Summary
تسمح التطورات الحديثة في بروتوكولات تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان بالاشتقاق التدريجي لأنواع الخلايا الخاصة بالأعضاء. هنا ، نقدم خطوات مفصلة لصيانة وتوسيع الخلايا القاعدية للمجرى الهوائي المشتقة من iPSC وتمايزها إلى ظهارة مخاطية هدبية في ثقافات الواجهة الهوائية السائلة.
Abstract
أمراض مجرى الهواء الموصل مثل الربو والتليف الكيسي (CF) وخلل الحركة الهدبية الأولية (PCD) والتهابات الجهاز التنفسي الفيروسية هي الأسباب الرئيسية للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. كانت المنصات المخبرية التي تستخدم الخلايا الظهارية القصبية البشرية (HBECs) مفيدة لفهمنا لظهارة مجرى الهواء في الصحة والمرض. يعد الوصول إلى HBECs من الأفراد المصابين بأمراض وراثية نادرة أو طفرات نادرة عنق الزجاجة في أبحاث الرئة.
يتم إنشاء الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) بسهولة عن طريق "إعادة برمجة" الخلايا الجسدية والاحتفاظ بالخلفية الجينية الفريدة للمتبرع الفردي. تسمح التطورات الحديثة بالتمايز الموجه ل iPSCs إلى الخلايا السلفية الظهارية الرئوية ، والخلايا السنخية من النوع 2 ، وكذلك خلايا ظهارة مجرى الهواء الموصلة عبر الخلايا القاعدية ، وهي الخلايا الجذعية الرئيسية في مجرى الهواء.
نوجز هنا بروتوكولا لصيانة وتوسيع الخلايا القاعدية للمجرى الهوائي المشتقة من iPSC (المشار إليها فيما يلي باسم iBCs) بالإضافة إلى تمايز النسب الثلاثي في مزارع الواجهة الهوائية السائلة (ALI). يتم الحفاظ على iBCs وتوسيعها ككرات ظهارية معلقة في قطرات من مصفوفة خارج الخلية مستزرعة في وسط خلية قاعدية أولية مكملة بمثبطات مسارات إشارات TGF-ß و BMP. تعبر iBCs داخل هذه المجالات الظهارية عن العلامات القاعدية الرئيسية TP63 و NGFR ، ويمكن تنقيتها عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) ، وعندما يتم طلاؤها على أغشية مسامية في ظروف زراعة ALI القياسية ، يتم تمييزها إلى ظهارة مجرى هوائي وظيفي. تتكون ثقافات ALI المستمدة من متبرعين أصحاء من خلايا قاعدية وإفرازية ومتعددة الأهداب وتظهر سلامة الحاجز الظهاري والأهداب المتحركة وإفراز المخاط. تلخص الثقافات المستمدة من الأفراد المصابين بالتليف الكيسي أو PCD نقل الكلوريد المختل وظيفيا بوساطة CFTR أو الأهداب غير المتحركة ، وهي العيوب الظهارية المسببة للأمراض.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الخلايا البشرية التي يمكن تطبيقها لنمذجة وفهم أمراض مجرى الهواء.
Introduction
تمثل الأمراض الرئوية المزمنة عبئا كبيرا من المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم1. تمثل الحالات التي تؤثر على الشعب الهوائية الموصلة ، مثل الربو والتليف الكيسي (CF) وخلل الحركة الهدبي الأولي (PCD) والالتهابات الفيروسية أمراضا شائعة ونادرة ، مكتسبة ووراثية ، تساهم في هذا العبء العالمي. الوظائف الرئيسية للممرات الهوائية الموصلة هي: 1) تعمل كقناة للتدفق الرقائقي للهواء ، و 2) توفير إزالة الغشاء المخاطي الهدبي من مسببات الأمراض والحطام. تمثل الخلايا الإفرازية ومتعددة الأهداب والقاعدية أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية في مجرى الهواء الموصل. تشمل أنواع الخلايا الظهارية النادرة الخلايا الأيونية وخلايا الخصلة والخلايا العصبية الصماوية ، وقد تمت مراجعتها في مكان آخر2.
على نطاق واسع ، كان العائق الرئيسي أمام فهم آليات المرض وتطوير النهج العلاجية هو النقص المستمر في الأنسجة الأولية البشرية لاستخدامها في النماذج قبل السريرية. تعتبر HBECs عموما المعيار الذهبي في النموذج المختبري للبيولوجيا الظهارية في مجرى الهواء البشري ولعبت أدوارا رئيسية في أبحاث التليف الكيسي على وجه الخصوص3. ومع ذلك ، عادة ما يتم عزلها إما من الخزعات بالمنظار القصبي ، أو من أنسجة الرئة بعد الجراحة ، أو من الرئتين المرفوضة لأغراض الزرع. إن الحصول على HBECs من الأفراد المصابين بأمراض وراثية ، بما في ذلك الأولويات البحثية ل CF و PCD ، أمر نادر الحدوث ولا يمكن التنبؤ به. هناك حاجة إلى التغلب على عنق الزجاجة هذا للخلايا الظهارية في مجرى الهواء المشتق من المريض. يتم إنشاء iPSCs بسهولة من أي فرد ، فهي تحتفظ بالخلفية الجينية الفريدة للمتبرع ، ولديها قدرة ملحوظة على التكاثر والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في ظروف زراعة الخلايا4،5،6. من خلال تلخيص الخطوات الجنينية الرئيسية ، تخضع iPSCs "للتمايز الموجه" إلى أنواع الخلايا الخاصة بالأعضاء. لقد طورنا نحن وآخرون بروتوكولات لتوليد أسلاف الرئة المشتقة من iPSC ، والخلايا السنخية من النوع 27,8 وخلايا مجرى الهواء الموصل بما في ذلك الخلايا القاعدية في مجرى الهواء9,10,11,12.
الخلية القاعدية في مجرى الهواء هي الخلية الجذعية للمجرى الهوائي الموصل13. في عمل نشر سابقا ، قامت مجموعتنا بإنشاء خلايا ظهارية مشتقة من مجرى الهواء iPSC ، بما في ذلك مجموعة فرعية (iBCs) تعبر عن علامات الخلايا القاعدية الأساسية الأساسية بما في ذلك TP63 و KRT5 و NGFR. بعد إشارات من بيولوجيا الخلايا القاعدية البالغة ، يؤدي تثبيط مسارات SMAD المزدوجة (TGF-β و BMP) إلى زيادة تنظيم NGFR+ iBCs11,14. يتم إعادة تعليق NGFR+ iBCs كخلايا مفردة في قطرات من مصفوفة خارج الخلية ويتم زراعتها في وسط خلية قاعدية. أنها تجدد نفسها للحفاظ على السكان iBC وتشكيل كرويات ظهارية. ومع ذلك ، فإن نسبة ما تختلف أيضا إلى خلايا إفرازية بهذا التنسيق (يشار إليها باسم ثقافة 3-D). في البروتوكول التالي ، نقوم بتفصيل الخطوات اللازمة للحفاظ على هذه iBCs وتوسيعها في ثقافة 3-D ، بالإضافة إلى الخطوات المطلوبة لإنشاء ثقافة ALI المخاطية الهدبي 2-D وظيفية.
تم نشر الخطوات الأولية لبروتوكول التمايز هذا سابقا ولن تتم مراجعتها هنا11,12. ستركز هذه المخطوطة على توسيع وتنقية iBCs وتمييزها لاحقا إلى خلايا إفرازية وظيفية ومتعددة الأهداب في ثقافة ALI.
Protocol
وينبغي تنفيذ كل خطوة من الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في غطاء التدفق الرقائقي من المستوى 2 للسلامة الأحيائية. يجب تسخين جميع الوسائط إلى درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) قبل إضافتها إلى الخلايا ، إلا إذا ذكر خلاف ذلك على وجه التحديد. يجب تنفيذ كل خطوة طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة (حوالي 22 درجة مئوية). ويوجز الشكل 1 مخططات البروتوكول.
1. إعداد الوسائط المطلوبة
ملاحظة: راجع الملف التكميلي 1 للحصول على التفاصيل.
- وسط الخلايا القاعدية
- قم بإعداد الوسط الأساسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إلى كل 50 مل من الوسط الأساسي ، أضف 5 ميكرولتر من A83-01 (10 mM) ، و 5 ميكرولتر من DMH1 (10 mM) ، و 50 ميكرولتر من Y-27632 (10mM) ، و 100 ميكرولتر من Primocin (50 mg / mL). فيما يلي ، يطلق على هذه الوسائط وسط الخلايا القاعدية.
- يخزن في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
- ALI التمايز المتوسط
- قم بإعداد الوسط وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إلى كل 50 مل من وسط تمايز ALI ، أضف 100 ميكرولتر من البريموسين (50 مجم / مل).
- يخزن محميا من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
- فرز المخزن المؤقت
- لكل 50 مل من المخزن المؤقت للفرز ، اجمع بين 47.5 مل من محلول الملح المتوازن من هانكس ، و 1 مل من FBS ، و 200 ميكرولتر من EDTA (500 ملليمتر) ، و 1.25 مل من HEPES Buffer (1 M) ، و 50 ميكرولتر من Y-27632 (10 mM) ، و 100 ميكرولتر من Primocin (50 mg / mL).
- تصفية تعقيم باستخدام حجم المسام 0.4 ميكرومتر.
- يخزن في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
- وسيط الحفظ بالتبريد
- لكل 50 مل من وسط الحفظ بالتبريد ، اجمع 45 مل من وسط الخلايا القاعدية و 5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
- تصفية تعقيم باستخدام حجم المسام 0.4 ميكرومتر.
- يخزن في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
2. ذوبان iBCs المحفوظة بالتجميد
- ذوبان (على الجليد) حجم كاف من عامل النمو 3-D خفض مصفوفة خارج الخلية (فيما يلي مصفوفة 3-D). يحفظ على الثلج حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
ملاحظة: عند إذابة قارورة واحدة (تحتوي على 250000 خلية) ، قم بإذابة 100-200 ميكرولتر من مصفوفة 3-D. - قم بإذابة قارورة من المعلقات أحادية الخلية المحفوظة سابقا بالتجميد من iBCs عن طريق الحضانة في حمام ماء أو خرز 37 درجة مئوية حتى لا يكون هناك وسائط مجمدة مرئية (1-2 دقيقة).
- باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، أضف تعليق خلوي إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- أضف 6-10 مل من DMEM / F12 قطرة إلى تعليق الخلية ، واخلطها بلطف ، وقم بجهاز طرد مركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا.
- شفط supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من وسط الخلايا القاعدية مع ماصة دقيقة P1000. قم بإزالة أليكوت 10 ميكرولتر وقم بإجراء عدد الخلايا.
- الطرد المركزي للخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بشفط السوبرناتانت وإعادة تعليق الخلايا بكثافة 4000 خلية / ميكرولتر في مصفوفة ثلاثية الأبعاد مذابة سابقا باستخدام ماصة دقيقة P1000.
ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب إضافة فقاعات إلى مصفوفة 3-D. ماصة المصفوفة ببطء وبعناية. - باستخدام ماصة P200 الدقيقة ، أضف قطرة واحدة (25 أو 50 ميكرولتر) إلى قاعدة كل بئر من لوحة معالجة بزراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا. إذا بدأت ب 250000 خلية مجمدة ، فإن العدد المتوقع للقطرات في هذه الخطوة يتراوح بين 3-4 (قطرات 25 ميكرولتر) ، اعتمادا على صلاحية الخلية.
- احتضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا ، ثم أضف ما يكفي من وسط الخلايا القاعدية إلى كل بئر لغمر القطرة بالكامل (1.5 مل ل 50 ميكرولتر ؛ 1 مل ل 25 ميكرولتر) ، باستخدام ماصة مصلية 5 مل. أعد اللوحة إلى حاضنة رطبة.
- تغذية الخلايا كل 2 أيام باستخدام وسط الخلايا القاعدية الطازجة. أضف وسطا طازجا إلى جانب البئر باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج قطرة الخلايا.
ملاحظة: كثافة الخلايا المطلية في هذه المرحلة أعلى ب 10 أضعاف من المرور الروتيني ل iBCs في القسم 3.
3. تفكك الكرويات وتوسيع iBCs في ثقافة 3-D
- ذوبان (على الجليد) حجم كاف من مصفوفة 3-D. يحفظ على الثلج حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
ملاحظة: يختلف حجم مصفوفة 3-D المطلوبة على عدد الخلايا التي سيطلبها المستخدم. - بعد حوالي 5-7 أيام ، قم بشفط الوسط من كل بئر وباستخدام ماصة دقيقة P1000 ، أضف 1 مل من Dispase II (1 U / mL) مباشرة على الكرويات للانفصال عن قطرة المصفوفة.
- ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
- باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، ماصة Dispase لأعلى ولأسفل 1-2 مرات ، وتفتيت كتل كبيرة من مصفوفة 3-D. أعد اللوحة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة إضافية ، مما يسمح للمصفوفة بالذوبان تماما.
- عندما لا تكون قطرة المصفوفة ثلاثية الأبعاد مرئية تحت المجهر الضوئي ، أضف الكرويات العائمة بحرية إلى مخروطي 15 مل باستخدام طرف ماصة مصلية 5 مل. أضف DMEM/F12 للحصول على حجم نهائي قدره 10 مل لكل جهاز طرد مخروطي وطرد مركزي عند 200 × g لمدة 3 دقائق لتكوير الكرويات.
- استنشق السوبرناتانت وأضف 1 مل من التريبسين بنسبة 0.05٪ (37 درجة مئوية) لكل قطرة أولية منفصلة (على سبيل المثال ، إذا بدأت بأربع قطرات ، أضف 4 مل من التربسين إلى القارورة المخروطية).
- احتضان في 37 درجة مئوية، و trituring بشكل متكرر (كل 2-3 دقائق).
- تقييم باستخدام المجهر الضوئي كل بضع دقائق. بمجرد انفصال غالبية (>90٪) من الكرويات إلى خلايا مفردة ، أضف 10٪ مصل البقر الجنيني (في DMEM / F12) بنسبة حجم 1: 1 إلى التربسين.
- قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق.
- قم بإجراء عدد الخلايا وأعد تعليق الخلايا بالتساوي بكثافة 400 خلية / ميكرولتر من مصفوفة 3-D المذابة. تجنب إدخال فقاعات الهواء. أعد تعليق أكبر عدد ممكن من القطرات حسب الحاجة للتطبيق النهائي. كرر الخطوة 2.6-2.9 لكل بئر.
4. تقييم وتنقية NGFR+ iBCs
- بعد 10-14 يوما من أحدث مقطع ، قم بفصل الكرويات إلى تعليق خلية واحدة كما هو الحال في الخطوات 3.2-3.5 وقم بإجراء عدد الخلايا.
ملاحظة: تتصرف خطوط iPSC المختلفة بشكل مختلف. لذلك ، قد يختلف نطاق 10-14 يوما لمختلف iBCs. يرجى الرجوع إلى الشكل 2 للاطلاع على المظاهر النموذجية ل iBCs ثلاثية الأبعاد بعد 1 و 4 و 8 و 14 يوما ، عندما تكون كافية لفرز خلايا NGFR +. يؤدي الفرز في وقت أبكر من الموصى به (على سبيل المثال ، اليوم 8 كما في الشكل 2C) ، إلى انخفاض إجمالي عدد الخلايا مع تعبير NGFR أقل تكرارا. يؤدي الفرز في وقت متأخر عن الموصى به (على سبيل المثال ، بعد أكثر من 14 يوما من أحدث ممر) إلى ضعف بقاء الخلايا بعد الفرز. - أعد تعليق الخلايا بكثافة 1 × 106 خلايا/100 ميكرولتر في Sort Buffer (السكان الرئيسيون). نقل أليكوت صغير (25-50 ميكرولتر) إلى أنبوب منفصل (عدد قليل من السكان).
- أضف الأجسام المضادة المترافقة المضادة ل NGFR (تخفيف 1:100) إلى مجموعة الخلايا الرئيسية.
- أضف الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل (تخفيف 1:200) إلى مجموعة الخلايا الثانوية.
- حماية الخلايا من الضوء والحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة، بشكل متقطع (كل 5-10 دقائق) ثلاثية الخلايا لمنع الكريات.
- بعد 30 دقيقة، أضف المخزن المؤقت للفرز بنسبة 1:1 إلى كل أنبوب من الخلايا. خلايا الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق.
- قم بشفط السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا الحبيبية في Sort Buffer بكثافة 10 × 106 خلايا / مل ، وأضف بقعة خلية حية أو ميتة.
- باستخدام استراتيجية بوابات NGFR+ المناسبة (استنادا إلى التحكم في النمط المتماثل ، انظر الشكل 3) ، قم بفرز ما يكفي من خلايا NGFR+ الحية للتطبيقات الضرورية في المراحل النهائية.
ملاحظة: في حالة استخدام iBCs مع مراسلات الفلورسنت (أي NKX2-1GFP TP63 tdTomato)، يوصى بفرز الخلايا "الإيجابية الثلاثية" (أي NKX2-1GFP+، TP63 tdTomato+، NGFR+)، مع اختيار البوابة المناسبة والتعويض (الشكل 3). خلال هذا التوسع في iBCs ، تتمايز نسبة من الخلايا إلى خلايا إفرازية ويمكن أيضا اكتشاف نسبة صغيرة جدا من الخلايا متعددة الهدب. كل من هؤلاء السكان هم NGFR-.
5. جيل من الثقافات المخاطية الهدبية ALI
- قم بإعداد إدخالات غشاء مسامي 6.5 مم عن طريق إضافة مصفوفة 200 ميكرولتر إلى الغرفة القمية (مصفوفة مؤهلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو laminin-521 البشري المؤتلف) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- ضعه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل قبل الحاجة.
- استنشاق مصفوفة الطلاء من الغرفة القمية للإدراج. أضف 500 ميكرولتر من وسط الخلايا القاعدية إلى الغرفة القاعدية.
- أعد تعليق ما لا يقل عن 30000 خلية NGFR+ مفروزة (من الخطوة 4.5) في وسط الخلايا القاعدية 100-200 ميكرولتر ونقلها إلى الغرفة القمية باستخدام ماصة دقيقة P200. كرر ذلك لأكبر عدد ممكن من الآبار حسب الرغبة (والخلايا المتاحة). ضع اللوحة في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية.
- في غضون 2-3 أيام ، تستنشق الغرف القمية والقاعدية وتتغذى على وسط الخلايا القاعدية الطازج (500 ميكرولتر إلى قمي ، 100 ميكرولتر إلى القاعدي).
- راقب الغرفة القمية يوميا باستخدام المجهر الضوئي. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة >80٪ (عادة 3-7 أيام) ، استبدل وسط الخلايا القاعدية بوسط تمايز ALI (غير مسخن مسبقا) في كل من الغرف القمية والقاعدية. عند العمل مع ALI Differentiation Medium، يمكنك الحماية من الضوء عن طريق إبقاء حاويات الوسائط ملفوفة بورق القصدير وعن طريق إطفاء المصابيح العلوية عندما يكون ذلك ممكنا.
- في اليوم التالي ، استنشق الوسط من الغرفة القمية ، وبالتالي تعريض السطح القمي للهواء.
- استبدل وسائط ALI Differentiation Medium في الغرفة القاعدية كل 2-3 أيام.
- مراقبة مظهر الثقافة كل 1-2 أيام. استنشق بعناية أي سائل متراكم من الغرفة القمية ، دون إزعاج طبقة الخلية.
- تقييم المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) من أجل السلامة الظهارية.
ملاحظة: يمكن تقييم TEER في الأيام التالية للتعرض للهواء لإعطاء قراءة لسلامة الطبقة الظهارية. لم يتم تحديد الوقت المثالي لقياس TEER ، على الرغم من أن القيم المتسقة مع التمايز المخاطي الهدبي عالي الجودة عادة ما تكون >500 × سم2. - إذا كان من الضروري إزالة الحطام أو المخاط ، أضف بلطف 100 ميكرولتر PBS (بدون Ca 2+ أو Mg2+) إلى الغرفة القمي. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ومن ثم شفط بعناية PBS.
- بعد 7-10 أيام من التعرض للهواء ، تظهر الأهداب المتحركة عادة ويمكن رؤيتها باستخدام المجهر الضوئي. اعتمادا على التجربة والقراءة المخطط لها ، يمكن تحليل الخلايا بعد 14-28 يوما من التعرض للهواء.
ملاحظة: إذا تم استخدام خلايا مراسل الفلورسنت ، وإذا كان المجهر الفلوري للخلايا الحية متاحا ، فيمكن تتبع الخلايا باستخدام المجهر الضوئي بالإضافة إلى التألق المراسل.
6. اختياري (ولكن موصى به) الحفظ بالتبريد من iBCs
- بعد 10-14 يوما من أحدث ممر للزراعة ثلاثية الأبعاد ، قم بفصل الكرويات إلى تعليق أحادي الخلية كما هو الحال في الخطوات 3.2-3.5. إجراء عدد الخلايا.
- إعادة التعليق في وسط الحفظ بالتبريد بكثافة 250000 خلية / 500 ميكرولتر في التبريد.
- ضع التجميد (الكريوفيالات) في حاوية لضمان انخفاض ثابت في درجة الحرارة (1 درجة مئوية / دقيقة) ونقلها إلى -80 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة ، تليها النقل إلى -150 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: تم إجراء الحفظ بالتبريد المتكرر وكذلك الحفظ بالتبريد للخلايا التي تم فرزها سابقا من NGFR+ ، ولكن لم يتم تقييمها بشكل كاف من حيث صلاحية الخلايا والقدرة على تكوين مزارع ALI وظيفية. خاصة مع مرور الخلايا الموسعة ، يوصى بتقييم النمط النووي حيث لوحظ أن هذا يختلف في iPSCs والخلايا المشتقة من iPSC.
Representative Results
بعد هذا البروتوكول ، تم إذابة 200000 iBCs المحفوظة بالتجميد (التي تم تأكيدها سابقا على أنها تحتوي على نمط نووي طبيعي 46XY)11 وتوسيعها في ثقافة ثلاثية الأبعاد. بعد خمسة أيام ، تم فصل الكرويات الناتجة ، وعدها ، وتمريرها مرة أخرى لمزيد من التوسع. تم الحصول على ما يقرب من 480،000 خلية وإعادة تعليقها في مصفوفة 3-D (قطرات 12 × 50 ميكرولتر ، كثافة 400 خلية / ميكرولتر). تم تطبيق وسط الخلايا القاعدية الطازجة كل 2-3 أيام. وبعد عشرة أيام، انفصلت الخلايا مرة أخرى وتم عدها. تم حصاد ما مجموعه 19.7 × 106 خلايا وإعدادها ل FACS. تم تلطيخ 10 6 خلايا بالتحكم في النمط المتماثل IgG1κ المقترن ب APC وتم تلطيخ الخلايا المتبقية 18.7 × 106 بالجسم المضاد المضاد ل NGFR المقترن ب APC لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء (الشكل 3).
تم إجراء بوابة NGFR+ بعد مقارنتها بخلايا التحكم في النمط المتماثل وتم تعيينها عمدا لجمع أعلى خلايا NGFR+ تعبيرا (الشكل 3). باستخدام تقنية البوابات هذه ، كانت 28٪ من الخلايا الحية المفردة هي NGFR +. في حين كان هناك المزيد من الخلايا المتاحة ، تم جمع 750،000 خلية للزراعة في المصب. تم إعادة تعليق الخلايا المفروزة في وسط الخلايا القاعدية بتركيز 50000 خلية / 100 ميكرولتر. ثم تم زرع 50000 خلية على كل غشاء مسامي 6.5 مم ، والذي تم تغليفه باللامينين المؤتلف البشري 521 (2 ميكروغرام / 200 ميكرولتر) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تمت إضافة 500 ميكرولتر من وسط الخلايا القاعدية إلى الغرفة القاعدية لكل إدراج وتم وضع اللوحة في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية. بعد ثلاثة أيام ، تم شفط الوسائط في الغرفة القمية وكانت الخلايا تلتقي بنسبة 90٪ تقريبا بواسطة الفحص المجهري الضوئي (الشكل 4B). تم سحب وسائل الإعلام من الغرفة القاعدية. تمت إضافة وسيط التمايز ALI إلى الغرف القمية (100 ميكرولتر) والقاعدية (500 ميكرولتر). في اليوم التالي ، تم شفط وسائل الإعلام من الغرفة القمي.
على مدى الأيام ال 21 التالية ، تم تقييم الخلايا بواسطة المجهر الضوئي بشكل دوري وتغذيتها بوسط تمايز ALI الطازج (الغرفة القاعدية فقط) كل 2-3 أيام. في البداية كان من السهل التعرف على الخلايا الفردية (الشكل 4A) ، وكان لها مظهر ممدود وعلى شكل مغزل ، وشكلت طبقة أحادية معبأة بشكل فضفاض (الشكل 4B). على مدى الأيام اللاحقة إلى الأسابيع ، شكلت الخلايا طبقة ظهارية معبأة بإحكام ، خلوية للغاية ، وبعد 7-10 أيام كان هناك ظهور واضح لضرب الأهداب وإنتاج المخاط. تم حساب TEER للعينات وعلى غرار عناصر التحكم في الخلايا الأولية (تتراوح بين 700-1600 Ω × سم2)11. تم إجراء التثبيت اللاحق (اليوم 21-28) مع بارافورمالديهايد ووضع العلامات المناعية لعلامات الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأساسي ل MUC5AC والأسيتيلات α توبولين ، من بين أمور أخرى (الشكل 4C). بشكل عام ، من خلال ملاحظتنا للأهداب المتحركة ، وإنتاج المخاط ، بالإضافة إلى التلطيخ المناعي التأكيدي للخلايا متعددة الأهداب والإفرازية التي تشبه خلايا HBECs الأولية ، خلصنا إلى أننا نجحنا في توليد خلايا ظهارية في مجرى الهواء من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات.
الشكل 1: المخطط العام للبروتوكول. يتم إذابة iBCs المحفوظة بالتجميد وتوسيعها وتنقية FACS قبل الطلاء على إدخالات غشاء مسامي ، حيث تتمايز إلى ظهارة مخاطية هدبية وظيفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور تباين الطور التمثيلي. صور تباين المرحلة التمثيلية التي توضح المظهر المعتاد ل iBCs في الثقافة ثلاثية الأبعاد بعد (A) 1 يوم ، (B) 4 أيام ، (C) 8 أيام ، و (D) 14 يوما (فقط فرز ما قبل NGFR). تمثل أشرطة المقياس 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مخططات FACS التمثيلية. مخططات FACS التمثيلية لغير المراسلين ومراسلي الفلورسنت iBCs. يتم عرض أمثلة على عناصر التحكم في النمط المتماثل وتم استخدامها لتحديد أعلى خلايا NGFR+ تعبيرا. يتم "فرز خطوط iPSC المحتوية على الفلورسنت بالمراسل الثلاثي" لخلايا NKX2-1GFP + TP63tdTomato + NGFR+. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية لثقافات iBC على الأغشية المسامية. يتم عرض صور تباين الطور (A) 1 يوم و (B) بعد 3 أيام من الطلاء. وضع العلامات المناعية التمثيلية للثقافات المخاطية الهدبية المبينة في (C) ؛ أسيتيل ألفا توبولين (أخضر) و MUC5AC (أحمر). تمثل أشرطة المقياس 25 ميكرومتر، يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: جدول مكونات الوسائط. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
HBECs هي نوع الخلايا القياسي الذهبي لدراسة أمراض ظهارة مجرى الهواء. نظرا لقيودها (بما في ذلك إمكانية الوصول وصعوبة التلاعب وراثيا) ، قمنا بإنشاء بروتوكول لاشتقاق ثقافات iBCs و ALI. يمكن اشتقاق هذه الخلايا من أي متبرع والاحتفاظ بخلفيتها الجينية الفريدة ، مما يسمح بإجراء دراسات تنموية أساسية ونمذجة الأمراض والتطوير العلاجي الجديد.
في حين أن كل خطوة فردية من البروتوكول الموصوف ضرورية ، إلا أن هناك العديد منها يستحق المزيد من الذكر. أولا ، في كل خطوة تتطلب فصل الكرويات إلى خلايا واحدة ، من الأهمية بمكان تجنب السحب المفرط. الهضم الأنزيمي (مع dispase أو التربسين) يعزز بقاء الخلايا بشكل أفضل ، في حين أن السحب المفرط يؤدي إلى موت الخلايا بشكل كبير. ثانيا ، عند تنقية NGFR+ iBCs ، يعد استخدام التحكم في النمط المتماثل أمرا بالغ الأهمية ونوصي باختيار خلايا NGFR+ الأعلى تعبيرا باستخدام FACS (الشكل 3). ينتج عن هذا النهج ثقافات ALI المثلى مع التمايز المخاطي الهدبي المناسب. وأخيرا ، فإن إعداد وبذر الأغشية المسامية بدقة كما هو موثق في البروتوكول أمر أساسي لبقاء ثقافة ALI. في حين أننا عادة ما نزرع 30،000-60،000 خلية لكل إدراج ، فقد حققنا نجاحا مع عدد قليل يصل إلى 20،000 خلية. في حين يمكن إنشاء ثقافات ناجحة باستخدام طلاء المصفوفة المؤهل للخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، فقد استخدمنا مؤخرا اللامينين المؤتلف البشري 521 مع متانة أعلى بكثير من ثقافات ALI.
نادرا جدا ، قد تفشل تمايزات iPSC في تنظيم نسبة كافية من NGFR + iBCs. في هذه الحالة ، يمكن أن يؤدي المرور التسلسلي ل iBCs (في ثقافة 3-D) إلى زيادة تردد NGFR بمرور الوقت. تتضمن قيود هذا البروتوكول الوقت والتكلفة والخبرة اللازمة لإنشاء هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، ندرك أن العديد من الباحثين مهتمون بأنواع الخلايا الأقل شيوعا في ظهارة مجرى الهواء (على سبيل المثال ، الخلايا الأيونية ، الخلايا العصبية الصماوية). في حين أننا اكتشفنا بعض هذه الأنواع من الخلايا النادرة ، كما هو الحال في مزارع HBEC الأولية ، إلا أنه لم يتم تحديدها بشكل متكرر ، على الأرجح بسبب عدم اكتمال المعرفة فيما يتعلق بالإشارات التنموية المطلوبة لتوليد هذه الخلايا.
كما هو مكتوب ، يبدأ البروتوكول أعلاه بذوبان iBCs المحفوظة بالفعل بالتبريد. تم وصف التفاصيل السابقة لهذا الحفظ بالتبريد سابقا وخارج نطاق هذه المخطوطة11,12.
تسمح طريقة زراعة ALI الظهارية في مجرى الهواء بتوليد خلايا ظهارية وظيفية في مجرى الهواء من أي متبرع تقريبا. هذا يزيد بشكل كبير من إمكانية الوصول إلى الخلايا الظهارية الثمينة التي يتم التحكم فيها وراثيا والتي يمكن استخدامها لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاجات المستقبلية القائمة على الخلايا ، وكذلك لتحسين فهم النمط التنموي داخل ظهارة مجرى الهواء.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.
Acknowledgments
نشكر أعضاء مختبرات هوكينز وكوتون وديفيس على مدخلاتهم المفيدة على مر السنين فيما يتعلق بهذا المشروع وغيره. نحن مدينون أيضا لبراين تيلتون (مدير فرز الخلايا في جامعة بوسطن) لتفانيه وخبرته التقنية ، ونحن ممتنون لجريج ميلر وماريان جيمس من مركز جامعة بوسطن للطب التجديدي (CReM) لدعمهما وخبرتهما الفنية في صيانة وتوصيف iPSCs الخاصة بالمريض ، بدعم من منح المعاهد الوطنية للصحة NO1 75N92020C00005 و U01TR001810. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة U01HL148692 و U01HL134745 و U01HL134766 و R01HL095993 إلى D.N.K ، R01HL139876 إلى B.R.D ، R01 HL139799 إلى F.H. ، ومؤسسة التليف الكيسي (CFF) تمنح CFF 00987G220 و CFF WANG20GO إلى D.N.K ، CFF DAVIS15XX1 ، DAVIS17XX0 ، DAVIS19XX0 إلى B.R.D ، CFF SUZUKI19XX0 إلى S.S ، CFF BERICA2010 إلى A.B. ، و CFF HAWKIN20XX2 إلى F.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
| 3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
| A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
| Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
| DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
| Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
| Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
| PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
| Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Alysandratos, K. -D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2013).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
- Suzuki, S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells. STAR Protocols. 2 (3), 100683 (2021).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
