Summary
Les progrès récents dans les protocoles de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme permettent la dérivation par étapes de types de cellules spécifiques à un organe. Ici, nous fournissons des étapes détaillées pour la maintenance et l’expansion des cellules basales des voies respiratoires dérivées de l’iPSC et leur différenciation en épithélium mucociliaire dans des cultures d’interface air-liquide.
Abstract
Les maladies des voies respiratoires conductrices telles que l’asthme, la fibrose kystique (FK), la dyskinésie ciliaire primaire (PCD) et les infections respiratoires virales sont les principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les plateformes in vitro utilisant des cellules épithéliales bronchiques humaines (HCO) ont joué un rôle déterminant dans notre compréhension de l’épithélium des voies respiratoires dans la santé et la maladie. L’accès aux HBEC des personnes atteintes de maladies génétiques rares ou de mutations rares est un goulot d’étranglement dans la recherche pulmonaire.
Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont facilement générées par « reprogrammation » des cellules somatiques et conservent le bagage génétique unique du donneur individuel. Des avancées récentes permettent la différenciation dirigée des CSPi en cellules progénitrices épithéliales pulmonaires, cellules alvéolaires de type 2, ainsi qu’en cellules de l’épithélium conducteur des voies respiratoires via les cellules basales, les principales cellules souches des voies respiratoires.
Nous décrivons ici un protocole pour la maintenance et l’expansion des cellules basales des voies respiratoires dérivées de l’iPSC (ci-après les iBC) ainsi que leur différenciation triligne dans les cultures d’interface air-liquide (ALI). Les iBC sont maintenus et étendus sous forme de sphères épithéliales suspendues dans des gouttelettes de matrice extracellulaire cultivées dans un milieu basocellulaire primaire complété par des inhibiteurs des voies de signalisation TGF-ß et BMP. Les iBC dans ces sphères épithéliales expriment les marqueurs basaux clés TP63 et NGFR, peuvent être purifiés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), et lorsqu’ils sont plaqués sur des membranes poreuses dans des conditions de culture ALI standard, se différencient en un épithélium fonctionnel des voies respiratoires. Les cultures ALI dérivées de donneurs sains sont composées de cellules basales, sécrétoires et multiciliées et démontrent l’intégrité de la barrière épithéliale, les cils mobiles et la sécrétion de mucus. Les cultures dérivées d’individus atteints de mucoviscidose ou de PCD récapitulent le transport dysfonctionnel du chlorure médié par le CFTR ou les cils immobiles, les défauts épithéliaux causant la maladie respectifs.
Nous présentons ici un protocole pour la génération de cellules humaines qui peuvent être appliquées à la modélisation et à la compréhension des maladies des voies respiratoires.
Introduction
Les maladies pulmonaires chroniques représentent un lourd fardeau de morbidité et de mortalité dans le monde1. Les affections qui affectent les voies respiratoires conductrices, telles que l’asthme, la fibrose kystique (FK), la dyskinésie ciliaire primaire (PCD) et les infections virales représentent des maladies courantes et plus rares, acquises et génétiques, qui contribuent à ce fardeau mondial. Les principales fonctions des voies respiratoires conductrices sont les suivantes: 1) agir comme un conduit pour le flux laminaire de l’air et 2) fournir une clairance mucociliaire des agents pathogènes et des débris. Les cellules sécrétoires, multiciliées et basales représentent les principaux types de cellules épithéliales des voies respiratoires conductrices. Les types de cellules épithéliales plus rares comprennent les ionocytes, les cellules de touffe et les cellules neuroendocrines, et ont été examinés ailleurs2.
De manière générale, un obstacle majeur à la compréhension des mécanismes de la maladie et à l’avancement des approches thérapeutiques a été le manque constant de tissu primaire humain pour l’utilisation dans les modèles précliniques. Les HBEC sont généralement considérés comme le modèle in vitro de référence de la biologie épithéliale des voies respiratoires humaines et ont joué un rôle clé dans la recherche sur la FK, en particulier3. Cependant, ils sont généralement isolés soit à partir de biopsies bronchoscopiques, de tissu pulmonaire après la chirurgie, ou de poumons rejetés à des fins de transplantation. L’accès aux HBEC des personnes atteintes de maladies génétiques, y compris les priorités de recherche de la FK et de la PCD, est peu fréquent et imprévisible. Il est nécessaire de surmonter ce goulot d’étranglement pour les cellules épithéliales des voies respiratoires dérivées du patient. Les CSPi sont facilement générées à partir de n’importe quel individu, elles conservent le bagage génétique unique du donneur et ont une capacité remarquable à proliférer et à survivre à long terme dans des conditions de culture cellulaire 4,5,6. En récapitulant les principales étapes embryologiques, les CSPi subissent une « différenciation dirigée » en types de cellules spécifiques à un organe. Nous et d’autres avons développé des protocoles pour générer des progéniteurs pulmonaires dérivés de l’iPSC, des cellules alvéolaires de type 2 7,8 et les cellules des voies respiratoires conductrices, y compris les cellules basales des voies respiratoires 9,10,11,12.
La cellule basale des voies respiratoires est la cellule souche de la voie respiratoireconductrice 13. Dans des travaux publiés précédemment, notre groupe a généré des cellules épithéliales des voies respiratoires dérivées de l’iPSC, y compris un sous-ensemble (iBC) qui exprime des marqueurs cellulaires basaux canoniques, notamment TP63, KRT5 et NGFR. Suivant les indices de la biologie des cellules basales adultes, l’inhibition des doubles voies SMAD (TGF-β et BMP) conduit à une régulation à la hausse des iBC NGFR+11,14. Les iBC NGFR+ sont remis en suspension sous forme de cellules individuelles dans des gouttelettes de matrice extracellulaire et cultivés dans un milieu basocellulaire. Ils s’auto-renouvellent pour maintenir une population d’IBC et forment des sphéroïdes épithéliaux; cependant, une proportion se différencie également en cellules sécrétoires dans ce format (appelé culture 3D). Dans le protocole suivant, nous détaillons les étapes pour maintenir et étendre ces iBC en culture 3D, ainsi que les étapes nécessaires pour générer une culture ALI mucociliaire 2D fonctionnelle.
Les premières étapes de ce protocole de différenciation ont été publiées précédemment et ne seront pas examinées ici11,12. Ce manuscrit sera centré sur l’expansion et la purification des iBC et leur différenciation ultérieure en cellules fonctionnelles sécrétoires et multiciliées en culture ALI.
Protocol
Chacune des étapes suivantes doit être effectuée à l’aide d’une technique stérile dans une hotte à écoulement laminaire de niveau de biosécurité 2. Tous les milieux doivent être réchauffés à la température ambiante (22 °C) avant d’être ajoutés aux cellules, sauf indication contraire. Chaque étape de centrifugation doit être effectuée à température ambiante (environ 22 °C). La figure 1 présente les schémas du protocole.
1. Préparation des supports requis
REMARQUE : Voir le dossier supplémentaire 1 pour plus de détails.
- Milieu basocellulaire
- Préparez le milieu de base conformément aux instructions du fabricant.
- À chaque 50 mL du milieu de base, ajouter 5 μL de A83-01 (10 mM), 5 μL de DMH1 (10 mM), 50 μL de Y-27632 (10 mM) et 100 μL de Primocine (50 mg/mL). Ci-après, ce milieu est appelé milieu basocellulaire.
- Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
- Milieu de différenciation ALI
- Préparez le support conformément aux instructions du fabricant.
- À chaque 50 mL de milieu de différenciation ALI, ajouter 100 μL de primocine (50 mg/mL).
- Conserver à l’abri de la lumière à 4 °C jusqu’à 1 mois.
- Tampon de tri
- Pour chaque 50 mL de tampon de tri, combiner 47,5 mL de solution saline équilibrée de Hanks, 1 mL de FBS, 200 μL d’EDTA (500 mM), 1,25 mL de tampon HEPES (1 M), 50 μL de Y-27632 (10 mM) et 100 μL de Primocine (50 mg/mL).
- Filtrer stériliser à l’aide d’une taille de pore de 0,4 μm.
- Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
- Milieu de cryoconservation
- Pour chaque 50 mL de milieu de cryoconservation, combiner 45 mL de milieu basocellulaire et 5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Filtrer stériliser à l’aide d’une taille de pore de 0,4 μm.
- Conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
2. Décongélation des iBC cryoconservés
- Décongeler (sur glace) un volume suffisant de facteur de croissance 3D réduit la matrice extracellulaire (ci-après matrice 3D). Conserver sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
REMARQUE: Lors de la décongélation d’un flacon (contenant 250 000 cellules), décongeler 100 à 200 μL de matrice 3D. - Décongeler un flacon de suspensions unicellulaires d’iBC préalablement cryoconservées en incubant dans un bain d’eau ou de perles à 37 °C jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de milieu congelé visible (1-2 min).
- À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter une suspension cellulaire à un tube conique de 15 mL.
- Ajouter 6 à 10 mL de DMEM/F12 goutte à goutte à la suspension de la cellule, mélanger doucement et centrifuger à 300 x g pendant 5 min pour granuler les cellules.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu basocellulaire à l’aide d’une micropipette P1000. Retirez une aliquote de 10 μL et effectuez un comptage de cellules.
- Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension à une densité de 4 000 cellules/μL dans une matrice 3D préalablement décongelée à l’aide d’une micropipette P1000.
REMARQUE: Il est essentiel d’éviter d’ajouter des bulles à la matrice 3D. Pipettez la matrice lentement et soigneusement. - À l’aide d’une micropipette P200, ajouter une gouttelette (25 ou 50 μL) à la base de chaque puits d’une plaque traitée par culture tissulaire de 12 puits. Si vous commencez avec 250 000 cellules congelées, le nombre attendu de gouttelettes à cette étape est compris entre 3 et 4 (gouttelettes de 25 μL), selon la viabilité de la cellule.
- Incuber la plaque à 37 °C pendant environ 15 min, puis ajouter suffisamment de milieu basocellulaire à chaque puits pour immerger complètement la gouttelette (1,5 mL pour 50 μL; 1 mL pour 25 μL), à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL. Remettez la plaque dans un incubateur humidifié.
- Cellules alimentaires tous les 2 jours en utilisant du milieu basocellulaire frais. Ajouter le milieu frais sur le côté du puits avec une pipette sérologique de 5 mL, en prenant soin de ne pas perturber la gouttelette de cellules.
REMARQUE: La densité des cellules plaquées à ce stade est 10 fois plus élevée que le passage de routine des iBC dans la section 3.
3. Dissociation des sphéroïdes et expansion des iBC en culture 3D
- Décongeler (sur glace) un volume suffisant de matrice 3D. Conserver sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
REMARQUE: Le volume de matrice 3D requis varie en fonction du nombre de cellules dont l’utilisateur aura besoin. - Environ 5 à 7 jours plus tard, aspirer le milieu de chaque puits et avec une micropipette P1000, ajouter 1 mL de Dispase II (1 U/mL) directement sur les sphéroïdes pour se dissocier de la gouttelette de la matrice.
- Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 10-15 min.
- À l’aide d’une micropipette P1000, pipettez le Dispase de haut en bas 1 à 2 fois, en brisant de gros amas de matrice 3D. Remettre la plaque à 37 °C pendant 30 à 40 minutes supplémentaires, ce qui permet à la matrice de se dissoudre complètement.
- Lorsque la gouttelette de matrice 3D n’est plus visible au microscope optique, ajoutez les sphéroïdes flottant librement à un conique de 15 mL à l’aide d’une pointe de pipette sérologique de 5 mL. Ajouter le DMEM/F12 pour un volume final de 10 mL par conique et centrifuger à 200 x g pendant 3 min pour granuler les sphéroïdes.
- Aspirer le surnageant et ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % (37 °C) pour chaque gouttelette initiale dissociée (p. ex., si vous commencez avec quatre gouttelettes, ajouter 4 ml de trypsine à la fiole conique).
- Incuber à 37 °C, en triturant fréquemment (toutes les 2-3 minutes).
- Évaluez avec le microscope optique toutes les quelques minutes. Une fois que la majorité (>90%) des sphéroïdes ont été dissociés en cellules individuelles, ajoutez 10% de sérum bovin fœtal (dans le DMEM / F12) à un rapport de volume de 1: 1 à la trypsine.
- Filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 μm et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Effectuez un comptage de cellules et remettez en suspension uniformément les cellules à une densité de 400 cellules/μL de matrice 3D décongelée. Évitez d’introduire des bulles d’air. Remettez en suspension autant de gouttelettes que nécessaire pour une application en aval. Répétez les étapes 2.6-2.9 pour chaque puits.
4. Évaluation et purification des iBC NGFR+
- Après 10-14 jours du passage le plus récent, dissocier les sphéroïdes en une suspension à cellule unique comme dans les étapes 3.2-3.5 et effectuer un comptage cellulaire.
REMARQUE: Différentes lignes iPSC se comportent différemment; par conséquent, la plage de 10 à 14 jours peut varier pour différents iBC. Veuillez vous référer à la figure 2 pour connaître les apparences typiques des iBC 3D après 1, 4, 8 et 14 jours, lorsqu’ils sont adéquats pour le tri des cellules NGFR+. Un tri plus précoce que recommandé (p. ex., jour 8 comme à la figure 2C) donne un nombre global de cellules plus faible avec une expression moins fréquente du NGFR. Un tri plus tardif que recommandé (p. ex., plus de 14 jours après le passage le plus récent) entraîne une mauvaise survie cellulaire après le tri. - Remettre en suspension les cellules à une densité de 1 x 106 cellules/100 μL dans le tampon de tri (population principale). Transférer une petite aliquote (25-50 μL) dans un tube séparé (population mineure).
- Ajouter l’anticorps anti-NGFR conjugué (dilution 1:100) à la population cellulaire principale.
- Ajouter l’anticorps témoin isotype (dilution 1:200) à la population de cellules mineures.
- Protégez les cellules de la lumière et maintenez-les sur la glace pendant 30 minutes, en triturant les cellules par intermittence (toutes les 5 à 10 minutes) pour éviter les granules.
- Après 30 min, ajoutez le tampon de tri dans un rapport de 1:1 à chaque tube de cellules. Cellules centrifuges à 300 x g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant, remettre en suspension les cellules granulées dans le tampon de tri à une densité de 10 x 106 cellules/mL et ajouter une coloration de cellules vivantes ou mortes.
- À l’aide d’une stratégie de contrôle NGFR+ appropriée (basée sur le contrôle de l’isotype, voir la figure 3), triez suffisamment de cellules NGFR+ vivantes pour les applications en aval nécessaires.
REMARQUE : Si vous utilisez des iBC avec des rapporteurs fluorescents (c.-à-d. NKX2-1GFP TP63tdTomato), il est recommandé de trier les cellules « triple positives » (c.-à-d. NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), avec sélection et compensation de porte appropriées (figure 3). Au cours de cette expansion des iBC, une proportion de cellules se différencient en cellules sécrétoires et une très petite proportion de cellules multiciliées peut également être détectée. Ces deux populations sont des NGFR-.
5. Génération de cultures ALI mucociliaires
- Préparer des inserts de membrane poreuse de 6,5 mm en ajoutant une matrice de 200 μL à la chambre apicale (matrice qualifiée de cellules souches embryonnaires humaines ou laminine-521 humaine recombinante) selon les instructions du fabricant.
- Placer à 37 °C pendant au moins 2 h avant d’être nécessaire.
- Aspirer la matrice de revêtement de la chambre apicale de l’insert. Ajouter 500 μL du milieu basocellulaire à la chambre basolatérale.
- Remettre en suspension au moins 30 000 cellules NGFR+ triées (à partir de l’étape 4.5) dans un milieu bascellulaire de 100 à 200 μL et les transférer dans la chambre apicale à l’aide d’une micropipette P200. Répétez l’opération pour autant de puits que vous le souhaitez (et de cellules disponibles). Placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C.
- En 2-3 jours, aspirez les chambres apicales et basolatérales et nourrissez-les avec un milieu basocellulaire frais (500 μL à apical, 100 μL à basolatéral).
- Surveillez quotidiennement la chambre apicale avec la microscopie optique. Lorsque les cellules sont >80% confluentes (généralement 3-7 jours), remplacez le milieu basocellulaire par le milieu de différenciation ALI (non préchauffé) dans les chambres apicales et basolatérales. Lorsque vous travaillez avec ALI Differentiation Medium, protégez-vous de la lumière en gardant les récipients de médias enveloppés dans du papier d’aluminium et en éteignant les plafonniers lorsque vous le pouvez.
- Le lendemain, aspirez le milieu de la chambre apicale, exposant ainsi la surface apicale à l’air.
- Remplacez le milieu de différenciation ALI dans la chambre basolatérale tous les 2-3 jours.
- Surveillez l’apparence de la culture tous les 1-2 jours. Aspirer soigneusement tout liquide accumulé de la chambre apicale, sans perturber la couche cellulaire.
- Évaluer la résistance électrique transépithéliale (TEER) pour l’intégrité épithéliale.
REMARQUE: TEER peut être évalué dans les jours suivant l’exposition à l’air pour donner une lecture de l’intégrité de la couche épithéliale. Le moment idéal pour mesurer teer n’a pas été établi, bien que les valeurs compatibles avec une différenciation mucociliaire de haute qualité soient généralement de >500 x cm2. - S’il est nécessaire d’enlever les débris ou le mucus, ajouter doucement 100 μL de PBS (sans Ca2+ ou Mg2+) à la chambre apicale. Incuber à 37 °C pendant 10 min, puis aspirer soigneusement le PBS.
- Après 7 à 10 jours d’exposition à l’air, des cils mobiles apparaissent généralement et peuvent être vus en microscopie optique. Selon l’expérience et la lecture prévues, les cellules peuvent être analysées après 14 à 28 jours d’exposition à l’air.
REMARQUE: Si des cellules rapporteures fluorescentes ont été utilisées et si un microscope fluorescent à cellules vivantes est disponible, les cellules peuvent être suivies par microscopie optique et fluorescence rapporteure.
6. Cryoconservation facultative (mais recommandée) des iBC
- Après 10 à 14 jours du passage de culture 3D le plus récent, dissocier les sphéroïdes en suspension unicellulaire comme aux étapes 3.2-3.5. Effectuez un comptage de cellules.
- Remise en suspension dans un milieu de cryoconservation à une densité de 250 000 cellules/500 μL dans un cryovial.
- Placer le(s) cryovial(s) dans un récipient pour assurer une baisse constante de la température (1 °C/min) et transférer à -80 °C pendant 24-48 h, puis transférer à -150 °C pour un stockage à long terme.
REMARQUE: Une cryoconservation répétée ainsi que la cryoconservation de cellules précédemment triées NGFR+ ont été effectuées, mais celles-ci n’ont pas été évaluées de manière adéquate pour la viabilité cellulaire et la capacité de former des cultures ALI fonctionnelles. Surtout avec le passage cellulaire prolongé, il est recommandé d’évaluer le caryotype car il a été noté que cela varie dans les CSPi et les cellules dérivées de l’iPSC.
Representative Results
Suite à ce protocole, 200 000 iBC cryoconservés (précédemment confirmés pour avoir un caryotype normal de 46XY)11 ont été décongelés et étendus en culture 3D. Cinq jours plus tard, les sphéroïdes résultants ont été dissociés, comptés et passés à nouveau pour une expansion ultérieure. Environ 480 000 cellules ont été obtenues et remises en suspension dans une matrice 3D (gouttelettes de 12 x 50 μL, densité de 400 cellules/μL). Fresh Basal Cell Medium a été appliqué tous les 2-3 jours. Dix jours plus tard, les cellules ont de nouveau été dissociées et comptées. Un total de 19,7 x 106 cellules ont été récoltées et préparées pour FACS. 10cellules 6 ont été colorées avec l’isotype IgG1κ conjugué à l’APC et les 18,7 x 106 cellules restantes ont été colorées avec l’anticorps anti-NGFR conjugué APC pendant 30 min à l’abri de la lumière (Figure 3).
Le contrôle NGFR+ a été effectué après comparaison avec les cellules témoins de l’isotype et a été délibérément défini pour recueillir les cellules NGFR+ exprimant le plus (Figure 3). Avec cette technique de contrôle, 28% des cellules vivantes et individuelles étaient NGFR+. Alors que plus de cellules étaient disponibles, 750 000 cellules ont été collectées pour la culture en aval. Les cellules triées ont été remises en suspension dans un milieu basocellulaire à une concentration de 50 000 cellules/100 μL. 50 000 cellules ont ensuite été ensemencées sur chaque insert membranaire poreux de 6,5 mm, qui avait été recouvert de laminine recombinante humaine 521 (2 μg/200 μL) conformément aux directives du fabricant. Un milieu basocellulaire de 500 μL a été ajouté à la chambre basolatérale de chaque insert et la plaque a été placée dans un incubateur humidifié à 37 °C. Trois jours plus tard, le milieu de la chambre apicale a été aspiré et les cellules étaient confluentes à environ 90 % par microscopie optique (Figure 4B). Les médias de la chambre basolatérale ont été aspirés; Le milieu de différenciation ALI a été ajouté aux chambres apicale (100 μL) et basolatérale (500 μL). Le lendemain, les médias de la chambre apicale ont été aspirés.
Au cours des 21 jours suivants, les cellules ont été évaluées périodiquement par microscopie optique et nourries avec un milieu de différenciation ALI frais (chambre basolatérale uniquement) tous les 2-3 jours. Les cellules individuelles étaient initialement facilement identifiables (figure 4A), avaient un aspect allongé et en forme de fuseau et formaient une monocouche lâchement emballée (figure 4B). Au cours des jours ou des semaines suivants, les cellules ont formé une couche épithéliale étroitement emballée et hautement cellulaire, et après 7 à 10 jours, il y a eu l’émergence claire de la production de cils et de mucus. Les TEER des échantillons ont été calculés et similaires aux témoins cellulaires primaires (plage de 700 à 1600 Ω x cm2)11. Une fixation ultérieure (jour 21-28) avec du paraformaldéhyde et un immunomarquage pour les marqueurs cellulaires épithéliaux canoniques des voies respiratoires a été effectuée pour le MUC5AC et l’acétylé-α-tubuline, entre autres (Figure 4C). Dans l’ensemble, avec notre observation des cils mobiles, de la production de mucus ainsi que de l’immunocoloration de confirmation des cellules multiciliées et sécrétoires qui est similaire à celle des HBEC primaires, nous avons conclu que nous avons réussi à générer des cellules épithéliales des voies respiratoires à partir de cellules souches pluripotentes induites.
Figure 1 : Schéma global du protocole. Les iBC cryoconservés sont décongelés, expansés et purifiés FACS avant le placage sur des inserts à membrane poreuse, où ils se différencient en un épithélium mucociliaire fonctionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images à contraste de phase représentatif. Images de contraste de phase représentatives démontrant l’apparence habituelle des iBC en culture 3D après (A) 1 jour, (B) 4 jours, (C) 8 jours et (D) 14 jours (juste avant le tri NGFR). Les barres d’échelle représentent 500 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Diagrammes représentatifs du FACS. Diagrammes FACS représentatifs pour les iBC non déclarants et fluorescents. Des exemples de contrôles d’isotypes sont présentés et ont été utilisés pour sélectionner les cellules NGFR+ exprimant le plus. Les lignes iPSC contenant des rapporteurs fluorescents sont « triées trois fois » pour les cellules NKX2-1GFP+ TP63tdTomato+ NGFR+. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images représentatives de cultures iBC sur des membranes poreuses. Les images à contraste de phase sont affichées (A) 1 jour et (B) 3 jours après le placage. Immunomarquage représentatif des cultures mucociliaires présentées en (C); tubuline acétylée-alpha (vert) et MUC5AC (rouge). Les barres d’échelle représentent 25 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Tableau des composants multimédias. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Les HBEC sont le type de cellule de référence pour étudier les maladies de l’épithélium des voies respiratoires. En raison de leurs limites (y compris l’accessibilité et la difficulté à manipuler génétiquement), nous avons généré un protocole pour la dérivation des cultures iBC et ALI. Ces cellules peuvent être dérivées de n’importe quel donneur et conserver leur bagage génétique unique, permettant ainsi des études de développement de base, la modélisation de la maladie et le développement de nouvelles thérapies.
Bien que chaque étape individuelle du protocole décrit soit nécessaire, il y en a plusieurs qui méritent une mention supplémentaire. Tout d’abord, à chaque étape qui nécessite la dissociation des sphéroïdes en cellules individuelles, il est essentiel d’éviter un pipetage excessif; la digestion enzymatique (avec dispase ou trypsine) favorise une meilleure survie cellulaire, tandis qu’un pipetage excessif entraîne une mort cellulaire importante. Deuxièmement, lors de la purification des iBC NGFR+, l’utilisation du contrôle de l’isotype est cruciale et nous recommandons de sélectionner les cellules NGFR+ exprimant le plus haut avec FACS (Figure 3). Cette approche aboutit à des cultures ALI optimales avec une différenciation mucociliaire appropriée. Enfin, la préparation et l’ensemencement des membranes poreuses précisément comme documenté dans le protocole est fondamentale pour la survie de la culture ALI. Alors que nous ensemençons généralement 30 000 à 60 000 cellules par insert, nous avons eu du succès avec aussi peu que 20 000 cellules. Alors que les cultures réussies peuvent être générées en utilisant le revêtement matriciel qualifié de cellules souches embryonnaires humaines, nous avons plus récemment utilisé la laminine-521 recombinante humaine avec une durabilité significativement plus élevée des cultures ALI.
Très rarement, les différenciations iPSC peuvent ne pas réguler à la hausse un pourcentage adéquat de NGFR+ iBC. Dans ce cas, le passage en série des iBC (en culture 3D) peut entraîner une augmentation de la fréquence NGFR au fil du temps. Les limites de ce protocole incluent le temps, le coût et l’expertise nécessaires pour générer ces cellules. De plus, nous reconnaissons que de nombreux chercheurs s’intéressent aux types de cellules moins courants de l’épithélium des voies respiratoires (p. ex., les ionocytes, les cellules neuroendocrines). Bien que nous ayons détecté certains de ces types de cellules plus rares, comme dans les cultures primaires de HBEC, ils ne sont pas identifiés de manière reproductible, probablement en raison de connaissances incomplètes concernant les indices de développement nécessaires pour générer ces cellules.
Tel qu’il est écrit, le protocole ci-dessus commence par la décongélation des iBC déjà cryoconservés. Les détails antérieurs à cette cryoconservation sont décrits précédemment et au-delà de la portée de ce manuscrit11,12.
Notre méthode de culture ALI épithéliale des voies respiratoires permet la génération de cellules épithéliales fonctionnelles des voies respiratoires à partir de presque tous les donneurs. Cela augmente considérablement l’accessibilité aux précieuses cellules épithéliales des voies respiratoires génétiquement contrôlées qui peuvent être utilisées pour la modélisation de la maladie, le dépistage des médicaments, les futures thérapies cellulaires, ainsi que pour améliorer la compréhension du schéma de développement dans l’épithélium des voies respiratoires.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation.
Acknowledgments
Nous remercions les membres des laboratoires Hawkins, Kotton et Davis pour leur contribution utile au fil des ans concernant ce projet et d’autres. Nous sommes également redevables à Brian Tilton (directeur du tri cellulaire de la BU) pour son dévouement et son expertise technique, et nous sommes reconnaissants à Greg Miller et Marianne James du Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) pour leur soutien et leur expertise technique dans la maintenance et la caractérisation des CSPi spécifiques aux patients, soutenus par les subventions DESH NO1 75N92020C00005 et U01TR001810. Ce travail a été soutenu par les subventions nih U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 et R01HL095993 à D.N.K, R01HL139876 à B.R.D, R01 HL139799 à F.H., et la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) accorde CFF 00987G220 et CFF WANG20GO à D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 à B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 à S.S, CFF BERICA2010 à A.B., et CFF HAWKIN20XX2 à F.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
| 3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
| A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
| Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
| DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
| Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
| Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
| PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
| Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
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