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Developmental Biology

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से वायुमार्ग उपकला सेल एयर-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों की पीढ़ी

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63882
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 2, 2, 3, 1,2, 1,2
1Pulmonary Center, Boston University School of Medicine, 2Center for Regenerative Medicine, Boston University and Boston Medical Center, 3Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center

Summary

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल भेदभाव प्रोटोकॉल में हालिया प्रगति अंग-विशिष्ट सेल प्रकारों के चरणबद्ध व्युत्पत्ति की अनुमति देती है। यहां, हम आईपीएससी-व्युत्पन्न वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं के रखरखाव और विस्तार और वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों में एक श्लेष्म उपकला में उनके भेदभाव के लिए विस्तृत कदम प्रदान करते हैं।

Abstract

अस्थमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ), प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया (पीसीडी), और वायरल श्वसन संक्रमण जैसे वायुमार्ग के रोग दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर के प्रमुख कारण हैं। मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (एचबीईसी) का उपयोग करने वाले इन विट्रो प्लेटफार्मों ने स्वास्थ्य और बीमारी में वायुमार्ग उपकला की हमारी समझ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। दुर्लभ आनुवंशिक बीमारियों या दुर्लभ उत्परिवर्तन वाले व्यक्तियों से एचबीईसी तक पहुंच फेफड़ों के अनुसंधान में एक बाधा है।

प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) आसानी से "रीप्रोग्रामिंग" दैहिक कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न होते हैं और व्यक्तिगत दाता की अद्वितीय आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बनाए रखते हैं। हाल की प्रगति फेफड़ों के उपकला पूर्वज कोशिकाओं, वायुकोशीय प्रकार 2 कोशिकाओं के साथ-साथ बेसल कोशिकाओं, प्रमुख वायुमार्ग स्टेम कोशिकाओं के माध्यम से संचालन वायुमार्ग उपकला की कोशिकाओं के लिए आईपीएससी के निर्देशित भेदभाव की अनुमति देती है।

यहां हम आईपीएससी-व्युत्पन्न वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं (इसके बाद आईबीसी) के रखरखाव और विस्तार के साथ-साथ वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृतियों में उनके त्रिवंश भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। आईबीसी को टीजीएफ-ए और बीएमपी सिग्नलिंग मार्गों के अवरोधकों के साथ पूरक प्राथमिक बेसल सेल माध्यम में सुसंस्कृत बाह्य मैट्रिक्स की बूंदों में निलंबित उपकला क्षेत्रों के रूप में बनाए रखा और विस्तारित किया जाता है। इन उपकला क्षेत्रों के भीतर आईबीसी प्रमुख बेसल मार्करों टीपी 63 और एनजीएफआर को व्यक्त करते हैं, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा शुद्ध किया जा सकता है, और जब मानक एएलआई संस्कृति स्थितियों में झरझरा झिल्ली पर चढ़ाया जाता है, तो एक कार्यात्मक वायुमार्ग उपकला में अंतर होता है। स्वस्थ दाताओं से प्राप्त एएलआई संस्कृतियां बेसल, स्रावी और बहुकोशिकीय कोशिकाओं से बनी होती हैं और उपकला बाधा अखंडता, गतिशील सिलिया और बलगम स्राव का प्रदर्शन करती हैं। सीएफ या पीसीडी वाले व्यक्तियों से प्राप्त संस्कृतियां बेकार सीएफटीआर-मध्यस्थता क्लोराइड परिवहन या इमोटाइल सिलिया, संबंधित रोग पैदा करने वाले उपकला दोषों को दोहराती हैं।

यहां, हम मानव कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे वायुमार्ग रोगों के मॉडलिंग और समझने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

क्रोनिक फुफ्फुसीय रोगदुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर का एक बड़ा बोझ है1. अस्थमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ), प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया (पीसीडी), और वायरल संक्रमण जैसे संचालन वायुमार्ग को प्रभावित करने वाली स्थितियां सामान्य और दुर्लभ दोनों बीमारियों, अधिग्रहित और आनुवंशिक दोनों का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो दुनिया भर में इस बोझ में योगदान करती हैं। संचालन वायुमार्ग के प्रमुख कार्य हैं: 1) हवा के लामिना के प्रवाह के लिए एक नाली के रूप में कार्य करें, और 2) रोगजनकों और मलबे की श्लेष्म निकासी प्रदान करें। स्रावी, बहुआयामी और बेसल कोशिकाएं संचालन वायुमार्ग के प्रमुख उपकला कोशिका प्रकारों का प्रतिनिधित्व करती हैं। दुर्लभ उपकला कोशिका प्रकारों में आयनोसाइट्स, टफ्ट कोशिकाएं और न्यूरोएंडोक्राइन कोशिकाएं शामिल हैं, और कहीं और समीक्षा की गई है2.

मोटे तौर पर, रोग के तंत्र को समझने और चिकित्सीय दृष्टिकोण को आगे बढ़ाने के लिए एक प्रमुख बाधा प्रीक्लिनिकल मॉडल में उपयोग के लिए मानव प्राथमिक ऊतक की लगातार कमी रही है। एचबीईसी को आम तौर पर मानव वायुमार्ग उपकला जीव विज्ञान के इन विट्रो मॉडल में स्वर्ण-मानक माना जाता है और विशेष रूप से सीएफ अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाईहै 3. हालांकि, वे आमतौर पर या तो ब्रोंकोस्कोपिक बायोप्सी से, सर्जरी के बाद फेफड़ों के ऊतकों से, या प्रत्यारोपण उद्देश्यों के लिए अस्वीकार किए गए फेफड़ों से अलग होते हैं। सीएफ और पीसीडी की अनुसंधान प्राथमिकताओं सहित आनुवंशिक बीमारियों वाले व्यक्तियों से एचबीईसी तक पहुंच, दुर्लभ और अप्रत्याशित है। रोगी-व्युत्पन्न वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के लिए इस अड़चन पर काबू पाने की आवश्यकता है। आईपीएससी आसानी से किसी भी व्यक्ति से उत्पन्न होते हैं, वे दाता की अद्वितीय आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बनाए रखते हैं, और सेल संस्कृति की स्थिति 4,5,6 में दीर्घकालिक प्रसार और जीवित रहने की उल्लेखनीय क्षमता रखते हैं। प्रमुख भ्रूणविज्ञान चरणों को दोहराते हुए, आईपीएससी अंग-विशिष्ट सेल प्रकारों में "निर्देशित-भेदभाव" से गुजरते हैं। हमने और अन्य लोगों ने आईपीएससी-व्युत्पन्न फेफड़ों के पूर्वजों, वायुकोशीय प्रकार 2 कोशिकाओं 7,8 और वायुमार्ग बेसल कोशिकाओं 9,10,11,12 सहित संचालन वायुमार्ग की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं।

वायुमार्ग बेसल सेल संचालन वायुमार्ग13 का स्टेम सेल है। पहले प्रकाशित काम में, हमारे समूह ने आईपीएससी-व्युत्पन्न वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न किया है, जिसमें एक सबसेट (आईबीसी) शामिल है जो टीपी 63, केआरटी 5 और एनजीएफआर सहित विहित बेसल सेल मार्करों को व्यक्त करता है। वयस्क बेसल सेल जीव विज्ञान से संकेतों के बाद, दोहरी एसएमएडी मार्गों (टीजीएफ-β और बीएमपी) के निषेध से एनजीएफआर + आईबीसी11,14 का उन्नयन होता है। एनजीएफआर + आईबीसी को बाह्य मैट्रिक्स की बूंदों में एकल कोशिकाओं के रूप में फिर से निलंबित कर दिया जाता है और बेसल सेल माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है। वे आईबीसी आबादी को बनाए रखने और उपकला स्फेरॉइड बनाने के लिए आत्म-नवीनीकरण करते हैं; हालाँकि, एक अनुपात इस प्रारूप में स्रावी कोशिकाओं में भी अंतर करता है (जिसे 3-डी संस्कृति के रूप में संदर्भित किया जाता है)। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम 3-डी संस्कृति में इन आईबीसी को बनाए रखने और विस्तारित करने के चरणों का विस्तार करते हैं, साथ ही साथ एक कार्यात्मक 2-डी म्यूकोसिलरी एएलआई संस्कृति उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम भी उठाते हैं।

इस भेदभाव प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरणों को पहले प्रकाशित किया गया है और यहां11,12 की समीक्षा नहीं की जाएगी। यह पांडुलिपि आईबीसी के विस्तार और शुद्धिकरण और एएलआई संस्कृति में कार्यात्मक स्रावी और मल्टीसिलिएटेड कोशिकाओं में उनके बाद के भेदभाव पर केंद्रित होगी।

Protocol

निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक को जैव सुरक्षा स्तर 2 लामिना प्रवाह हुड में बाँझ तकनीक का उपयोग करके किया जाना चाहिए। सभी मीडिया को कोशिकाओं में जोड़े जाने से पहले कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) पर गर्म किया जाना चाहिए, सिवाय इसके कि जब विशेष रूप से अन्यथा उल्लेख किया गया हो। प्रत्येक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण कमरे के तापमान (लगभग 22 डिग्री सेल्सियस) पर किया जाना चाहिए। चित्रा 1 प्रोटोकॉल की योजनाबद्धता को रेखांकित करता है।

1. आवश्यक मीडिया की तैयारी

नोट: विवरण के लिए अनुपूरक फ़ाइल 1 देखें।

  1. बेसल सेल माध्यम
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आधार माध्यम तैयार करें।
    2. आधार माध्यम के प्रत्येक 50 मिलीलीटर में, ए 83-01 (10 एमएम) के 5 μL, डीएमएच 1 (10 एमएम) के 5 μL, Y-27632 (10mM) के 50 μL और प्राइमोसिन के 100 μL (50 मिलीग्राम / इसके बाद, इस मीडिया को बेसल सेल माध्यम कहा जाता है।
    3. अप करने के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. अली भेदभाव मध्यम
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार माध्यम तैयार करें।
    2. एएलआई भेदभाव माध्यम के प्रत्येक 50 एमएल में, प्राइमोसिन के 100 μL (50 मिलीग्राम /
    3. 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित स्टोर करें।
  3. बफ़र सॉर्ट करें
    1. सॉर्ट बफर के प्रत्येक 50 एमएल के लिए, हैंक्स के संतुलित नमक समाधान के 47.5 एमएल, एफबीएस के 1 एमएल, ईडीटीए (500 एमएम) के 200 μL, एचईपीईएस बफर (1 एम) के 1.25 एमएल, वाई -27632 (10 एमएम) के 50 μL और प्राइमोसिन के 100 μL (50 मिलीग्राम /
    2. एक 0.4 μm ताकना आकार का उपयोग कर फ़िल्टर निष्फल।
    3. अप करने के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. क्रायोप्रेज़र्वेशन मीडियम
    1. क्रायोप्रिजर्वेशन मीडियम के प्रत्येक 50 एमएल के लिए, बेसल सेल मीडियम के 45 एमएल और डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 5 एमएल को मिलाएं।
    2. एक 0.4 μm ताकना आकार का उपयोग कर फ़िल्टर निष्फल।
    3. अप करने के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. क्रायोप्रिजर्व्ड आईबीसी का पिघलना

  1. पिघलना (बर्फ पर) 3-डी विकास कारक की पर्याप्त मात्रा ने बाह्य मैट्रिक्स (इसके बाद 3-डी मैट्रिक्स) को कम कर दिया। उपयोग के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
    नोट: एक शीशी (250,000 कोशिकाओं युक्त) पिघलने पर, 3-डी मैट्रिक्स के 100-200 μL पिघलना।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी या मनका स्नान में इनक्यूबेट करके आईबीसी के पहले क्रायोप्रिजर्व्ड सिंगल-सेल निलंबन की एक शीशी को पिघलाएं जब तक कि कोई दृश्यमान जमे हुए मीडिया (1-2 मिनट) न हो।
  3. एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन जोड़ें।
  4. सेल निलंबन के लिए डीएमईएम / एफ 12 ड्रॉपवाइज के 6-10 एमएल जोड़ें, धीरे से मिश्रण करें, और कोशिकाओं को गोली देने के लिए 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  5. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और पी 1000 माइक्रोपिपेट के साथ बेसल सेल मीडियम के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। एक 10 μL विभाज्य निकालें और एक सेल गिनती प्रदर्शन।
  6. 5 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और पी 1000 माइक्रोपिपेट के साथ पहले पिघलाए गए 3-डी मैट्रिक्स में 4,000 कोशिकाओं / μL के घनत्व पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    नोट: 3-डी मैट्रिक्स में बुलबुले जोड़ने से बचना महत्वपूर्ण है। धीरे-धीरे और सावधानी से मैट्रिक्स पिपेट करें।
  7. एक पी 200 माइक्रोपिपेट के साथ, 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति उपचारित प्लेट के प्रत्येक कुएं के आधार पर एक छोटी बूंद (25 या 50 μL) जोड़ें। यदि 250,000 जमे हुए कोशिकाओं के साथ शुरू होता है, तो इस चरण में बूंदों की अपेक्षित संख्या सेल व्यवहार्यता के आधार पर 3-4 (25 μL बूंदों) के बीच होती है।
  8. लगभग 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं, और फिर 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके छोटी बूंद (50 μL के लिए 1.5 एमएल; 25 μL के लिए 1 एमएल) को पूरी तरह से डुबोने के लिए प्रत्येक कुएं में पर्याप्त बेसल सेल मीडियम जोड़ें। प्लेट को एक आर्द्र इनक्यूबेटर में लौटाएं।
  9. ताजा बेसल सेल माध्यम का उपयोग कर हर 2 दिनों में कोशिकाओं को खिलाएं। 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ अच्छी तरह से किनारे करने के लिए ताजा माध्यम जोड़ें, ध्यान रखना कोशिकाओं की छोटी बूंद परेशान नहीं है।
    नोट: इस चरण में चढ़ाया कोशिकाओं का घनत्व धारा 3 में आईबीसी के नियमित पासिंग की तुलना में 10 गुना अधिक है।

3. 3-डी संस्कृति में स्फेरॉइड का पृथक्करण और आईबीसी का विस्तार

  1. पिघलना (बर्फ पर) 3-डी मैट्रिक्स की पर्याप्त मात्रा। उपयोग के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
    नोट:: आवश्यक 3-डी मैट्रिक्स की मात्रा उपयोगकर्ता की आवश्यकता होगी कितने कक्षों पर भिन्न होगा।
  2. लगभग 5-7 दिन बाद, प्रत्येक कुएं से माध्यम की आकांक्षा करें और पी 1000 माइक्रोपिपेट के साथ, मैट्रिक्स की बूंद से अलग होने के लिए सीधे स्फेरॉइड पर 1 एमएल डिस्पेस द्वितीय (1 यू /
    1. 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
  3. एक पी 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, पिपेट 1-2 बार ऊपर और नीचे डिस्पेज, 3-डी मैट्रिक्स के बड़े गुच्छों को तोड़ते हुए। एक अतिरिक्त 30-40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट लौटें, मैट्रिक्स को पूरी तरह से भंग करने की अनुमति दें।
    1. जब 3-डी मैट्रिक्स की बूंद अब प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई नहीं देती है, तो 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट टिप का उपयोग करके 15 एमएल शंक्वाकार में स्वतंत्र रूप से फ्लोटिंग स्फेरॉइड जोड़ें। एफ 12 प्रति शंक्वाकार 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए जोड़ें और स्फेरॉइड को गोली देने के लिए 3 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र जोड़ें।
  4. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और प्रत्येक प्रारंभिक बूंद के लिए 0.05% ट्रिप्सिन (37 डिग्री सेल्सियस) का 1 एमएल जोड़ें (उदाहरण के लिए, यदि चार बूंदों से शुरू होता है, तो शंक्वाकार फ्लास्क में 4 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें)।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, अक्सर (हर 2-3 मिनट) ट्राइट्यूरेटिंग।
    2. हर कुछ मिनट में प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ मूल्यांकन करें। एक बार जब स्फेरॉइड के बहुमत (>90%) को एकल कोशिकाओं में अलग कर दिया जाता है, तो ट्रिप्सिन में 1: 1 वॉल्यूम अनुपात में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (डीएमईएम /
  5. 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर एक 40 μm सेल छलनी और अपकेंद्रित्र के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।
  6. एक सेल गिनती करें और पिघला हुआ 3-डी मैट्रिक्स के 400 कोशिकाओं / μL के घनत्व पर कोशिकाओं को समान रूप से पुन: निलंबित करें। हवा के बुलबुले पेश करने से बचें। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के लिए आवश्यकतानुसार कई बूंदों को पुन: निलंबित करें। प्रत्येक कुएं के लिए चरण 2.6-2.9 दोहराएं।

4. एनजीएफआर + आईबीसी का मूल्यांकन और शुद्धिकरण

  1. सबसे हालिया मार्ग के 10-14 दिनों के बाद, चरण 3.2-3.5 के रूप में एक एकल सेल निलंबन के लिए स्फेरॉइड को अलग करें और एक सेल गिनती करें।
    नोट: विभिन्न आईपीएससी लाइनें अलग-अलग व्यवहार करती हैं; इसलिए, विभिन्न आईबीसी के लिए 10-14 दिनों की सीमा भिन्न हो सकती है। कृपया 1, 4, 8 और 14 दिनों के बाद 3-डी आईबीसी के विशिष्ट दिखावे के लिए चित्रा 2 देखें, जब वे एनजीएफआर + सेल सॉर्टिंग के लिए पर्याप्त हों। अनुशंसित से पहले सॉर्टिंग (उदाहरण के लिए, चित्रा 2 सी के रूप में दिन 8), कम लगातार एनजीएफआर अभिव्यक्ति के साथ एक समग्र कम सेल संख्या में परिणाम। अनुशंसित की तुलना में बाद में सॉर्टिंग (उदाहरण के लिए, सबसे हालिया मार्ग के 14 दिनों से अधिक) खराब पोस्ट-सॉर्ट सेल अस्तित्व की ओर जाता है।
  2. सॉर्ट बफर (मुख्य जनसंख्या) में 1 x 106 कोशिकाओं/100 μL के घनत्व पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। एक अलग ट्यूब (मामूली आबादी) के लिए एक छोटे विभाज्य (25-50 μL) स्थानांतरण।
    1. मुख्य सेल आबादी में संयुग्मित एंटी-एनजीएफआर एंटीबॉडी (1: 100 कमजोर पड़ने) जोड़ें।
    2. मामूली सेल आबादी के लिए आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी (1: 200 कमजोर पड़ने) जोड़ें।
    3. प्रकाश से कोशिकाओं की रक्षा और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखने, रुक-रुक कर (हर 5-10 मिनट) गोली को रोकने के लिए कोशिकाओं को ट्रिट्यूरेटिंग।
  3. 30 मिनट के बाद, कोशिकाओं के प्रत्येक ट्यूब के लिए एक 1: 1 अनुपात में सॉर्ट बफर जोड़ें। 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  4. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा, 10 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर सॉर्ट बफर में गोली कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और जीवित या मृत सेल दाग जोड़ें।
  5. उपयुक्त एनजीएफआर + गेटिंग रणनीति का उपयोग करना (आइसोटाइप नियंत्रण के आधार पर, चित्रा 3 देखें), आवश्यक डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त लाइव एनजीएफआर + कोशिकाओं को सॉर्ट करें।
    नोट: यदि फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों (यानी, एनकेएक्स 2-1जीएफपी टीपी 63टीडीटोमेटो) के साथ आईबीसी का उपयोग करते हैं, तो उचित गेट चयन और मुआवजे (चित्रा 3) के साथ "ट्रिपल पॉजिटिव" कोशिकाओं (यानी, एनकेएक्स 2-1जीएफपी +, टीपी 63टीडीटोमैटो +, एनजीएफआर +) के लिए सॉर्ट करने की सिफारिश की जाती है। आईबीसी के इस विस्तार के दौरान, कोशिकाओं का एक अनुपात स्रावी कोशिकाओं में अंतर करता है और मल्टीसिलिएटेड कोशिकाओं के बहुत कम अनुपात का भी पता लगाया जा सकता है। ये दोनों आबादी एनजीएफआर-हैं।

5. श्लेष्मा एएलआई संस्कृतियों की पीढ़ी

  1. निर्माता के निर्देश के अनुसार एपिकल चैंबर (मानव भ्रूण स्टेम सेल-योग्य मैट्रिक्स या पुनः संयोजक मानव लैमिनिन -521) में 200 μL मैट्रिक्स जोड़कर 6.5 मिमी झरझरा झिल्ली आवेषण तैयार करें।
    1. जरूरत से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. सम्मिलित करने के एपिकल कक्ष से कोटिंग मैट्रिक्स की आकांक्षा करें। बेसल सेल मीडियम के 500 μL को बेसोलेटरल चैंबर में जोड़ें।
  3. 100-200 μL बेसल सेल मीडियम में कम से कम 30,000 सॉर्ट किए गए एनजीएफआर + कोशिकाओं (चरण 4.5 से) को फिर से निलंबित करें और पी 200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एपिकल चैंबर में स्थानांतरित करें। वांछित (और कोशिकाओं उपलब्ध) के रूप में कई कुओं के लिए दोहराएं। आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
  4. 2-3 दिनों में, एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों की आकांक्षा करें और ताजा बेसल सेल मीडियम (एपिकल के लिए 500 μL, बेसोलेटरल के लिए 100 μL) के साथ फ़ीड करें।
  5. प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ दैनिक एपिकल चैंबर की निगरानी करें। जब कोशिकाएं >80% संगम (आमतौर पर 3-7 दिन) होती हैं, तो बेसल सेल मीडियम को एपिकल और बेसोलेटरल दोनों कक्षों में एएलआई भेदभाव माध्यम (पूर्व-गर्म नहीं) के साथ प्रतिस्थापित करें। अली भेदभाव माध्यम के साथ काम करते समय, पन्नी में लिपटे मीडिया कंटेनरों को रखकर और सक्षम होने पर ओवरहेड रोशनी बंद करके प्रकाश से बचाएं।
  6. अगले दिन, एपिकल चैंबर से माध्यम की आकांक्षा करें, इस प्रकार एपिकल सतह को हवा में उजागर करें।
  7. हर 2-3 दिनों में बेसोलेटरल चैंबर में अली भेदभाव मध्यम मीडिया को बदलें।
    1. हर 1-2 दिनों में संस्कृति उपस्थिति की निगरानी करें। सेल परत को परेशान किए बिना एपिकल चैंबर से किसी भी संचित तरल को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
    2. उपकला अखंडता के लिए ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) का आकलन करें।
      नोट: उपकला परत अखंडता का रीडआउट देने के लिए वायु जोखिम के बाद के दिनों में टीईईआर का मूल्यांकन किया जा सकता है। टीईईआर को मापने का आदर्श समय स्थापित नहीं किया गया है, हालांकि उच्च गुणवत्ता वाले श्लेष्म भेदभाव के अनुरूप मूल्य आमतौर पर >500 एक्स सेमी2 हैं।
    3. यदि मलबे या बलगम को हटाना आवश्यक है, तो एपिकल चैंबर में धीरे-धीरे 100 μL पीबीएस (सीए2 + या एमजी2 + के बिना) जोड़ें। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और फिर ध्यान से पीबीएस आकांक्षा।
    4. हवा के संपर्क के 7-10 दिनों के बाद, मोटाइल सिलिया आमतौर पर दिखाई देता है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है। नियोजित प्रयोग और रीडआउट के आधार पर, हवा के संपर्क के 14-28 दिनों के बाद कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है।
      नोट: यदि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर कोशिकाओं का उपयोग किया गया है, और यदि एक लाइव-सेल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप उपलब्ध है, तो कोशिकाओं को प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ-साथ रिपोर्टर प्रतिदीप्ति के साथ ट्रैक किया जा सकता है।

6. आईबीसी के वैकल्पिक (लेकिन अनुशंसित) क्रायोप्रिजर्वेशन

  1. सबसे हालिया 3-डी संस्कृति मार्ग के 10-14 दिनों के बाद, चरण 3.2-3.5 के रूप में एकल-सेल निलंबन के लिए स्फेरॉइड को अलग करें। एक सेल गिनती करें।
  2. क्रायोवियल में 250,000 कोशिकाओं / 500 μL के घनत्व पर क्रायोप्रेज़र्वेशन मीडियम में पुन: निलंबित।
  3. तापमान (1 डिग्री सेल्सियस / मिनट) में एक स्थिर गिरावट सुनिश्चित करने के लिए एक कंटेनर में क्रायोवियल (एस) रखें और 24-48 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें, इसके बाद दीर्घकालिक भंडारण के लिए -150 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित करें।
    नोट: पहले एनजीएफआर + सॉर्ट की गई कोशिकाओं के क्रायोप्रेज़र्वेशन के साथ-साथ क्रायोप्रेज़र्वेशन को दोहराएं, लेकिन इन्हें सेल व्यवहार्यता और कार्यात्मक एएलआई संस्कृतियों को बनाने की क्षमता के लिए पर्याप्त रूप से मूल्यांकन नहीं किया गया है। विशेष रूप से विस्तारित सेल पासिंग के साथ, कैरियोटाइप के लिए आकलन करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह आईपीएससी और आईपीएससी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में भिन्न होने के लिए नोट किया गया है।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल के बाद, 200,000 क्रायोप्रिजर्व्ड आईबीसी (पहले एक सामान्य 46XY कैरियोटाइप होने की पुष्टि की गई थी)11 को 3-डी संस्कृति में पिघलाया और विस्तारित किया गया था। पांच दिन बाद, परिणामी स्फेरॉइड को अलग कर दिया गया, गिना गया, और आगे के विस्तार के लिए फिर से पारित किया गया। लगभग 480,000 कोशिकाओं को 3-डी मैट्रिक्स (12 x 50 μL बूंदों, घनत्व 400 कोशिकाओं / μL) में प्राप्त और फिर से निलंबित कर दिया गया था। ताजा बेसल सेल मीडियम हर 2-3 दिनों में लागू किया गया था। दस दिन बाद, कोशिकाओं को एक बार फिर से अलग किया गया और गिना गया। कुल 19.7 x 106 कोशिकाओं की कटाई की गई और एफएसीएस के लिए तैयार किया गया। 106 कोशिकाओं को एपीसी-संयुग्मित आईजीजी1ε आइसोटाइप नियंत्रण के साथ दाग दिया गया था और शेष 18.7 x 106 कोशिकाओं को प्रकाश से संरक्षित 30 मिनट के लिए एपीसी-संयुग्मित एंटी-एनजीएफआर एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था (चित्रा 3)।

एनजीएफआर + गेटिंग आइसोटाइप नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना के बाद किया गया था और जानबूझकर उच्चतम व्यक्त एनजीएफआर + कोशिकाओं (चित्रा 3) को इकट्ठा करने के लिए सेट किया गया था। इस गेटिंग तकनीक के साथ, 28% जीवित, एकल कोशिकाएं एनजीएफआर + थीं। जबकि अधिक कोशिकाएं उपलब्ध थीं, डाउनस्ट्रीम संस्कृति के लिए 750,000 कोशिकाओं को एकत्र किया गया था। 50,000 कोशिकाओं को तब प्रत्येक 6.5 मिमी छिद्रपूर्ण झिल्ली डालने पर वरीयता दी गई थी, जिसे निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार मानव पुनः संयोजक लैमिनिन -521 (2 μg / 200 μL) के साथ लेपित किया गया था। 500 μL बेसल सेल मीडियम प्रत्येक डालने के बेसोलेटरल चैंबर में जोड़ा गया था और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्र इनक्यूबेटर में रखा गया था। तीन दिन बाद, एपिकल चैंबर में मीडिया आकांक्षा की गई थी और कोशिकाओं को प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4 बी) द्वारा ~ 90% संगम था। बेसोलेटरल चैंबर से मीडिया आकांक्षा की गई थी; अली भेदभाव माध्यम एपिकल (100 μL) और बेसोलेटरल (500 μL) कक्षों में जोड़ा गया था। अगले दिन, एपिकल चैंबर से मीडिया को आकांक्षा दी गई थी।

निम्नलिखित 21 दिनों में, कोशिकाओं का मूल्यांकन समय-समय पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था और हर 2-3 दिनों में ताजा एएलआई भेदभाव माध्यम (केवल बेसोलेटरल चैंबर) के साथ खिलाया गया था। व्यक्तिगत कोशिकाओं को शुरू में आसानी से पहचाना जा सकता था (चित्रा 4 ए), एक लम्बी और धुरी के आकार की उपस्थिति थी, और एक शिथिल पैक मोनोलेयर (चित्रा 4 बी) का गठन किया। बाद के दिनों से हफ्तों तक, कोशिकाओं ने एक कसकर पैक, अत्यधिक सेलुलर, उपकला परत का गठन किया, और 7-10 दिनों के बाद सिलिया और बलगम उत्पादन की धड़कन का स्पष्ट उद्भव हुआ। नमूनों के टीईईआर की गणना की गई थी और प्राथमिक सेल नियंत्रण (700-1600 से एक्स सेमी2) Ω समान थी। कैनोनिकल वायुमार्ग उपकला सेल मार्करों के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड और इम्यूनोलेबलिंग के साथ बाद के निर्धारण (दिन 21-28) एमयूसी 5 एसी और एसिटिलेटेड-α-ट्यूबुलिन के लिए किया गया था, दूसरों के बीच (चित्रा 4 सी)। कुल मिलाकर, मोटाइल सिलिया, बलगम उत्पादन के साथ-साथ मल्टीसिलिएटेड और स्रावी कोशिकाओं के पुष्टिकरण इम्यूनोस्टेनिंग के हमारे अवलोकन के साथ, जो प्राथमिक एचबीईसी के समान है, हमने निष्कर्ष निकाला कि हमने प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल के समग्र योजनाबद्ध। झरझरा झिल्ली आवेषण पर चढ़ाना से पहले क्रायोप्रिजर्व्ड आईबीसी को पिघलाया जाता है, विस्तारित किया जाता है, और एफएसीएस शुद्ध किया जाता है, जहां वे एक कार्यात्मक श्लेष्म उपकला में अंतर करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों। प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां (ए) 1 दिन, (बी) 4 दिन, (सी) 8 दिन, और (डी) 14 दिन (सिर्फ पूर्व-एनजीएफआर सॉर्ट) के बाद 3-डी संस्कृति में आईबीसी की सामान्य उपस्थिति का प्रदर्शन करती हैं। स्केल पट्टियाँ 500 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि एफएसीएस भूखंड। गैर-रिपोर्टर और फ्लोरोसेंट-रिपोर्टर आईबीसी के लिए प्रतिनिधि एफएसीएस भूखंड। आइसोटाइप नियंत्रण के उदाहरण दिखाए गए हैं और उच्चतम व्यक्त एनजीएफआर + कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए उपयोग किए गए थे। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर युक्त आईपीएससी लाइनें एनकेएक्स 2-1जीएफपी + टीपी 63टीडीटोमैटो + एनजीएफआर + कोशिकाओं के लिए "ट्रिपल सॉर्ट" हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: झरझरा झिल्ली पर आईबीसी संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवियां। चरण विपरीत छवियों को चढ़ाना के बाद (ए) 1 दिन और (बी) 3 दिन दिखाया गया है। (सी) में दिखाए गए श्लेष्म संस्कृतियों के प्रतिनिधि इम्यूनोलेबलिंग; एसिटिलेटेड-अल्फा ट्यूबुलिन (हरा) और एमयूसी 5 एसी (लाल)। स्केल पट्टियाँ 25 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: मीडिया घटक तालिका। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एचबीईसी वायुमार्ग उपकला के रोगों का अध्ययन करने के लिए स्वर्ण-मानक सेल-प्रकार हैं। उनकी सीमाओं (आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए पहुंच और कठिनाई सहित) के कारण, हमने आईबीसी और एएलआई संस्कृतियों की व्युत्पत्ति के लिए एक प्रोटोकॉल उत्पन्न किया है। इन कोशिकाओं को किसी भी दाता से प्राप्त किया जा सकता है और उनकी अनूठी आनुवंशिक पृष्ठभूमि को बनाए रखा जा सकता है, इस प्रकार बुनियादी विकास अध्ययन, रोग मॉडलिंग और उपन्यास चिकित्सीय विकास की अनुमति मिलती है।

जबकि वर्णित प्रोटोकॉल का प्रत्येक व्यक्तिगत चरण आवश्यक है, ऐसे कई हैं जो अतिरिक्त उल्लेख के लायक हैं। सबसे पहले, प्रत्येक चरण में जिसमें एकल कोशिकाओं में स्फेरॉइड के पृथक्करण की आवश्यकता होती है, अत्यधिक पाइपिंग से बचना महत्वपूर्ण है; एंजाइमेटिक पाचन (विघटन या ट्रिप्सिन के साथ) बेहतर कोशिका अस्तित्व को बढ़ावा देता है, जबकि अत्यधिक पाइपिंग महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु की ओर जाता है। दूसरे, एनजीएफआर + आईबीसी को शुद्ध करते समय, आइसोटाइप नियंत्रण का उपयोग महत्वपूर्ण है और हम एफएसीएस (चित्रा 3) के साथ उच्चतम व्यक्त एनजीएफआर + कोशिकाओं के लिए चयन करने की सलाह देते हैं। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप उपयुक्त श्लेष्म भेदभाव के साथ इष्टतम एएलआई संस्कृतियां होती हैं। अंत में, प्रोटोकॉल में प्रलेखित छिद्रपूर्ण झिल्ली की तैयारी और बोना एएलआई संस्कृति अस्तित्व के लिए मौलिक है। जबकि हम आम तौर पर प्रति सम्मिलित 30,000-60,000 कोशिकाओं को बीज देते हैं, हमें 20,000 कोशिकाओं के साथ सफलता मिली है। जबकि सफल संस्कृतियों को मानव भ्रूण स्टेम सेल-योग्य मैट्रिक्स कोटिंग का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है, हमने हाल ही में एएलआई संस्कृतियों के काफी अधिक स्थायित्व के साथ मानव पुनः संयोजक लैमिनिन -521 का उपयोग किया है।

बहुत कम ही, आईपीएससी भेदभाव एनजीएफआर + आईबीसी के पर्याप्त प्रतिशत को अपग्रेड करने में विफल हो सकता है। इस उदाहरण में, आईबीसी (3-डी संस्कृति में) के सीरियल पासिंग के परिणामस्वरूप समय के साथ एनजीएफआर आवृत्ति में वृद्धि हो सकती है। इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में इन कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय, लागत और विशेषज्ञता शामिल है। इसके अतिरिक्त, हम मानते हैं कि कई शोधकर्ता वायुमार्ग उपकला (जैसे, आयनोसाइट्स, न्यूरोएंडोक्राइन कोशिकाओं) के कम सामान्य सेल प्रकारों में रुचि रखते हैं। जबकि हमने इनमें से कुछ दुर्लभ सेल प्रकारों का पता लगाया है, जैसा कि प्राथमिक एचबीईसी संस्कृतियों में है, वे पुनरुत्पादनशील रूप से पहचाने नहीं जाते हैं, संभवतः इन कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक विकासात्मक संकेतों के बारे में अधूरे ज्ञान के कारण।

जैसा कि लिखा गया है, उपरोक्त प्रोटोकॉल पहले से ही क्रायोप्रिजर्व्ड आईबीसी के पिघलने के साथ शुरू होता है। इस क्रायोप्रेज़र्वेशन से पहले के विवरण पहले वर्णित हैं और इस पांडुलिपि11,12 के दायरे से परे हैं।

हमारे वायुमार्ग उपकला एएलआई संस्कृति विधि लगभग किसी भी दाता से कार्यात्मक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। यह बहुमूल्य आनुवंशिक रूप से नियंत्रित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं तक पहुंच को बहुत बढ़ाता है जिसका उपयोग रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, भविष्य के सेल-आधारित उपचारों के साथ-साथ वायुमार्ग उपकला के भीतर विकासात्मक पैटर्निंग की समझ में सुधार करने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

हम हॉकिन्स, कोटन और डेविस प्रयोगशालाओं के सदस्यों को इस और अन्य परियोजनाओं के बारे में वर्षों से उनके सहायक इनपुट के लिए धन्यवाद देते हैं। हम अपने समर्पण और तकनीकी विशेषज्ञता के लिए ब्रायन टिल्टन (बीयू सेल सॉर्टिंग डायरेक्टर) के भी ऋणी हैं, और हम बोस्टन यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर रीजनरेटिव मेडिसिन (सीआरईएम) के ग्रेग मिलर और मैरिएन जेम्स के आभारी हैं, जो रोगी-विशिष्ट आईपीएससी के रखरखाव और लक्षण वर्णन में उनके समर्थन और तकनीकी विशेषज्ञता के लिए हैं, एनआईएच अनुदान एनओ 1 75 एन 9 2020 सी00005 और यू01टीआर0001810 द्वारा समर्थित है। यह काम एनआईएच अनुदान यू01एचएल148692, यू01एचएल134745, यू01एचएल134766 और आर01एचएल095993 से डीएनके, आर01एचएल139876 से बीआरडी, आर01 एचएल139799 से एफएच और सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (सीएफएफ) अनुदान सीएफएफ 0098 जी 220 और सीएफएफ वांग द्वारा समर्थित था और सीएफएफ हॉकिन 20 एक्सएक्स 2 से एफ.एच.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well tissue culture treated plate Corning 3515 flat bottom
3-D growth factor reduced Matrigel Corning 356230
A83-01 ThermoFisher Scientific 293910
Cell culture inserts (Transwell) Corning 3470 6.5mm diameter; 0.4μm pore size
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Dispase II, Powder ThermoFisher Scientific 17105-041
DMH1 ThermoFisher Scientific 412610
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 ThermoFisher Scientific 11330-032
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) Gibco 14190-144
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) Sigma E7889
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher SH3007003E
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175-079
HEPES Sigma H3375
hESC-qualified Matrigel Corning 354277
Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated Biolegend 400122
Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated Biolegend 345108
PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) StemCell Technologies 05001
PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) StemCell Technologies 05040
Primocin InvivoGen ant-pm-2
rhLaminin-521 ThermoFisher Scientific A29248 Final Concentration: 10ug/mL
Trypsin-EDTA Solution, 0.05% Invitrogen T3924
Y-27632 Tocris 1254

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 184
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से वायुमार्ग उपकला सेल एयर-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों की पीढ़ी
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Berical, A., Beermann, M. L.,… More

Berical, A., Beermann, M. L., Suzuki, S., LeSuer, J., Matte, T., Davis, B., Kotton, D., Hawkins, F. Generation of Airway Epithelial Cell Air-Liquid Interface Cultures from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63882, doi:10.3791/63882 (2022).

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