Her presenterer vi en protokoll for måling av absolutt mitokondrielt (mt)DNA-kopinummer og mtDNA-sletting heteroplasminivå i enkeltceller.
Pattedyrets mitokondrielle (mt) DNA er et lite, sirkulært, dobbeltstrenget, intra-mitokondrielt DNA-molekyl, som koder for 13 underenheter av elektrontransportkjeden. I motsetning til det diploide nukleære genomet inneholder de fleste celler mange flere kopier av mtDNA, alt fra mindre enn 100 til over 200 000 kopier, avhengig av celletype. MtDNA-kopinummer brukes i økende grad som biomarkør for en rekke aldersrelaterte degenerative tilstander og sykdommer, og dermed blir nøyaktig måling av mtDNA-kopinummeret et sentralt verktøy i både forsknings- og diagnostiske innstillinger. Mutasjoner i mtDNA, som ofte forekommer som enkeltnukleotidpolymorfismer (SNPs) eller delesjoner, kan enten eksistere i alle kopier av mtDNA i cellen (betegnet homoplasmi) eller som en blanding av muterte og WT mtDNA-kopier (kalt heteroplasmi). Heteroplasmatiske mtDNA-mutasjoner er en viktig årsak til klinisk mitokondriell patologi, enten i sjeldne sykdommer eller i et økende antall vanlige sent debuterende sykdommer som Parkinsons sykdom. Å bestemme nivået av heteroplasmi tilstede i celler er et kritisk skritt i diagnosen sjeldne mitokondrielle sykdommer og i forskning som tar sikte på å forstå vanlige senstartsforstyrrelser der mitokondrier kan spille en rolle. MtDNA-kopinummer og heteroplasmi har tradisjonelt blitt målt ved kvantitative (q) PCR-baserte analyser eller dypsekvensering. Den nylige introduksjonen av ddPCR-teknologi har imidlertid gitt en alternativ metode for å måle begge parametrene. Det gir flere fordeler i forhold til eksisterende metoder, inkludert muligheten til å måle absolutt mtDNA-kopinummer og tilstrekkelig følsomhet for å gjøre nøyaktige målinger fra enkeltceller selv ved lave kopinumre. Her presenteres en detaljert protokoll som beskriver måling av mtDNA-kopinummer i enkeltceller ved bruk av ddPCR, referert til som dråpegenerering PCR fremover, med mulighet for samtidig måling av heteroplasmi i celler med mtDNA-delesjoner. Muligheten for å utvide denne metoden for å måle heteroplasmi i celler med mtDNA SNPs diskuteres også.
Pattedyrs mitokondrielle (mt) DNA er et lite (ca. 16,5 Kb), sirkulært DNA-genom som ligger i mitokondriell matrise som koder for 37 gener, bestående av to rRNA, 22 tRNA og 13 proteinkodende gener1. I motsetning til det nukleære genomet, som inneholder en (haploid) eller to (diploide) kopier av hvert gen per celle, er mtDNA tilstede i flere kopier i mitokondriene til hver celle, alt fra titalls kopier (f.eks. Modne spermatocytter) til hundretusener av kopier (f.eks. Oocytter)2,3. En konsekvens av denne multikopi-naturen er at mutasjoner i mtDNA-genomet, som kan eksistere som enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP), delesjoner eller dupliseringer, kan være tilstede på varierende nivåer i en gitt celle, og utgjør alt fra 0% til 100% av cellens totale mtDNA-populasjon. Eksistensen av villtype og mutante mtDNA-genomer i samme celle kalles heteroplasmi, og patogene heteroplasmatiske mtDNA-mutasjoner er en viktig årsak til mitokondriell sykdom, med flere vanlige nevrologiske syndromer knyttet til underliggende heteroplasmatiske mtDNA-mutasjoner4.
To viktige parametere som bidrar til sannsynligheten for at en heteroplasmatisk mtDNA-mutasjon forårsaker klinisk sykdom er heteroplasminivået og mtDNA-kopinummeret. Mange heteroplasmatiske mutasjoner viser en terskeleffekt, med biokjemiske og kliniske fenotyper som bare blir tydelige over et visst heteroplasminivå, vanligvis rundt 80%5, og deretter forverres når heteroplasma øker ytterligere4. Det er imidlertid også viktig å vurdere antall kopier av mtDNA tilstede i cellen, da dette vil påvirke antall villtype (dvs. “sunne”) mtDNA-genomer som er tilstede på et gitt heteroplasminivå. Studier hos mitokondriesykdomspasienter har fremhevet viktigheten av dette samspillet mellom heteroplasmi og kopi nummer5,6, og Filograna og medarbeidere rapporterte nylig en økning i mtDNA-kopinummer som lindrer symptomer til tross for uendret heteroplasmi i en musemodell av mitokondriell sykdom7.
Mens mye har blitt gjort de siste årene for å forbedre forståelsen av patogenesen og overføringen av sykdommer forårsaket av mtDNA heteroplasmi, har det meste av dette arbeidet blitt utført på vevsnivå i stedet for celler, sammenligning av gjennomsnittlige vev heteroplasmy nivåer og kopi antall målinger hentet fra bulk vevsbiopsier og blodprøver. Noen veletablerte teknikker, for eksempel laserfangstmikrodisseksjon, tillater slike målinger på mobilnivå 8,9; Den nylige eksplosjonen av høykapasitets enkeltcelleanalysemetoder, eller såkalte “Single-cell Omics”10, har imidlertid skapt et krav til metoder som nøyaktig kan måle disse viktige mtDNA-parametrene på enkeltcellenivå.
Dråpegenerasjonens PCR-metode utnytter nylige fremskritt innen mikrofluidisk teknologi for å forbedre eksisterende metoder for kvantifisering av ukjente DNA-konsentrasjoner via PCR-amplifisering av spesifikke målamplikoner i prøven DNA11. I motsetning til qPCR, hvor prøve-DNA forsterkes i en enkelt reaksjon, med den relative akkumuleringshastigheten av PCR-produkt som fungerer som avlesning, deler denne metoden den første prøven i tusenvis av individuelle dråper, og derved fordeler prøve-DNA-molekylene i romlig separate reaksjoner12. Den påfølgende PCR-reaksjonen fortsetter i hver enkelt dråpe, med PCR-produktet som bare akkumuleres i dråper som inneholder mål-DNA. Resultatet av denne reaksjonen er en digital utgang i form av et basseng av dråper som enten inneholder en kopi av mål-DNA og forsterket PCR-produkt, eller ikke inneholder mål-DNA. Ved hjelp av fluorescerende DNA-sonder eller et dobbeltstrenget (ds) DNA-bindende fargestoff, kan dråpene som inneholder forsterket produkt telles, og forholdet mellom “positive” og “negative” dråper kan brukes til å beregne det absolutte antall DNA-kopier som var tilstede i den første prøven. Denne absolutte målingen, i motsetning til den relative målingen oppnådd fra en qPCR-reaksjon, er nøkkelfaktoren som gjør at denne metoden kan brukes til nøyaktig måling av mtDNA-kopinummer og heteroplasmi i enkeltceller11, og flere nyere studier har allerede benyttet dråpegenerasjons PCR-teknologi til dette formålet13,14 . Denne artikkelen presenterer en metode for måling av mtDNA-kopinummer og delesjonsheteroplasmi i enkeltceller fra både menneske- og musevev.
Protokollen beskrevet her er anvendelig over et bredt spekter av celletyper og arter i tillegg til de som er diskutert ovenfor, selv om nøye optimalisering av nye analysedesign vil være nøkkelen for å sikre at nøyaktigheten og repeterbarheten av metoden opprettholdes når du beveger deg bort fra tidligere validerte primer / sondekombinasjoner. Når du arbeider med enkeltceller, er det viktig å sikre at prøveinnsamlingen utføres så nøyaktig som mulig (f.eks. Ved bruk av strenge enkeltcelleparametere ved sorterin…
The authors have nothing to disclose.
Takk til Dr. L Bozhilova for råd om statistisk analyse av dråpegenerering PCR-data. Takk til Dr. H Zhang for å gi oocytter som brukes til å generere data i figur 3C og figur 4B. Dette arbeidet ble utført av SPB ved Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), University of Cambridge, og finansiert av et Wellcome Trust Principal Research Fellowship holdt av PFC (212219 / Z / 18 / Z).
50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
Human cybrids | University of Miami | ||
Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |