn i sprøyten som er utstyrt med filteret, og tilsett 6 ml ddH2O.
      MERK: Den chitosan gel vil svulme betydelig i vandig medium, så en stor endring i gelvolumet forventes.
    4. Koble sprøyten via en Luer-lock-kontakt til en annen ren 10 ml sprøyte.
    5. Tving gelen + vannblandingen gjennom sprøyten med filteret for å lage mikrogeler med en angitt maksimal diameter.
      1. Etter den første filtreringen åpner du baksiden av sprøyten som inneholder filteret, og ekstruderer blandingen tilbake i denne sprøyten.
      2. Sett på baksiden av sprøyten igjen og tving blandingen gjennom filteret igjen.
      3. Gjenta filtreringen 5-6x eller til det er liten motstand gjennom filteret.
  8. Skyll og rens de filtrerte mikrogelene.
    1. Overfør den filtrerte gelblandingen til et 50 ml konisk rør, ta det totale volumet opp til 20 ml med ddH2O, og virvel deretter blandingen for å sikre homogen dispersjon.
    2. Sentrifuger mikrogelene ved 100 x g i 5 minutter ved romtemperatur og dekanter den øvre vandige fasen.
    3. Resuspend mikrogelene i 10 ml 70% etanol, virvel og plasser under UV-lys i 1 time for å sterilisere.
    4. Sentrifuger mikrogelene ved 1000 x g i 5 minutter ved romtemperatur, kast etanolen og skyll 3x med ddH2O.

3. Tilberedning av mikrogeler for in vitro- eller in vivo-applikasjoner

MERK: For den nåværende studien ble bruskregenerering i vekstplateskader studert i en rottemodell. Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se referanse31.

  1. Resuspend mikrogelpellets 1:1 i ddH2O. Mikrogeler kan oppbevares i opptil 1 måned suspendert i ddH2O ved 4 °C. Hvis et bioaktivt middel brukes, må mikrogelene brukes umiddelbart.
  2. Opprett skadestedet i dyret etter en tidligere publisert rapport30.
  3. Skyll skadestedet med saltvann og hold dyret ubehandlet (for kontrollstudie) eller injiser kun chitosanmikrogelene eller mikrogelene som er lastet med de bioaktive midlene (trinn 3.2.).
  4. Lukk såret i dyret og administrer postkirurgiske smertestillende midler30.
  5. På dag 7 eller 28 etter operasjonen avliver du rotten ved CO2-overdose , slukker lemmer og utfører histologi for å vurdere vevsreparasjonen på skadestedet31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket fabrikasjon av chitosan mikrogeler er avhengig av krysskoblingsreaksjonen mellom genipin og chitosan, spesielt involverer aminer på chitosan polymerkjeder. I motsetning til andre mikrogel fabrikasjonsteknikker krever denne metoden ikke emulsjoner eller løsningsmiddelskylling og kan raskt og enkelt utføres med billig utstyr. En kjennetegnindikator for vellykket mikrogelproduksjon er den distinkte fargeendringen fra off-white til mørkeblå etter at chitosan og genipin har blitt blandet. Den krysskoblede reaksjonen mellom genipin og aminholdige forbindelser, som chitosan eller andre proteiner, har vært godt karakterisert i litteraturen34. Kort sagt, krysskoblingsmekanismen anses å være et nukleofilt angrep av aminogruppene av chitosan, der genipin fungerer som en dialdehyd med stabile kondensprodukter35. De korte kjedene av stabil, kondensert genipin fungerer som krysskoblingsbroer mellom chitosanpolymerene. Krysskoblingsreaksjonen får løsningen til å bli mørk blå, sannsynligvis på grunn av oksygenradikalert polymerisering og dehydrogenering av mellomforbindelser, som følger ringåpningsreaksjonen fra nukleofilt angrep36.

Når mikrogelene er filtrert og resuspendert i en 1:1 vannfortynning, kan de lett brukes i ulike biomaterialer. Det har nylig blitt publisert arbeid ved hjelp av disse emulsjonsfrie chitosanmikrogelene for å fremme bruskregenerering i vekstplateskader. Mikrogelene ble fremstilt som beskrevet heri og enten holdt tomme eller lastet med SDF-1a og TGF-b3, som er bioaktive midler som er relevante i vekstplatevevregenerering, med SDF-1a som fremmer migrering av mesenchymale stamceller til defektstedet og TGF-b3 som tjener som en kondrogen faktor for å indusere differensiering av disse stamcellene nedover kondrogene linje37 38. Utslippsraten for proteinene ble kvantifisert in vitro via ELISA, og utgivelsen av disse molekylene ble opprettholdt over tid31. Deretter ble mikrogelene injisert i en vekstplateskade i en in vivo rottemodell, og de injiserte mikrogelene forhindret tidlig benaktig bardannelse i vivo31. Disse injiserbare, kostnadseffektive og enkle å produsere chitosan-mikrogelene kan enkelt brukes i mange biomaterialer.

Selv om denne prosessen for mikrogelproduksjon er optimalisert for enkelt oppsett og applikasjoner, kan det fortsatt oppstå flere problemer som forskere bør være oppmerksomme på. Utilstrekkelig blanding av polymer- og krysskoblingskomponentene er den mest sannsynlige årsaken til forskjellige resultater under fabrikasjon. Den faste chitosan må blandes kraftig mellom sprøytene, og den resulterende chitosanoppløsningen må være helt homogen før genipin crosslinker tilsetts. Hvis løsningen ikke er homogen, vil de faste chitosanbitene som gjenstår i løsningen danne klumper, og ujevn krysskobling vil oppstå, og forhindrer effektiv filtrering og resulterer i polydispergerte mikrogeler med betydelig varierende diametre. En annen viktig faktor å vurdere under fabrikasjon er å unngå fordampning i løpet av krysskoblingsperioden, som må forhindres med parafinfilm eller andre fordampningsfangstteknikker. Hvis chitosanhydrgelen tørker ut, vil den ikke svulme under vannskyllingen, og den vil ikke filtrere gjennom sprøyten. Til slutt må mikrogelene suspenderes i overflødig vann under filtreringsprosessen og lagres i vann ved 4 °C når de ikke er i bruk. Mikrogelene er ikke ekstruderbare eller injiserbare med mindre de er suspendert i minst 1:1 fortynning av vann.

Figur 1 viser en bred oversikt over mikrogelproduksjonsprosessen. Den samme prosessen er avbildet igjen i figur 2, som viser fotografier av prosessen, og understreker protokollstadiene som er vanskelige å forstå fra tekst alene. Figur 2D viser for eksempel hvordan et nettingfilter settes inn i 10 ml-sprøyten. Når dette nettfilteret er satt helt opp mot toppen av sprøyten, gir det rask og praktisk filtrering av chitosanmikrogelene uten spesialutstyr eller løsemidler. På samme måte viser figur 2E strømmen av hydrert chitosangel gjennom maskefilteret, som er grunnlaget for mikrogelproduksjon. Figur 3 ble tilpasset fra vår tidligere publikasjon om disse mikrogelene og viser deres pH-avhengige hevelsesatferd og forskjellene i størrelsen på mikrogelene som er avhengige av porestørrelsen på maskefilteret. Ulike maskestørrelser kan bestilles fra produsenten, noe som gir praktisk kontroll over mikrogelenes størrelse. Denne presise kontrollen over mikrogelstørrelse er svært viktig når du designer legemiddelleveringssystemer med veldefinerte terapeutiske belastningsutløsningshastigheter. Tidligere arbeid på mikrogeler viste også at de forringes betydelig i nærvær av lysozym ved 2-4 uker31. Til slutt viser figur 4 histologibilder31 i en rottevekstplateskademodell behandlet med chitosanmikrogelene lastet med SDF-1a og TGF-b3.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over chitosanmikrogelproduksjon. Figuren ble opprettet ved hjelp av biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fotografier av mikrogelproduksjonsprosessen. (A) Chitosan-oppløsning i sprøyter forbundet med Luer-lås. (B) Ekstrudering av chitosangel i en 35 mm Petri-tallerken. (C) Gjenfinning av chitosan gel etter krysskobling fargeendring fra off-white til mørk blå. (D) Ovenfra og ned-visning inne i sprøyten som viser trådnettsikten montert mot sprøytens dyse. (E) Chitosan gel ble presset gjennom et maskefilter for å produsere mikrogeler. (F) Mikrogeler ble lagret i en 1:1 fortynning av ddH2O i et konisk rør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: pH-avhengig hevelsesatferd i mikrogelene. (A) Normalfordelingsgraf av Feret-diameteren som viser hevelsesatferd til mikrogelene som svar på pH-endringer. (B) Fluorescerende bilder av mikrogeler fremstilt ved hjelp av No. 200 mesh (øvre bilde: <75 μm størrelse mikrogeler) og Nr. 100 mesh (nedre bilde: 75-150 μm størrelse mikrogeler). Figuren skrives ut på nytt med tillatelse fra referanse31. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Histologibilder i en rottevekstplateskademodell behandlet med chitosanmikrogelene lastet med SDF-1a og TGF-b3. 10x histologiske bilder som viser vekstplatereparasjonsvev av intakt (A) og (E), ubehandlet (B) og (F), mikrogelbehandlet (C) og (G), mikrogel + SDF-1a behandlet (D) og (H) og mikrogel + TGF-b3 behandlet (I ) lemmer. Ingen dag 7 dyr ble behandlet med microgel + TGFb3. Alcian blå hematoxylin (ABH) flekker beinet oransje til rødt, det fibrøse vevet rosa og bruskblå. Mikrogelen fremstår som et mørkrødt fibrøst-lignende vev. Skalastenger = 500 μm. Figuren skrives ut på nytt med tillatelse fra referanse31. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrogeler har blitt mye undersøkt de siste årene på grunn av deres høye anvendbarhet for ulike formål, for eksempel legemiddellevering eller celleinnkapsling9. Enkel produksjon av mikroskala biomaterialer er av betydelig relevans i vevsteknikk, da det gjør det mulig for forskere å utvikle hydrogelbaserte strategier i en bestemt størrelse og tidsskala. Imidlertid krever de fleste metoder for fremstilling av chitosanmikrogeler dyrt utstyr og reagenser, emulsjoner eller cytotoksiske løsningsmiddelskyllinger, noe som forhindrer oversettelsen til klinisk bruk 15,16,17,18,19,20. Disse mikrogelene utmerker seg når det gjelder deres betydelige bekvemmelighet av fabrikasjon, og krever ingen emulsjonsteknikker eller løsningsmiddelskylling. I tillegg beholder disse mikrogelene de ideelle egenskapene for en vevskonstruert konstruksjon, for eksempel pH-avhengig hevelse og legemiddelbelastning, innstilt nedbrytningsadferd og vedvarende frigjøring av terapeutiske stoffer.

Det mest kritiske trinnet i å fremstille disse chitosan mikrogelene er filtreringen mellom sprøyter. Disse mikrogelene starter som bulkhydrgel og filtreres til et bestemt størrelsesområde ved hjelp av nettingfiltre. Uten filtrering ville mikrogelenes anvendbarhet, mekaniske egenskaper og legemiddelfrigjøringsegenskaper være betydelig forskjellige. Filtreringstrinnet gir presis kontroll over hydrogelenes størrelse, og det gir også mulighet for høy gjennomstrømningsproduksjon av mikrogeler som viser pH-avhengig hevelse og vedvarende frigjøring av terapeutiske stoffer.

En begrensning i denne prosessen er at filtreringstrinnet ikke førte til hydrogeler med en perfekt sfærisk form, noe som kan være en viktig faktor å vurdere for noen applikasjoner. Av denne grunn ble den karakteristiske størrelsen på mikrogelene beskrevet ved hjelp av Feret diameter (figur 3), som er nyttig for kvantifisering av uregelmessig formede partikler39. Selv om mikrogelenes geometri ikke var en perfekt sfære, var den gjennomsnittlige størrelsen på partiklene lett å kontrollere basert på sprøytefilterets maskestørrelse, og for mange bruksområder er det ikke nødvendig å ha perfekt sfæriske partikler. Mikrogelenes polydispersitetsindeks (PDI) ble kvantifisert ved hjelp av kvadratforholdet mellom standardavviket for Feretdiameter og den gjennomsnittlige Feret-diameteren oppnådd fra en stor populasjon av partikler (n = 74). PDI ble beregnet som 0,076 ved hjelp av ligningen

PDI = (s/D)2

der s er standardavviket for gjennomsnittlig feretdiameter og D er gjennomsnittlig feretdiameter40. På grunn av filtreringen som ble gjort under denne prosessen og bruken av Feret-diameteren for uregelmessig formede partikler, var polydispersitetsindeksen til disse partiklene ganske lav, i den grad de kunne betraktes som monodisperse.

For fremtidig forskning kan det gjøres flere modifikasjoner i denne protokollen for å passe bedre til det gitte forskningsbehovet. For eksempel har bare to proteiner, SDF1-a og TGF-b3, blitt studert for deres kontrollerte frigjøring med disse mikrogelene. Tidligere arbeid har vist vedvarende frigjøring av disse bioaktive faktorene opptil ~ 30 dager in vitro. Imidlertid kan andre relevante terapeutiske stoffer, som nanopartikler, RNA-forstyrrende (RNAi) molekyler, andre biologer eller småmolekyler, også utforskes for å kvantifisere frigjøringshastigheten og effekten når de brukes med denne chitosan mikrogelteknologien. En annen variabel som kan undersøkes i fremtiden er å endre mikrogelenes størrelsesområde, noe som gjøres ganske enkelt ved å endre sprøytefilterets maskestørrelse. Dette kan også ha en betydelig innvirkning på frigjøringshastigheten til terapeutiske midler fra mikrogelene, noe som gir praktisk kontroll over frigjøringskinetikk uten å endre kjemien til krysskobling. I tillegg kan denne protokollen enkelt skaleres opp ved hjelp av større sprøyter og filtre eller vakuumfiltreringsteknikker for å produsere store mengder chitosanmikrogeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health under tildelingsnummer R03AR068087 og R21AR071585 og av Boettcher Foundation (#11219) til MDK. CBE ble støttet av NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid SigmaAldrich AX0073
BD Luer-Lock Syringe Fisher Scientific 14-823-16E
Büchner Funnel Fisher Scientific FB966F 100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight) SigmaAldrich 448869 75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing Fisher Scientific 08-670-5C 3500 MWCO
Ethanol SigmaAldrich 493538
Genipin SigmaAldrich G4796
Heracell 150i Incubator ThermoFisher 50116047
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Recombinant human SDF-1a Peprotech 300-28A
Recombinant human TGF-b3 Peprotech 100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540 SigmaAldrich Z241547 8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541 SigmaAldrich WHA1541055 22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542 SigmaAldrich WHA1542185 2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve McMaster-Carr 9317T86 No. 100 Mesh

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
  2. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
  3. Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
  4. Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
  5. Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
  6. Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, Suppl 1 58-66 (2018).
  7. Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
  8. Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
  9. Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
  10. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  11. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
  12. Kim, P. -H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
  13. Rabea, E. I., Badawy, M. E. -T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
  14. Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
  15. Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
  16. Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
  17. Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
  18. Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
  19. Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
  20. Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
  21. Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
  22. Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
  23. Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
  24. Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
  25. Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
  26. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
  27. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
  28. Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
  29. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
  30. Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
  31. Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
  32. Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
  33. Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
  34. Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
  35. Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
  36. Butler, M. F., Ng, Y. -F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
  37. Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
  38. Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
  39. Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
  40. Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).

Tags

Bioingeniør utgave 182
Fabrikasjon av størrelseskontrollerte og emulsjonsfrie Chitosan-Genipin-mikrogeler for vevsteknikkapplikasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stager, M. A., Erickson, C. B.,… More

Stager, M. A., Erickson, C. B., Payne, K. A., Krebs, M. D. Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (182), e63857, doi:10.3791/63857 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter