Summary
Recente ontwikkelingen in door de mens geïnduceerde pluripotente stamceldifferentiatieprotocollen maken de stapsgewijze afleiding van orgaanspecifieke celtypen mogelijk. Hier geven we gedetailleerde stappen voor het onderhoud en de uitbreiding van iPSC-afgeleide luchtwegbasale cellen en hun differentiatie in een mucociliair epitheel in lucht-vloeistof interfaceculturen.
Abstract
Ziekten van de geleidende luchtwegen zoals astma, cystische fibrose (CF), primaire ciliaire dyskinesie (PCD) en virale luchtweginfecties zijn wereldwijd belangrijke oorzaken van morbiditeit en mortaliteit. In vitro platforms met behulp van menselijke bronchiale epitheelcellen (HBECs) zijn instrumenteel geweest voor ons begrip van het luchtwegepitheel in gezondheid en ziekte. Toegang tot HBECs van personen met zeldzame genetische ziekten of zeldzame mutaties is een knelpunt in longonderzoek.
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) worden gemakkelijk gegenereerd door somatische cellen te "herprogrammeren" en behouden de unieke genetische achtergrond van de individuele donor. Recente ontwikkelingen maken de gerichte differentiatie van iPSC's naar longepitheelvoorlopercellen, alveolaire type 2-cellen, evenals de cellen van het geleidende luchtwegepitheel via basale cellen, de belangrijkste luchtwegstamcellen, mogelijk.
Hier schetsen we een protocol voor het onderhoud en de uitbreiding van van iPSC afgeleide luchtwegbasale cellen (hierna iBC's) en hun trilineaire differentiatie in lucht-vloeistof interface (ALI) culturen. iBC's worden onderhouden en uitgebreid als epitheliale bollen gesuspendeerd in druppels van extracellulaire matrix gekweekt in een primair basaal celmedium aangevuld met remmers van TGF-ß en BMP signaalroutes. iBC's in deze epitheliale bollen drukken belangrijke basale markers TP63 en NGFR uit, kunnen worden gezuiverd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) en wanneer ze op poreuze membranen in standaard ALI-cultuuromstandigheden worden geplaatst, differentiëren ze tot een functioneel luchtwegepitheel. ALI-culturen afgeleid van gezonde donoren zijn samengesteld uit basale, secretoire en multiciliated cellen en vertonen epitheliale barrière-integriteit, beweeglijke trilharen en slijmafscheiding. Culturen afgeleid van personen met CF of PCD recapituleren het disfunctionele CFTR-gemedieerde chloridetransport of immoele trilharen, de respectieve ziekteverwekkende epitheliale defecten.
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van menselijke cellen dat kan worden toegepast voor het modelleren en begrijpen van luchtwegaandoeningen.
Introduction
Chronische longziekten zorgen wereldwijd voor een grote last van morbiditeit en mortaliteit1. Aandoeningen die de geleidende luchtwegen beïnvloeden, zoals astma, cystische fibrose (CF), primaire ciliaire dyskinesie (PCD) en virale infecties vertegenwoordigen zowel veel voorkomende als zeldzamere ziekten, verworven en genetisch, die bijdragen aan deze wereldwijde last. De belangrijkste functies van de geleidende luchtwegen zijn: 1) fungeren als een kanaal voor de laminaire luchtstroom en 2) zorgen voor mucociliaire klaring van pathogenen en puin. Secretoire, multiciliated en basale cellen vertegenwoordigen de belangrijkste epitheelceltypen van de geleidende luchtweg. Zeldzamere epitheelceltypen omvatten ionocyten, plukjecellen en neuro-endocriene cellen en zijn elders beoordeeld2.
Over het algemeen is een belangrijke barrière voor het begrijpen van ziektemechanismen en het bevorderen van therapeutische benaderingen een consistent gebrek aan menselijk primair weefsel voor gebruik in preklinische modellen. HBECs worden over het algemeen beschouwd als het gouden standaard in vitro model van menselijke luchtwegepitheelbiologie en hebben een sleutelrol gespeeld in CF-onderzoek in het bijzonder3. Ze worden echter meestal geïsoleerd uit bronchoscopische biopsieën, uit longweefsel na een operatie of uit longen die zijn afgewezen voor transplantatiedoeleinden. Toegang tot HBECs van personen met genetische ziekten, inclusief de onderzoeksprioriteiten van CF en PCD, is zeldzaam en onvoorspelbaar. Het overwinnen van dit knelpunt voor patiënt-afgeleide luchtwegepitheelcellen is nodig. iPSC's worden gemakkelijk gegenereerd door elk individu, ze behouden de unieke genetische achtergrond van de donor en hebben een opmerkelijk vermogen om zich te vermenigvuldigen en op lange termijn te overleven in celkweekomstandigheden 4,5,6. Door belangrijke embryologische stappen samen te vatten, ondergaan iPSC's "gerichte differentiatie" in orgaanspecifieke celtypen. Wij en anderen hebben protocollen ontwikkeld om iPSC-afgeleide longvoorlopercellen, alveolaire type 2-cellen 7,8 en de cellen van de geleidende luchtweg inclusief luchtwegbasale cellen 9,10,11,12 te genereren.
De luchtwegbasale cel is de stamcel van de geleidende luchtweg13. In eerder gepubliceerd werk heeft onze groep iPSC-afgeleide luchtwegepitheelcellen gegenereerd, waaronder een subset (iBC's) die canonieke basale celmarkers uitdrukt, waaronder TP63, KRT5 en NGFR. Na aanwijzingen uit de volwassen basale celbiologie leidt remming van dubbele SMAD-pathways (TGF-β en BMP) tot upregulatie van NGFR+ iBC's11,14. NGFR+ iBC's worden geresuspendeerd als enkele cellen in druppels extracellulaire matrix en gekweekt in een basaal celmedium. Ze vernieuwen zichzelf om een iBC-populatie in stand te houden en epitheliale sferoïden te vormen; een deel differentieert echter ook in secretoire cellen in dit formaat (aangeduid als 3D-cultuur). In het volgende protocol beschrijven we de stappen om deze iBC's in 3D-cultuur te behouden en uit te breiden, evenals de stappen die nodig zijn om een functionele 2D-mucociliaire ALI-cultuur te genereren.
De eerste stappen van dit differentiatieprotocol zijn eerder gepubliceerd en zullen hier niet worden besproken11,12. Dit manuscript zal zich richten op de uitbreiding en zuivering van iBC's en hun daaropvolgende differentiatie in functionele secretoire en multiciliated cellen in ALI-cultuur.
Protocol
Elk van de volgende stappen moet worden uitgevoerd met behulp van steriele techniek in een bioveiligheidsniveau 2 laminaire stromingskap. Alle media moeten worden opgewarmd tot kamertemperatuur (22 °C) voordat ze aan cellen worden toegevoegd, tenzij specifiek anders vermeld. Elke centrifugatiestap moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 22 °C). Figuur 1 schetst de schema's van het protocol.
1. Voorbereiding van de vereiste media
OPMERKING: Zie aanvullend dossier 1 voor meer informatie.
- Basaal cel medium
- Bereid het basismedium voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg aan elke 50 ml van het basismedium 5 μL A83-01 (10 mM), 5 μL DMH1 (10 mM), 50 μL Y-27632 (10mM) en 100 μL Primocin (50 mg/ml) toe. Hierna wordt dit medium basaal celmedium genoemd.
- Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- ALI Differentiatie Medium
- Bereid het medium volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg aan elke 50 ml ALI Differentiation Medium 100 μL Primocin (50 mg/ml) toe.
- Bewaar beschermd tegen licht bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Sorteerbuffer
- Combineer voor elke 50 ml sorteerbuffer 47,5 ml Hanks' Balanced Salt Solution, 1 ml FBS, 200 μL EDTA (500 mM), 1,25 ml HEPES-buffer (1 M), 50 μL Y-27632 (10 mM) en 100 μL Primocin (50 mg/ml).
- Filter steriliseren met een poriegrootte van 0,4 μm.
- Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Cryopreservatie Medium
- Combineer voor elke 50 ml cryopreservatiemedium 45 ml basaalcelmedium en 5 ml dimethylsulfoxide (DMSO).
- Filter steriliseren met een poriegrootte van 0,4 μm.
- Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
2. Ontdooien van gecryopreserveerde iBC's
- Ontdooien (op ijs) een voldoende volume van 3D-groeifactor verminderde extracellulaire matrix (hierna 3D-matrix). Houd op ijs tot het klaar is voor gebruik.
OPMERKING: Ontdooi bij het ontdooien van één injectieflacon (met 250.000 cellen) 100-200 μL 3D-matrix. - Ontdooi een injectieflacon met eerder gecryopreserveerde eencellige suspensies van iBC's door te broeden in een water- of kralenbad van 37 °C totdat er geen zichtbare bevroren media zijn (1-2 min).
- Gebruik een serologische pipet van 5 ml om de celsuspensie toe te voegen aan een conische buis van 15 ml.
- Voeg 6-10 ml DMEM/F12 druppelsgewijs toe aan de celsuspensie, meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g om de cellen te pelleteren.
- Adem het supernatant aan en resuspendeer de celpellet in 1 ml Basal Cell Medium met een P1000 micropipette. Verwijder een aliquot van 10 μL en voer een celtelling uit.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Adem het supernatant op en resuspensieer de cellen met een dichtheid van 4.000 cellen/μL in eerder ontdooide 3D-matrix met een P1000-micropipette.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat u bubbels toevoegt aan de 3D-matrix. Pipetteer de matrix langzaam en voorzichtig. - Voeg met een P200-micropipette één druppel (25 of 50 μL) toe aan de basis van elk putje van een met 12 bronnen behandelde weefselkweekplaat. Als het begint met 250.000 bevroren cellen, ligt het verwachte aantal druppels in deze stap tussen 3-4 (25 μL druppels), afhankelijk van de levensvatbaarheid van de cel.
- Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ongeveer 15 minuten en voeg vervolgens voldoende basaal celmedium toe aan elke put om de druppel volledig onder te dompelen (1,5 ml voor 50 μL; 1 ml voor 25 μL), met behulp van een serologische pipet van 5 ml. Breng de plaat terug naar een bevochtigde incubator.
- Voer cellen om de 2 dagen met behulp van vers Basal Cell Medium. Voeg vers medium toe aan de zijkant van de put met een serologische pipet van 5 ml en zorg ervoor dat de druppel van cellen niet wordt verstoord.
OPMERKING: De dichtheid van cellen die in deze fase worden geplateerd, is 10 keer hoger dan de routinematige passaging van iBC's in rubriek 3.
3. Dissociatie van sferoïden en uitbreiding van iBC's in 3D-cultuur
- Ontdooi (op ijs) een voldoende volume van 3D-matrix. Houd op ijs tot het klaar is voor gebruik.
OPMERKING: Het vereiste volume van de 3D-matrix varieert afhankelijk van het aantal cellen dat de gebruiker nodig heeft. - Ongeveer 5-7 dagen later, aspirateer het medium uit elke put en voeg met een P1000 micropipette 1 ml Dispase II (1 U / ml) rechtstreeks toe aan de sferoïden om te dissociëren van de druppel van de matrix.
- Plaats de plaat gedurende 10-15 min in de incubator van 37 °C.
- Pipetteer met behulp van een P1000-micropipette de Dispase 1-2 keer op en neer, waarbij grote klonten 3D-matrix worden gebroken. Breng de plaat terug naar 37 °C gedurende nog eens 30-40 minuten, zodat de matrix volledig kan oplossen.
- Wanneer de druppel van de 3D-matrix niet langer zichtbaar is onder de lichtmicroscoop, voegt u de vrij zwevende sferoïden toe aan een conische 15 ml met behulp van een serologische pipetpunt van 5 ml. Voeg DMEM/F12 toe voor een eindvolume van 10 ml per conisch en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g om de sferoïden te pelleteren.
- Adem het supernatant aan en voeg 1 ml 0,05% trypsine (37 °C) toe voor elke initiële gedissocieerde druppel (voeg bijvoorbeeld, als het begint met vier druppels, 4 ml trypsine toe aan de erlenmeyer).
- Incubeer bij 37 °C en tritureer regelmatig (elke 2-3 min).
- Evalueer om de paar minuten met de lichtmicroscoop. Zodra de meerderheid (>90%) van de sferoïden is gedissocieerd aan enkele cellen, voegt u 10% foetaal runderserum (in DMEM / F12) toe aan een volumeverhouding van 1: 1 aan het trypsine.
- Filter de cellen door een celzeef van 40 μm en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g .
- Voer een celtelling uit en resuspensieer de cellen gelijkmatig met een dichtheid van 400 cellen / μL ontdooide 3D-matrix. Vermijd het introduceren van luchtbellen. Resuspendeer zoveel druppels als nodig is voor downstream-toepassing. Herhaal stap 2.6-2.9 voor elke put.
4. Evaluatie en zuivering van NGFR+ iBC's
- Na 10-14 dagen van de meest recente passage, dissociëer de sferoïden tot een eencellige suspensie zoals in stap 3.2-3.5 en voer een celtelling uit.
OPMERKING: Verschillende iPSC-lijnen gedragen zich anders; daarom kan het bereik van 10-14 dagen variëren voor verschillende iBC's. Raadpleeg figuur 2 voor typische verschijningen van 3D-iBC's na 1, 4, 8 en 14 dagen, wanneer ze geschikt zijn voor het sorteren van NGFR+-cellen. Eerder sorteren dan aanbevolen (bijv. dag 8 zoals in figuur 2C), resulteert in een algemeen lager celgetal met minder frequente NGFR-expressie. Later sorteren dan aanbevolen (bijvoorbeeld meer dan 14 dagen na de meest recente passage) leidt tot een slechte overleving van de post-sort cel. - Resuspensieer de cellen met een dichtheid van 1 x 106 cellen/100 μL in Sorteerbuffer (hoofdpopulatie). Breng een kleine aliquot (25-50 μL) over naar een aparte buis (kleine populatie).
- Voeg geconjugeerd anti-NGFR-antilichaam (1:100 verdunning) toe aan de hoofdcelpopulatie.
- Voeg isotype controle antilichaam (1:200 verdunning) toe aan de kleine celpopulatie.
- Bescherm de cellen tegen licht en houd ze 30 minuten op ijs, met tussenpozen (elke 5-10 minuten) en tritureer de cellen om pelletvorming te voorkomen.
- Voeg na 30 minuten de sorteerbuffer in een verhouding van 1:1 toe aan elke buis cellen. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 min.
- Aspirateer het supernatant, resuspendeer de gepelletiseerde cellen in de sorteerbuffer met een dichtheid van 10 x 106 cellen / ml en voeg levende of dode celkleuring toe.
- Gebruik de juiste NGFR+-gatingstrategie (gebaseerd op isotypecontrole, zie figuur 3) en sorteer voldoende levende NGFR+-cellen voor noodzakelijke downstream-toepassingen.
OPMERKING: Als u iBC's gebruikt met fluorescerende reporters (d.w.z. NKX2-1GFP TP63tdTomato), wordt het aanbevolen om te sorteren op "triple positive" cellen (d.w.z. NKX2-1GFP +, TP63tdTomato +, NGFR +), met de juiste poortselectie en compensatie (figuur 3). Tijdens deze uitbreiding van iBC's differentieert een deel van de cellen in secretoire cellen en een zeer klein deel van de multiciliated cellen kan ook worden gedetecteerd. Beide populaties zijn NGFR-.
5. Generatie van mucociliaire ALI-culturen
- Bereid poreuze membraaninzetstukken van 6,5 mm voor door een matrix van 200 μL toe te voegen aan de apicale kamer (humane embryonale stamcel-gekwalificeerde matrix of recombinant humaan laminine-521) volgens de instructies van de fabrikant.
- Breng op 37 °C gedurende ten minste 2 uur voordat het nodig is.
- Zuig de coatingmatrix uit de apicale kamer van de insert. Voeg 500 μL van het basale celmedium toe aan de basolaterale kamer.
- Resuspensie ten minste 30.000 gesorteerde NGFR+ cellen (vanaf stap 4.5) in 100-200 μL Basal Cell Medium en breng over naar de apicale kamer met behulp van een P200 micropipette. Herhaal dit voor zoveel putten als gewenst (en beschikbare cellen). Plaats de plaat in een bevochtigde incubator van 37 °C.
- Aspirateer in 2-3 dagen apicale en basolaterale kamers en voer met vers basaal celmedium (500 μL tot apicale, 100 μL tot basolateraal).
- Controleer de apicale kamer dagelijks met lichtmicroscopie. Wanneer cellen >80% confluent zijn (meestal 3-7 dagen), vervang dan Basal Cell Medium door ALI Differentiation Medium (niet voorverwarmd) in zowel apicale als basolaterale kamers. Wanneer u met ALI Differentiation Medium werkt, bescherm dan tegen licht door mediacontainers in folie gewikkeld te houden en door de bovenlichten uit te schakelen wanneer dat mogelijk is.
- De volgende dag adem het medium uit de apicale kamer, waardoor het apicale oppervlak aan lucht wordt blootgesteld.
- Vervang de ALI Differentiation Medium media in de basolaterale kamer om de 2-3 dagen.
- Controleer het uiterlijk van de cultuur om de 1-2 dagen. Zuig zorgvuldig alle opgehoopte vloeistof uit de apicale kamer, zonder de cellaag te verstoren.
- Beoordeel de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) op epitheliale integriteit.
OPMERKING: TEER kan worden beoordeeld in de dagen na blootstelling aan de lucht om een uitlezing van de integriteit van de epitheliale laag te geven. Het ideale moment om TEER te meten is niet vastgesteld, hoewel waarden die consistent zijn met hoogwaardige mucociliaire differentiatie meestal >500 x cm2 zijn. - Als het nodig is om vuil of slijm te verwijderen, voeg dan voorzichtig 100 μL PBS (zonder Ca2+ of Mg2+) toe aan de apicale kamer. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten en adem pbs vervolgens voorzichtig op.
- Na 7-10 dagen blootstelling aan lucht verschijnen meestal beweeglijke trilharen en kunnen ze worden gezien met behulp van lichtmicroscopie. Afhankelijk van het geplande experiment en de uitlezing kunnen cellen worden geanalyseerd na 14-28 dagen blootstelling aan de lucht.
OPMERKING: Als fluorescerende reportercellen zijn gebruikt en als er een fluorescerende microscoop met levende cellen beschikbaar is, kunnen cellen worden gevolgd met lichtmicroscopie en reporterfluorescentie.
6. Optionele (maar aanbevolen) cryopreservatie van iBC's
- Na 10-14 dagen van de meest recente 3D-cultuurpassage dissociëren de sferoïden naar eencellige suspensie zoals in stap 3.2-3.5. Voer een celtelling uit.
- Resuspendatie in Cryopreservation Medium bij een dichtheid van 250.000 cellen/500 μL in een cryoviaal.
- Plaats cryoviale (en) in een container om een gestage temperatuurdaling (1 °C/min) te garanderen en breng gedurende 24-48 uur over naar -80 °C, gevolgd door overdracht tot -150 °C voor langdurige opslag.
OPMERKING: Herhaalde cryopreservatie en cryopreservatie van eerder NGFR+ gesorteerde cellen zijn uitgevoerd, maar deze zijn niet voldoende beoordeeld op de levensvatbaarheid van cellen en het vermogen om functionele ALI-culturen te vormen. Vooral bij extended cell passaging wordt aanbevolen om te beoordelen op het karyotype, omdat is opgemerkt dat dit varieert in iPSC's en iPSC-afgeleide cellen.
Representative Results
Volgens dit protocol werden 200.000 gecryopreserveerde iBC's (waarvan eerder werd bevestigd dat ze een normaal 46XY karyotype hebben)11 ontdooid en uitgebreid in 3D-cultuur. Vijf dagen later werden de resulterende sferoïden gedissocieerd, geteld en opnieuw gepasseerd voor verdere expansie. Ongeveer 480.000 cellen werden verkregen en opnieuw gesuspendeerd in 3D-matrix (12 x 50 μL druppeltjes, dichtheid 400 cellen / μL). Fresh Basal Cell Medium werd om de 2-3 dagen aangebracht. Tien dagen later werden de cellen opnieuw gedissocieerd en geteld. In totaal werden 19,7 x 106 cellen geoogst en klaargemaakt voor FACS. 106 cellen werden gekleurd met de APC-geconjugeerde IgG1κ isotypecontrole en de resterende 18,7 x 106 cellen werden gekleurd met het APC-geconjugeerde anti-NGFR-antilichaam gedurende 30 minuten beschermd tegen licht (figuur 3).
NGFR+ gating werd uitgevoerd na vergelijking met de isotype controlecellen en werd doelbewust ingesteld om de hoogste tot expressie brengende NGFR+ cellen te verzamelen (figuur 3). Met deze gatingtechniek was 28% van de levende, enkelvoudige cellen NGFR+. Terwijl er meer cellen beschikbaar waren, werden 750.000 cellen verzameld voor stroomafwaartse kweek. Gesorteerde cellen werden geresuspendeerd in Basal Cell Medium met een concentratie van 50.000 cellen / 100 μL. 50.000 cellen werden vervolgens gezaaid op elke 6,5 mm poreuze membraaninzet, die was gecoat met humaan recombinant laminine-521 (2 μg / 200 μL) volgens de richtlijnen van de fabrikant. 500 μL Basal Cell Medium werd toegevoegd aan de basolaterale kamer van elke insert en de plaat werd in een 37 °C bevochtigde incubator geplaatst. Drie dagen later werden de media in de apicale kamer geaspireerd en waren de cellen ~ 90% confluent door lichtmicroscopie (figuur 4B). De media uit de basolaterale kamer werden geaspireerd; ALI Differentiation Medium werd toegevoegd aan de apicale (100 μL) en basolaterale (500 μL) kamers. De volgende dag werden de media uit de apicale kamer geaspireerd.
Gedurende de volgende 21 dagen werden de cellen periodiek geëvalueerd door lichtmicroscopie en om de 2-3 dagen gevoed met vers ALI Differentiation Medium (alleen basolaterale kamer). Individuele cellen waren aanvankelijk gemakkelijk identificeerbaar (figuur 4A), hadden een langwerpig en spindelvormig uiterlijk en vormden een losjes verpakte monolaag (figuur 4B). In de daaropvolgende dagen tot weken vormden de cellen een dicht opeengepakte, zeer cellulaire, epitheliale laag en na 7-10 dagen was er de duidelijke opkomst van kloppende trilharen en slijmproductie. TEER van de monsters werd berekend en vergelijkbaar met primaire celcontroles (bereik van 700-1600 Ω x cm2)11. Daaropvolgende fixatie (dag 21-28) met paraformaldehyde en immunolabeling voor canonieke luchtwegepitheelcelmarkers werd uitgevoerd voor onder andere MUC5AC en geacetyleerd-α-tubuline (figuur 4C). Over het algemeen concludeerden we met onze observatie van beweeglijke trilharen, slijmproductie en bevestigende immunostaining van multiciliated en secretoire cellen die vergelijkbaar is met die van primaire HBECs, dat we met succes luchtwegepitheelcellen hebben gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen.
Figuur 1: Algemeen schema van het protocol. Gecryopreserveerde iBC's worden ontdooid, geëxpandeerd en FACS gezuiverd voordat ze op poreuze membraaninzetstukken worden geplaatst, waar ze differentiëren tot een functioneel mucociliair epitheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve fasecontrastbeelden. Representatieve fasecontrastbeelden die het gebruikelijke uiterlijk van iBC's in 3D-cultuur aantonen na (A) 1 dag, (B) 4 dagen, (C) 8 dagen en (D) 14 dagen (alleen pre-NGFR-sortering). Schaalbalken vertegenwoordigen 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve FACS-percelen. Representatieve FACS-plots voor niet-verslaggever en fluorescerende verslaggever iBC's. Voorbeelden van isotypecontroles worden getoond en werden gebruikt om te selecteren op de hoogste tot expressie brengende NGFR+ cellen. Fluorescerende reporter-bevattende iPSC-lijnen zijn "drievoudig gesorteerd" voor NKX2-1GFP+ TP63tdTomato+ NGFR+ cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van iBC-culturen op poreuze membranen. Fasecontrastbeelden worden getoond (A) 1 dag en (B) 3 dagen na beplating. Representatieve immunolabeling van mucociliaire culturen weergegeven in (C); geacetyleerd-alfa tubuline (groen) en MUC5AC (rood). Schaalbalken vertegenwoordigen 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Tabel met mediacomponenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
HBECs zijn het gouden standaard celtype om ziekten van het luchtwegepitheel te bestuderen. Vanwege hun beperkingen (waaronder toegankelijkheid en moeilijkheid om genetisch te manipuleren), hebben we een protocol gegenereerd voor de afleiding van iBC's en ALI-culturen. Deze cellen kunnen worden afgeleid van elke donor en behouden hun unieke genetische achtergrond, waardoor basisontwikkelingsstudies, ziektemodellering en nieuwe therapeutische ontwikkeling mogelijk zijn.
Hoewel elke afzonderlijke stap van het beschreven protocol noodzakelijk is, zijn er verschillende die extra vermelding verdienen. Ten eerste is het bij elke stap die dissociatie van sferoïden in afzonderlijke cellen vereist, van cruciaal belang om overmatig pipetteren te voorkomen; enzymatische spijsvertering (met dispase of trypsine) bevordert een betere celoverleving, terwijl overmatig pipetteren leidt tot aanzienlijke celdood. Ten tweede is bij het zuiveren van NGFR+ iBC's het gebruik van de isotypecontrole cruciaal en raden we aan om te selecteren op de hoogst tot expressie brengende NGFR+ cellen met FACS (figuur 3). Deze aanpak resulteert in optimale ALI-culturen met de juiste mucociliaire differentiatie. Ten slotte is de bereiding en het zaaien van poreuze membranen, precies zoals gedocumenteerd in het protocol, van fundamenteel belang voor de overleving van de ALI-cultuur. Hoewel we meestal 30.000-60.000 cellen per insert zaaien, hebben we succes gehad met slechts 20.000 cellen. Hoewel succesvolle culturen kunnen worden gegenereerd met behulp van de menselijke embryonale stamcel-gekwalificeerde matrixcoating, hebben we meer recentelijk humane recombinant laminine-521 gebruikt met een aanzienlijk hogere duurzaamheid van de ALI-culturen.
Zeer zelden kunnen iPSC-differentiaties er niet in slagen om een adequaat percentage NGFR+ iBC's te upreguleren. In dit geval kan seriële passaging van iBC's (in 3D-cultuur) resulteren in een verhoogde NGFR-frequentie in de loop van de tijd. Beperkingen van dit protocol zijn onder meer de tijd, kosten en expertise die nodig is om deze cellen te genereren. Bovendien erkennen we dat veel onderzoekers geïnteresseerd zijn in de minder voorkomende celtypen van het luchtwegepitheel (bijv. Ionocyten, neuro-endocriene cellen). Hoewel we enkele van deze zeldzamere celtypen hebben gedetecteerd, zoals in primaire HBEC-culturen, zijn ze niet reproduceerbaar geïdentificeerd, waarschijnlijk als gevolg van onvolledige kennis over de ontwikkelingssignalen die nodig zijn om deze cellen te genereren.
Zoals het is geschreven, begint het bovenstaande protocol met het ontdooien van reeds gecryopreserveerde iBC's. De details voorafgaand aan deze cryopreservatie zijn eerder beschreven en vallen buiten het bestek van dit manuscript11,12.
Onze luchtwegepitheel ALI-kweekmethode maakt het mogelijk om functionele luchtwegepitheelcellen van bijna elke donor te genereren. Dit verhoogt de toegankelijkheid van kostbare genetisch gecontroleerde luchtwegepitheelcellen die kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering, medicijnscreening, toekomstige celgebaseerde therapieën en om het begrip van de ontwikkelingspatronen in het luchtwegepitheel te verbeteren.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
We bedanken de leden van de Hawkins, Kotton en Davis laboratoria voor hun nuttige input door de jaren heen met betrekking tot deze en andere projecten. We zijn ook dank verschuldigd aan Brian Tilton (BU Cell Sorting Director) voor zijn toewijding en technische expertise, en we zijn Greg Miller en Marianne James van het Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) dankbaar voor hun ondersteuning en technische expertise in onderhoud en karakterisering van patiëntspecifieke iPSC's, ondersteund door NIH-subsidies NO1 75N92020C00005 en U01TR001810. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 en R01HL095993 aan D.N.K, R01HL139876 aan B.R.D, R01 HL139799 aan F.H., en Cystic Fibrosis Foundation (CFF) subsidies CFF 00987G220 en CFF WANG20GO aan D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 aan B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 aan S.S, CFF BERICA2010 aan A.B., en CFF HAWKIN20XX2 naar F.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
| 3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
| A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
| Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
| DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
| Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
| Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
| PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
| Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Alysandratos, K. -D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2013).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
- Suzuki, S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells. STAR Protocols. 2 (3), 100683 (2021).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
