Summary
Jüngste Fortschritte bei humaninduzierten pluripotenten Stammzelldifferenzierungsprotokollen ermöglichen die schrittweise Ableitung organspezifischer Zelltypen. Hier stellen wir detaillierte Schritte zur Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen und deren Differenzierung zu einem mukoziliären Epithel in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen zur Verfügung.
Abstract
Erkrankungen der leitenden Atemwege wie Asthma, Mukoviszidose (CF), primäre ziliäre Dyskinesie (PCD) und virale Atemwegsinfektionen sind weltweit die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. In-vitro-Plattformen , die menschliche Bronchialepithelzellen (HBECs) verwenden, waren für unser Verständnis des Atemwegsepithels in Gesundheit und Krankheit von entscheidender Bedeutung. Der Zugang zu HBECs von Personen mit seltenen genetischen Erkrankungen oder seltenen Mutationen ist ein Engpass in der Lungenforschung.
Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) werden leicht durch "Reprogrammierung" somatischer Zellen erzeugt und behalten den einzigartigen genetischen Hintergrund des einzelnen Spenders. Jüngste Fortschritte ermöglichen die gerichtete Differenzierung von iPS-Zellen zu Lungenepithel-Vorläuferzellen, alveolären Typ-2-Zellen sowie den Zellen des leitenden Atemwegsepithels über Basalzellen, den wichtigsten Stammzellen der Atemwege.
Hier skizzieren wir ein Protokoll für die Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen (im Folgenden iBCs) sowie deren Trilineage-Differenzierung in Luft-Flüssigkeits-Interface-Kulturen (ALI). iBCs werden als Epithelkugeln aufrechterhalten und erweitert, die in Tröpfchen extrazellulärer Matrix suspendiert sind, die in einem primären Basalzellmedium kultiviert sind, das mit Inhibitoren von TGF-ß- und BMP-Signalwegen ergänzt wird. iBCs in diesen Epithelkugeln exprimieren die wichtigsten basalen Marker TP63 und NGFR, können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) gereinigt werden und differenzieren sich, wenn sie unter Standard-ALI-Kulturbedingungen auf porösen Membranen plattiert werden, zu einem funktionellen Atemwegsepithel. ALI-Kulturen, die von gesunden Spendern stammen, bestehen aus basalen, sekretorischen und vermehrten Zellen und zeigen die Integrität der Epithelbarriere, die beweglichen Zilien und die Schleimsekretion. Kulturen, die von Individuen mit CF oder PCD stammen, rekapitulieren den dysfunktionalen CFTR-vermittelten Chloridtransport oder die immotilen Zilien, die jeweiligen krankheitsverursachenden Epitheldefekte.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung menschlicher Zellen vor, das zur Modellierung und zum Verständnis von Atemwegserkrankungen eingesetzt werden kann.
Introduction
Chronische Lungenerkrankungen sind weltweit für eine hohe Belastung durch Morbidität und Mortalitätverantwortlich 1. Zustände, die die leitenden Atemwege betreffen, wie Asthma, Mukoviszidose (CF), primäre ziliäre Dyskinesie (PCD) und Virusinfektionen stellen sowohl häufige als auch seltenere Krankheiten dar, erworben und genetisch, die zu dieser weltweiten Belastung beitragen. Die Hauptfunktionen der leitenden Atemwege sind: 1) als Kanal für den laminaren Luftstrom zu fungieren und 2) mukoziliäre Clearance von Krankheitserregern und Ablagerungen zu gewährleisten. Sekretorische, vermehrte und Basalzellen stellen die wichtigsten Epithelzelltypen der leitenden Atemwege dar. Seltenere Epithelzelltypen umfassen Ionozyten, Büschelzellen und neuroendokrine Zellen und wurden an anderer Stelleüberprüft 2.
Im Großen und Ganzen war ein großes Hindernis für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Weiterentwicklung therapeutischer Ansätze ein konsequenter Mangel an menschlichem Primärgewebe für die Verwendung in präklinischen Modellen. HBECs gelten allgemein als das Goldstandard-In-vitro-Modell der Epithelbiologie der menschlichen Atemwege und haben insbesondere in der CF-Forschung eine Schlüsselrollegespielt 3. Sie werden jedoch typischerweise entweder aus bronchoskopischen Biopsien, aus Lungengewebe nach der Operation oder aus Lungen isoliert, die zu Transplantationszwecken abgestoßen wurden. Der Zugang zu HBECs von Personen mit genetischen Erkrankungen, einschließlich der Forschungsschwerpunkte CF und PCD, ist selten und unvorhersehbar. Es ist notwendig, diesen Engpass für patientenabgeleitete Atemwegsepithelzellen zu überwinden. iPS-Zellen werden leicht von jedem Individuum erzeugt, sie behalten den einzigartigen genetischen Hintergrund des Spenders und haben eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich unter Zellkulturbedingungen langfristig zu vermehren und zu überleben 4,5,6. Durch die Rekapitulation wichtiger embryologischer Schritte durchlaufen iPS-Zellen eine "gerichtete Differenzierung" in organspezifische Zelltypen. Wir und andere haben Protokolle entwickelt, um iPSC-abgeleitete Lungenvorläufer, alveoläre Typ-2-Zellen 7,8 und die Zellen der leitenden Atemwege einschließlich der Basalzellen der Atemwege9,10,11,12 zu erzeugen.
Die Basalzelle der Atemwege ist die Stammzelle der leitenden Atemwege13. In bereits veröffentlichten Arbeiten hat unsere Gruppe iPSC-abgeleitete Atemwegsepithelzellen erzeugt, einschließlich einer Untergruppe (iBCs), die kanonische Basalzellmarker einschließlich TP63, KRT5 und NGFR exprimiert. Ausgehend von der adulten Basalzellbiologie führt die Hemmung der dualen SMAD-Signalwege (TGF-β und BMP) zu einer Hochregulierung der NGFR+ iBCs11,14. NGFR+ iBCs werden als Einzelzellen in Tröpfchen extrazellulärer Matrix resuspendiert und in einem Basalzellmedium kultiviert. Sie erneuern sich selbst, um eine iBC-Population zu erhalten und epitheliale Sphäroide zu bilden; ein Anteil differenziert sich jedoch auch in sekretorische Zellen in diesem Format (sogenannte 3D-Kultur). Im folgenden Protokoll beschreiben wir die Schritte zur Pflege und Erweiterung dieser iBCs in der 3D-Kultur sowie die Schritte, die erforderlich sind, um eine funktionale 2-D-mukoziliäre ALI-Kultur zu generieren.
Die ersten Schritte dieses Differenzierungsprotokolls wurden bereits veröffentlicht und werden hier nicht überprüft11,12. Dieses Manuskript wird sich auf die Expansion und Reinigung von iBCs und deren anschließende Differenzierung in funktionelle sekretorische und vermehrte Zellen in ALI-Kultur konzentrieren.
Protocol
Jeder der folgenden Schritte sollte mit steriler Technik in einer Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt werden. Alle Medien sollten vor der Zugabe zu Zellen auf Raumtemperatur (22 °C) erwärmt werden, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben. Jeder Zentrifugationsschritt sollte bei Raumtemperatur (ca. 22 °C) durchgeführt werden. Abbildung 1 zeigt die Schaltpläne des Protokolls.
1. Vorbereitung der erforderlichen Medien
HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in der Zusatzdatei 1.
- Basalzellmedium
- Bereiten Sie das Basismedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Zu jeweils 50 ml des Basismediums fügen Sie 5 μL A83-01 (10 mM), 5 μL DMH1 (10 mM), 50 μL Y-27632 (10 mM) und 100 μL Primocin (50 mg/ml) hinzu. Im Folgenden wird dieses Medium als Basalzellmedium bezeichnet.
- Bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.
- ALI-Differenzierungsmedium
- Bereiten Sie das Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Zu jedem 50 ml ALI-Differenzierungsmedium 100 μL Primocin (50 mg/ml) hinzufügen.
- Bis zu 1 Monat lichtgeschützt bei 4 °C lagern.
- Sortierpuffer
- Kombinieren Sie pro 50 ml Sortierpuffer 47,5 ml ausgewogene Salzlösung von Hanks, 1 ml FBS, 200 μL EDTA (500 mM), 1,25 ml HEPES-Puffer (1 m), 50 μL Y-27632 (10 mM) und 100 μL Primocin (50 mg/ml).
- Filter sterilisieren mit einer Porengröße von 0,4 μm.
- Bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.
- Kryokonservierungsmedium
- Kombinieren Sie pro 50 ml Kryokonservierungsmedium 45 ml Basalzellmedium und 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Filter sterilisieren mit einer Porengröße von 0,4 μm.
- Bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern.
2. Auftauen von kryokonservierten iBCs
- Tauen Sie (auf Eis) ein ausreichendes Volumen an 3-D-Wachstumsfaktor reduzierte extrazelluläre Matrix (im Folgenden 3-D-Matrix). Auf Eis halten, bis es einsatzbereit ist.
HINWEIS: Wenn Sie eine Durchstechflasche (mit 250.000 Zellen) auftauen, tauen Sie 100-200 μL 3D-Matrix auf. - Tauen Sie eine Durchstechflasche mit zuvor kryokonservierten Einzelzellsuspensionen von iBCs auf, indem Sie in einem 37 °C warmen Wasser- oder Perlenbad inkubieren, bis kein sichtbares gefrorenes Medium mehr vorhanden ist (1-2 min).
- Fügen Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette Zellsuspension zu einem 15-ml-Konustubus hinzu.
- 6-10 ml DMEM/F12 tropfenweise in die Zellsuspension geben, vorsichtig mischen und bei 300 x g für 5 min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Basalzellmedium mit einer P1000-Mikropipette. Entfernen Sie ein 10 μL Aliquot und führen Sie eine Zellzählung durch.
- Zentrifen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 4.000 Zellen/μL in zuvor aufgetauter 3D-Matrix mit einer P1000-Mikropipette.
HINWEIS: Es ist wichtig, das Hinzufügen von Blasen zur 3D-Matrix zu vermeiden. Pipettieren Sie die Matrix langsam und vorsichtig. - Bei einer P200-Mikropipette fügen Sie einen Tröpfchen (25 oder 50 μL) zur Basis jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekultur-behandelten Platte hinzu. Wenn mit 250.000 gefrorenen Zellen begonnen wird, liegt die erwartete Anzahl der Tröpfchen in diesem Schritt zwischen 3-4 (25 μL Tröpfchen), abhängig von der Zelllebensfähigkeit.
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für ungefähr 15 Minuten und fügen Sie dann genügend Basalzellmedium zu jeder Vertiefung hinzu, um das Tröpfchen vollständig einzutauchen (1,5 ml für 50 μL; 1 ml für 25 μL), wobei eine serologische 5 ml Pipette verwendet wird. Bringen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator zurück.
- Füttern Sie die Zellen alle 2 Tage mit frischem Basalzellmedium. Fügen Sie frisches Medium an der Seite des Brunnens mit 5 ml serologischer Pipette hinzu und achten Sie darauf, das Tröpfchen der Zellen nicht zu stören.
HINWEIS: Die Dichte der in diesem Stadium plattierten Zellen ist 10-mal höher als die routinemäßige Übertragung von iBCs in Abschnitt 3.
3. Dissoziation von Sphäroiden und Expansion von iBCs in 3D-Kultur
- Tauen Sie (auf Eis) ein ausreichendes Volumen an 3D-Matrix auf. Auf Eis halten, bis es einsatzbereit ist.
HINWEIS: Das erforderliche Volumen der 3D-Matrix hängt davon ab, wie viele Zellen der Benutzer benötigt. - Etwa 5-7 Tage später das Medium aus jeder Vertiefung abpumpen und mit einer P1000-Mikropipette 1 ml Dispase II (1 U/ml) direkt auf die Sphäroide geben, um vom Tröpfchen der Matrix zu dissoziieren.
- Legen Sie die Platte für 10-15 min in den 37 °C Inkubator.
- Mit einer P1000-Mikropipette pipettieren Sie die Dispase 1-2 Mal auf und ab und brechen große Klumpen der 3D-Matrix auf. Bringen Sie die Platte für weitere 30-40 min auf 37 °C zurück, damit sich die Matrix vollständig auflösen kann.
- Wenn der Tropfen der 3D-Matrix unter dem Lichtmikroskop nicht mehr sichtbar ist, fügen Sie die frei schwebenden Sphäroide mit einer serologischen 5-ml-Pipettenspitze zu einer 15-ml-Kegelspitze hinzu. DMEM/F12 für ein Endvolumen von 10 ml pro Kegel und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min hinzufügen, um die Sphäroide zu pelletieren.
- Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin (37 °C) für jedes anfängliche dissoziierte Tröpfchen hinzu (z. B. wenn Sie mit vier Tröpfchen beginnen, fügen Sie 4 ml Trypsin in den konischen Kolben hinzu).
- Bei 37 °C inkubieren, häufig verkümmern (alle 2-3 min).
- Auswerten mit dem Lichtmikroskop alle paar Minuten. Sobald die Mehrheit (>90%) der Sphäroide zu einzelnen Zellen dissoziiert wurde, fügen Sie 10% fetales Rinderserum (in DMEM/F12) bei einem Volumenverhältnis von 1:1 zum Trypsin hinzu.
- Filtern Sie die Zellen durch ein 40 μm Zellsieb und eine Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Führen Sie eine Zellzählung durch und suspendieren Sie die Zellen gleichmäßig bei einer Dichte von 400 Zellen / μL aufgetauter 3D-Matrix. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen. Suspendieren Sie so viele Tröpfchen wie für die nachgeschaltete Anwendung erforderlich. Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.9 für jedes Well.
4. Evaluierung und Reinigung von NGFR+ iBCs
- Nach 10-14 Tagen der letzten Passage dissoziieren Sie die Sphäroide zu einer einzelnen Zellsuspension wie in den Schritten 3.2-3.5 und führen eine Zellzählung durch.
HINWEIS: Verschiedene iPSC-Linien verhalten sich unterschiedlich. Daher kann der Bereich von 10-14 Tagen für verschiedene iBCs variieren. In Abbildung 2 finden Sie typische Erscheinungsbilder von 3D-iBCs nach 1, 4, 8 und 14 Tagen, wenn sie für die NGFR+-Zellsortierung geeignet sind. Eine frühere Sortierung als empfohlen (z. B. Tag 8 wie in Abbildung 2C) führt zu einer insgesamt niedrigeren Zellzahl mit weniger häufiger NGFR-Expression. Eine spätere Sortierung als empfohlen (z. B. mehr als 14 Tage nach der letzten Passage) führt zu einem schlechten Überleben der Zellen nach der Sortierung. - Resuspendieren Sie die Zellen bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/100 μL im Sortierpuffer (Hauptpopulation). Übertragen Sie ein kleines Aliquot (25-50 μL) auf ein separates Röhrchen (kleine Population).
- Fügen Sie der Hauptzellpopulation einen konjugierten Anti-NGFR-Antikörper (1:100-Verdünnung) hinzu.
- Fügen Sie der kleinen Zellpopulation einen Antikörper zur Isotypkontrolle (1:200-Verdünnung) hinzu.
- Schützen Sie die Zellen vor Licht und halten Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, wobei Sie die Zellen intermittierend (alle 5-10 Minuten) verzerren, um eine Pelletierung zu verhindern.
- Fügen Sie nach 30 Minuten den Sortierpuffer im Verhältnis 1:1 zu jedem Zellröhrchen hinzu. Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min.
- Aspirieren Sie den Überstand, suspendieren Sie die pelletierten Zellen im Sortierpuffer mit einer Dichte von 10 x 106 Zellen / ml und fügen Sie lebende oder tote Zellflecken hinzu.
- Sortieren Sie mit der geeigneten NGFR+-Gating-Strategie (basierend auf der Isotypsteuerung, siehe Abbildung 3) genügend lebende NGFR+-Zellen für die erforderlichen nachgelagerten Anwendungen.
HINWEIS: Bei Verwendung von iBCs mit fluoreszierenden Reportern (z. B. NKX2-1 GFP TP63 tdTomato) wird empfohlen, nach "dreifach positiven" Zellen (d. h. NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+,NGFR+) mit entsprechender Gate-Auswahl und Kompensation zu sortieren (Abbildung 3). Während dieser Expansion von iBCs differenziert sich ein Teil der Zellen in sekretorische Zellen und es kann auch ein sehr geringer Anteil an vermehrten Zellen nachgewiesen werden. Beide Populationen sind NGFR-.
5. Generierung mukoziliärer ALI-Kulturen
- Bereiten Sie 6,5 mm poröse Membraneinsätze vor, indem Sie der apikalen Kammer eine 200-μL-Matrix (humane embryonale Stammzell-qualifizierte Matrix oder rekombinantes humanes Laminin-521) gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzufügen.
- Vor Bedarf mindestens 2 h bei 37 °C platzieren.
- Saugen Sie die Beschichtungsmatrix aus der apikalen Kammer des Einsatzes ab. 500 μL des Basalzellmediums in die basolaterale Kammer geben.
- Mindestens 30.000 sortierte NGFR+-Zellen (ab Schritt 4.5) in 100-200 μL Basalzellmedium resuspendieren und mit einer P200-Mikropipette in die apikale Kammer überführen. Wiederholen Sie dies für so viele Vertiefungen wie gewünscht (und Zellen verfügbar). Legen Sie die Platte in einen befeuchteten 37 °C Inkubator.
- In 2-3 Tagen aspirieren Sie apikale und basolaterale Kammern und füttern mit frischem Basalzellmedium (500 μL bis apikal, 100 μL bis basolateral).
- Überwachen Sie die apikale Kammer täglich mit Lichtmikroskopie. Wenn die Zellen zu >80% konfluent sind (typischerweise 3-7 Tage), ersetzen Sie das Basalzellmedium durch das ALI-Differenzierungsmedium (nicht vorgewärmt) sowohl in apikalen als auch in basolateralen Kammern. Wenn Sie mit ALI Differentiation Medium arbeiten, schützen Sie sich vor Licht, indem Sie Medienbehälter in Folie eingewickelt halten und die Deckenleuchten ausschalten, wenn möglich.
- Am nächsten Tag saugen Sie das Medium aus der apikalen Kammer ab und setzen so die apikale Oberfläche der Luft aus.
- Ersetzen Sie das ALI-Differenzierungsmedium alle 2-3 Tage in der basolateralen Kammer.
- Überwachen Sie das Kulturerscheinungsbild alle 1-2 Tage. Saugen Sie die angesammelte Flüssigkeit vorsichtig aus der apikalen Kammer ab, ohne die Zellschicht zu stören.
- Beurteilen Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) für die epitheliale Integrität.
HINWEIS: TEER kann in den Tagen nach der Luftexposition beurteilt werden, um die Integrität der Epithelschicht abzulesen. Der ideale Zeitpunkt für die Messung von TEER wurde nicht festgelegt, obwohl Werte, die mit einer qualitativ hochwertigen mukoziliären Differenzierung übereinstimmen, typischerweise >500 xcm 2 betragen. - Wenn es notwendig ist, Ablagerungen oder Schleim zu entfernen, fügen Sie vorsichtig 100 μL PBS (ohne Ca 2 +oder Mg 2 +) in die apikale Kammer hinzu. Bei 37 °C für 10 min inkubieren und dann PBS vorsichtig aspirieren.
- Nach 7-10 Tagen Luftexposition treten typischerweise bewegliche Zilien auf und können mit Lichtmikroskopie gesehen werden. Je nach geplantem Experiment und Auslesung können Zellen nach 14-28 Tagen Luftexposition analysiert werden.
HINWEIS: Wenn fluoreszierende Reporterzellen verwendet wurden und wenn ein Lebendzell-Fluoreszenzmikroskop verfügbar ist, können Zellen sowohl mit Lichtmikroskopie als auch mit Reporterfluoreszenz verfolgt werden.
6. Optionale (aber empfohlene) Kryokonservierung von iBCs
- Nach 10-14 Tagen der letzten 3D-Kulturpassage dissoziieren Sie die Sphäroide wie in den Schritten 3.2-3.5 zur Einzelzellsuspension. Führen Sie eine Zellzählung durch.
- Resuspend in Kryokonservierungsmedium bei einer Dichte von 250.000 Zellen/500 μL in einem Kryovitum.
- Legen Sie Kryoviale in einen Behälter, um einen stetigen Temperaturabfall (1 ° C / min) zu gewährleisten, und übertragen Sie ihn für 24-48 h auf -80 ° C, gefolgt von einem Transfer auf -150 ° C für die Langzeitlagerung.
HINWEIS: Wiederholte Kryokonservierung sowie Kryokonservierung von zuvor NGFR+ sortierten Zellen wurden durchgeführt, aber diese wurden nicht ausreichend auf Zelllebensfähigkeit und die Fähigkeit, funktionelle ALI-Kulturen zu bilden, untersucht. Insbesondere bei längerem Zellpassaging wird empfohlen, den Karyotyp zu untersuchen, da festgestellt wurde, dass dies bei iPS-Zellen und iPSC-abgeleiteten Zellen variiert.
Representative Results
Nach diesem Protokoll wurden 200.000 kryokonservierte iBCs (von denen zuvor bestätigt wurde, dass sie einen normalen 46XY-Karyotyp haben)11 aufgetaut und in 3D-Kultur expandiert. Fünf Tage später wurden die resultierenden Sphäroide dissoziiert, gezählt und zur weiteren Expansion erneut durchgelassen. Etwa 480.000 Zellen wurden gewonnen und in 3D-Matrix (12 x 50 μL Tröpfchen, Dichte 400 Zellen/μL) resuspendiert. Frisches Basalzellmedium wurde alle 2-3 Tage aufgetragen. Zehn Tage später wurden die Zellen erneut dissoziiert und gezählt. Insgesamt wurden 19,7 x 106 Zellen geerntet und für FACS vorbereitet. 106 Zellen wurden mit der APC-konjugierten IgG1κ-Isotypkontrolle und die restlichen 18,7 x 106 Zellen mit dem APC-konjugierten Anti-NGFR-Antikörper für 30 Minuten lichtgeschützt gefärbt (Abbildung 3).
NGFR+ Gating wurde nach einem Vergleich mit den Isotyp-Kontrollzellen durchgeführt und absichtlich so eingestellt, dass die höchsten exprimierenden NGFR+-Zellen gesammelt werden (Abbildung 3). Bei dieser Gating-Technik waren 28% der lebenden, einzelnen Zellen NGFR+. Während mehr Zellen verfügbar waren, wurden 750.000 Zellen für die nachgelagerte Kultur gesammelt. Sortierte Zellen wurden in Basalzellmedium in einer Konzentration von 50.000 Zellen/100 μL resuspendiert. 50.000 Zellen wurden dann auf jeden 6,5 mm porösen Membraneinsatz gesät, der gemäß den Richtlinien des Herstellers mit humanem rekombinantem Laminin-521 (2 μg/200 μL) beschichtet worden war. 500 μL Basalzellmedium wurde in die basolaterale Kammer jedes Einsatzes gegeben und die Platte wurde in einen 37 °C befeuchteten Inkubator gegeben. Drei Tage später wurden die Medien in der apikalen Kammer abgesaugt und die Zellen waren durch Lichtmikroskopie ~90% konfluent (Abbildung 4B). Die Medien aus der basolateralen Kammer wurden angeworben; ALI Differentiation Medium wurde den apikalen (100 μL) und basolateralen (500 μL) Kammern zugegeben. Am nächsten Tag wurden die Medien aus der apikalen Kammer angeworben.
In den folgenden 21 Tagen wurden die Zellen regelmäßig lichtmikroskopisch ausgewertet und alle 2-3 Tage mit frischem ALI-Differenzierungsmedium (nur Basolateralkammer) gefüttert. Einzelne Zellen waren zunächst leicht identifizierbar (Abbildung 4A), hatten ein längliches und spindelförmiges Aussehen und bildeten eine lose gepackte Monoschicht (Abbildung 4B). In den folgenden Tagen bis Wochen bildeten die Zellen eine dicht gepackte, hochzellige, epitheliale Schicht, und nach 7-10 Tagen kam es zu einer deutlichen Entstehung von Zilien und Schleimproduktion. Der TEER der Proben wurde berechnet und ähnelte den primären Zellkontrollen (Bereich von 700-1600 Ω x cm2)11. Eine anschließende Fixierung (Tag 21-28) mit Paraformaldehyd und Immunmarkierung für kanonische Epithelzellmarker der Atemwege wurde unter anderem für MUC5AC und Acetyliert-α-Tubulin durchgeführt (Abbildung 4C). Insgesamt kamen wir mit unserer Beobachtung von beweglichen Zilien, der Schleimproduktion sowie der bestätigenden Immunfärbung von vermehrten und sekretorischen Zellen, die der von primären HBECs ähnelt, zu dem Schluss, dass wir erfolgreich Atemwegsepithelzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt haben.
Abbildung 1: Gesamtschema des Protokolls. Kryokonservierte iBCs werden aufgetaut, expandiert und FACS vor der Beschichtung auf porösen Membraneinsätzen gereinigt, wo sie sich in ein funktionelles mukoziliäres Epithel differenzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Phasenkontrastbilder. Repräsentative Phasenkontrastbilder, die das übliche Erscheinungsbild von iBCs in der 3D-Kultur nach (A) 1 Tag, (B) 4 Tagen, (C) 8 Tagen und (D) 14 Tagen (nur vor NGFR-Sortierung) zeigen. Maßstabsbalken repräsentieren 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative FACS-Plots. Repräsentative FACS-Plots für Nicht-Reporter- und Fluoreszenz-Reporter-iBCs. Beispiele für Isotypkontrollen werden gezeigt und wurden verwendet, um nach den am höchsten exprimierenden NGFR+-Zellen zu selektieren. Fluoreszierende Reporter-haltige iPSC-Linien werden für NKX2-1GFP+ TP63 tdTomato + NGFR+ Zellen "dreifach sortiert". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder von iBC-Kulturen auf porösen Membranen. Phasenkontrastbilder werden (A) 1 Tag und (B) 3 Tage nach dem Plattieren gezeigt. Repräsentative Immunmarkierung von Mukoziliärkulturen gemäß (C); Acetyliert-alpha-Tubulin (grün) und MUC5AC (rot). Maßstabsbalken repräsentieren 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1: Medienkomponententabelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
HBECs sind der Goldstandard-Zelltyp zur Untersuchung von Erkrankungen des Atemwegsepithels. Aufgrund ihrer Einschränkungen (einschließlich Zugänglichkeit und Schwierigkeit der genetischen Manipulation) haben wir ein Protokoll für die Ableitung von iBCs und ALI-Kulturen erstellt. Diese Zellen können von jedem Spender abgeleitet werden und behalten ihren einzigartigen genetischen Hintergrund, wodurch grundlegende Entwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung und neuartige therapeutische Entwicklung ermöglicht werden.
Während jeder einzelne Schritt des beschriebenen Protokolls notwendig ist, gibt es einige, die zusätzliche Erwähnung verdienen. Erstens ist es bei jedem Schritt, der eine Dissoziation von Sphäroiden in einzelne Zellen erfordert, wichtig, übermäßiges Pipettieren zu vermeiden; Die enzymatische Verdauung (mit Dispase oder Trypsin) fördert ein besseres Zellüberleben, während übermäßiges Pipettieren zu einem signifikanten Zelltod führt. Zweitens ist bei der Reinigung von NGFR+ iBCs die Verwendung der Isotypkontrolle von entscheidender Bedeutung, und wir empfehlen, für die am höchsten exprimierenden NGFR+-Zellen mit FACS auszuwählen (Abbildung 3). Dieser Ansatz führt zu optimalen ALI-Kulturen mit entsprechender mukoziliärer Differenzierung. Schließlich ist die Vorbereitung und Aussaat von porösen Membranen, wie sie im Protokoll dokumentiert sind, für das Überleben der ALI-Kultur von grundlegender Bedeutung. Während wir normalerweise 30.000-60.000 Zellen pro Einsatz säen, hatten wir Erfolg mit nur 20.000 Zellen. Während mit der humanen embryonalen Stammzell-qualifizierten Matrixbeschichtung erfolgreiche Kulturen erzeugt werden können, haben wir in jüngster Zeit humanes rekombinantes Laminin-521 mit einer deutlich höheren Haltbarkeit der ALI-Kulturen verwendet.
Sehr selten können iPSC-Differenzierungen einen angemessenen Prozentsatz von NGFR+ iBCs nicht hochregulieren. In diesem Fall kann die serielle Weitergabe von iBCs (in 3D-Kultur) im Laufe der Zeit zu einer erhöhten NGFR-Frequenz führen. Zu den Einschränkungen dieses Protokolls gehören die Zeit, die Kosten und das Fachwissen, die zum Generieren dieser Zellen erforderlich sind. Darüber hinaus erkennen wir, dass viele Forscher an den weniger häufigen Zelltypen des Atemwegsepithels interessiert sind (z. B. Ionozyten, neuroendokrine Zellen). Während wir einige dieser selteneren Zelltypen wie in primären HBEC-Kulturen nachgewiesen haben, sind sie nicht reproduzierbar identifiziert, wahrscheinlich aufgrund unvollständiger Kenntnisse über die Entwicklungshinweise, die zur Erzeugung dieser Zellen erforderlich sind.
Wie es geschrieben ist, beginnt das obige Protokoll mit dem Auftauen von bereits kryokonservierten iBCs. Die Details vor dieser Kryokonservierung sind zuvor beschrieben und sprengen den Rahmen dieses Manuskripts11,12.
Unsere Atemwegsepithel-ALI-Kulturmethode ermöglicht die Bildung funktioneller Atemwegsepithelzellen aus fast jedem Spender. Dies erhöht den Zugang zu wertvollen genetisch kontrollierten Atemwegsepithelzellen, die für die Krankheitsmodellierung, das Screening von Medikamenten, zukünftige zellbasierte Therapien sowie zur Verbesserung des Verständnisses der Entwicklungsstruktur innerhalb des Atemwegsepithels verwendet werden können, erheblich.
Disclosures
Die Autoren haben keine Offenlegungen.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern der Labors Hawkins, Kotton und Davis für ihren hilfreichen Input im Laufe der Jahre zu diesem und anderen Projekten. Wir danken auch Brian Tilton (BU Cell Sorting Director) für sein Engagement und seine technische Expertise und danken Greg Miller und Marianne James vom Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) für ihre Unterstützung und ihr technisches Fachwissen bei der Wartung und Charakterisierung patientenspezifischer iPSCs, unterstützt durch NIH-Zuschüsse NO1 75N92020C00005 und U01TR001810. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die NIH-Zuschüsse U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 und R01HL095993 an D.N.K, R01HL139876 an B.R.D, R01 HL139799 an F.H. und Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Zuschüsse CFF 00987G220 und CFF WANG20GO an D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 an B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 an S.S, CFF BERICA2010 an A.B., und CFF HAWKIN20XX2 bis F.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
| 3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
| A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
| Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
| DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
| Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
| Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
| PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
| Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
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