Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

زراعة الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية والتلاعب بها وراثيا

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

تعيش الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية في تكافل مع البكتيريا ومعا تصيب الحشرات بنجاح عن طريق تقويض جهاز المناعة الفطري لديها. لتعزيز البحوث على الأساس الجيني لعدوى الديدان الخيطية ، يتم وصف طرق للحفاظ على الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية ومعالجتها وراثيا.

Abstract

الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية في الأجناس Heterorhabditis و Steinernema هي طفيليات ملزمة للحشرات التي تعيش في التربة. السمة الرئيسية لدورة حياتها هي الارتباط المتبادل مع البكتيريا Photorhabdus و Xenorhabdus ، على التوالي. طفيليات الديدان الخيطية قادرة على تحديد موقع ودخول مضيفات الحشرات المناسبة ، وتخريب الاستجابة المناعية للحشرة ، والتكاثر بكفاءة لإنتاج الجيل التالي الذي سيطارد بنشاط فريسة حشرات جديدة للإصابة. نظرا لخصائص دورة حياتها ، فإن الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية هي عوامل مكافحة بيولوجية شائعة ، والتي تستخدم في تركيبة مع المبيدات الحشرية للسيطرة على الآفات الحشرية الزراعية المدمرة. وفي الوقت نفسه، تمثل هذه الديدان الخيطية الطفيلية أداة بحثية لتحليل إمراض الديدان الخيطية واستضافة الاستجابات المضادة للديدان الخيطية. ويساعد هذا البحث من خلال التطور الأخير للتقنيات الوراثية والنهج النسخية لفهم دور جزيئات الديدان الخيطية التي تفرز أثناء العدوى. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل حول الحفاظ على الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية واستخدام إجراء ضربة قاضية للجينات. وتعزز هذه المنهجيات التوصيف الوظيفي لعوامل عدوى الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية.

Introduction

تكثفت الأبحاث حول الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية (EPN) على مدى السنوات القليلة الماضية ويرجع ذلك في المقام الأول إلى فائدة هذه الطفيليات في استراتيجيات الإدارة المتكاملة للآفات ومشاركتها في البحوث الطبية الحيوية الأساسية 1,2. وقد أثبتت الدراسات الحديثة EPN ككائنات حية نموذجية لفحص المكونات الوراثية للديدان الخيطية التي يتم تنشيطها خلال المراحل المختلفة من عملية العدوى. توفر هذه المعلومات أدلة مهمة على طبيعة وعدد الجزيئات التي تفرزها الطفيليات لتغيير فسيولوجيا المضيف وزعزعة استقرار الاستجابة المناعية الفطرية للحشرة 3,4. في الوقت نفسه ، تستكمل هذه المعرفة عادة بتفاصيل جديدة حول نوع مسارات الإشارات المناعية لمضيف الحشرات والوظائف التي تنظمها لتقييد دخول وانتشار مسببات الأمراض 5,6. يعد فهم هذه العمليات أمرا بالغ الأهمية لتصور جانبي التفاعل الديناميكي بين EPN ومضيفيها من الحشرات. ومما لا شك فيه أن التقدير الأفضل للعلاقة بين مضيف الحشرات EPN والحشرات سيسهل إجراء دراسات مماثلة مع الديدان الخيطية الطفيلية للثدييات ، مما قد يؤدي إلى تحديد وتوصيف عوامل العدوى التي تتداخل مع جهاز المناعة البشري.

يمكن أن تصيب الديدان الخيطية EPN Heterorhabditis sp. و Steinernema sp. مجموعة واسعة من الحشرات ، وقد تمت دراسة بيولوجيتها بشكل مكثف سابقا. يختلف الطفيليان الخيطيان في طريقة تكاثرهما مع التهاب الهيتيرورابديتيس الذي يتم تخصيبه ذاتيا ويخضع شتاينرنما للتكاثر البرمائي ، على الرغم من أنه ثبت مؤخرا أن S. hermaphroditum يتكاثر عن طريق الإخصاب الذاتي للخنثى أو من خلال التوالد العذري 7,8,9. فرق آخر بين التهاب الديدان الخيطية Heterorhabditis و Steinernema هو تبادلهما التكافلي مع جنسين متميزين من البكتيريا سالبة الجرام ، Photorhabdus و Xenorhabdus ، على التوالي ، وكلاهما من مسببات الأمراض القوية للحشرات. تم العثور على هذه البكتيريا في مرحلة الأحداث المعدية الحية وغير المتغذية (IJ) من EPN ، والتي تكتشف المضيفين الحساسين ، والوصول إلى هيموكول الحشرات حيث تطلق البكتيريا المرتبطة بها التي تتكاثر بسرعة ، وتستعمر أنسجة الحشرات. ينتج كل من EPN والبكتيريا الخاصة بهم عوامل ضراوة تنزع سلاح دفاعات الحشرات وتضعف التوازن. بعد موت الحشرات ، تتطور الديدان الخيطية IJs لتصبح EPN بالغا وتكمل دورة حياتها. ظهرت أخيرا مجموعة جديدة من IJs التي تشكلت استجابة للحرمان من الطعام والاكتظاظ داخل جثة الحشرات في التربة لاصطياد المضيفين المناسبين9،10،11،12.

هنا ، يتم وصف بروتوكول فعال للحفاظ على نيماتودا EPN وتضخيمها ومعالجتها وراثيا. على وجه الخصوص ، يحدد البروتوكول تكرار H. bacteriophora و S. carpocapsae IJs التكافلية ، وتوليد الديدان الخيطية المحورية IJs ، وإنتاج H. bacteriophora hermaphrodites للحقن المجهري ، وإعداد dsRNA ، وتقنية الحقن المجهري. هذه الطرق ضرورية لفهم الأساس الجزيئي لإمراض الديدان الخيطية ومناعة المضيف المضادة للديدان الخيطية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنتاج الأحداث الديدان الخيطية التكافلية المعدية

  1. غطي طبق بتري (10 سم) بقطعة من ورق الترشيح وأضف ما يقرب من 10-15 يرقات غاليريا ميلونيلا (الشكل 1 أ).
  2. باستخدام ماصة ، قم بتوزيع 2 مل من الماء الذي يحتوي على حوالي 25-50 IJs لكل تعليق 10 ميكرولتر على ديدان الشمع. قم بتخزين طبق بتري في خزانة في درجة حرارة الغرفة.
  3. اعتمادا على رطوبة ورق الترشيح ، أضف 1-2 مل من الماء كل يومين. عادة ما تموت ديدان الشمع المصابة ب IJs في غضون 48 ساعة.
  4. قم بإعداد مصائد المياه في وايت بعد حوالي 10 أيام من إصابة ديدان الشمع ب IJs8 (الشكل 1B ، C). انقل الحشرات الميتة بعناية إلى الجزء غير المنقوع من ورقة الترشيح. استخدم ماء الصنبور لملء طبق بتري السفلي ووضع غطاء لأنبوب 15 مل كفاصل للتهوية.
  5. انقل ديدان الشمع الناعمة والهشة بعناية عن طريق رفعها ببطء من ورق الترشيح باستخدام زوج من الملقط البلاستيكي. استخدم مياه الصنبور بدلا من المياه منزوعة المعادن أو منزوعة الأيونات. هذا الأخير يسبب تراكم الديدان الخيطية.
    1. تأكد من أن مستوى الماء في مصيدة الماء يصل إلى نصف ارتفاع طبق بتري تقريبا. توقع أن يتغير مستوى الماء بمرور الوقت اعتمادا على ظروف درجة الحرارة والرطوبة في الغرفة.
  6. عندما يصبح الماء في طبق بتري الصغير غائما بسبب وجود الديدان الخيطية ، استخدم ماصة لنقل الجيل الجديد من IJs إلى قارورة زراعة الخلايا T25 أو T75.
  7. أضف ماء الصنبور حتى حوالي 40٪ من الحجم حتى يتم الوصول إلى الكثافة المناسبة (الشكل 1C). تجنب احتقان الديدان الخيطية وتخزين قوارير زراعة الخلايا أفقيا.
  8. أضف المزيد من الماء إلى طبق بتري السفلي وكرر الخطوتين 1.6 و 1.7 حتى تتوقف IJs عن الخروج من جثث الحشرات في حوالي 3-5 أيام.

2. إنتاج الأحداث النيماتودا المعدية المحورية

ملاحظة: تستخدم الديدان الخيطية المحورية لأنه بعد انفصال مركب الديدان الخيطية والبكتيريا داخل الحشرة ، يثير كل شريك متبادل استجابة مناعية متميزة للمضيف5. يتم استخدام السلالة الطافرة Ret16 من Photorhabdus temperata لأن هذه البكتيريا تدعم نمو H. bacteriophora ولكنها تفشل في استعمار الأمعاء الخيطية13,14.

  1. Heterorhabditis bacteriophora الأحداث المعدية
    1. باستخدام طرف ماصة معقم أو ملعقة ، قم بكشط عدة رقائق من ثقافة مجمدة من P. temperata Ret16 على لوحة MacConkey وخط لمستعمرات واحدة. احتضن اللوحة لمدة 2-3 أيام عند 28 درجة مئوية.
    2. قم بتلقيح 10 مل من مرق LB مع مستعمرة في أنبوب 50 مل واحتضن الثقافة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية في حاضنة تهتز. استخدم فقط مستعمرات المرحلة الأولية الحمراء على MacConkey agar. ستكون مستعمرات المرحلة الثانوية بيضاء اللون على MacConkey agar.
    3. اغسل 100 ميكرولتر من الثقافة الليلية باستخدام 900 ميكرولتر من 1x PBS عن طريق الطرد المركزي في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل عند 17,900 × جم. ديكان السوبرناتانت. تمييع الثقافة 10x في 1x PBS. اترك الأنبوب على الثلج.
    4. اغمر ديدان الشمع في محلول إيثانول بنسبة 70٪ ، وجفف الحشرات بمنشفة ورقية ، وضعها في أنبوب سعة 50 مل.
    5. ضع الأنبوب على الجليد لمدة 20 دقيقة لشل حركة ديدان الشمع.
    6. استخدم ورقة ترشيح لتغطية النصفين العلوي والسفلي لطبق بتري (10 سم). استخدم غطاء طبق بتري المغطى بورق الترشيح كدعم أساسي للحقن. بلل ورقة الترشيح الخاصة بطبق بتري السفلي وانقلها على الثلج لمساعدة ديدان الشمع المحقونة على التعافي.
    7. ماصة 50 ميكرولتر من البكتيريا الباردة على قطعة من البارافيلم وإعداد حقنة إبرة 22 G. اضغط على المكبس بلطف لإزالة الهواء عند طرف الإبرة.
    8. احتفظ بدودة الشمع بالقرب من الطرف الخلفي تحت المنظار المجسم (الشكل 2).
    9. حقن 50 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية في الجانب الظهري من الصدر ، ويفضل أن يكون ذلك عند التقاطع بين جزأين. لتقليل الضرر الداخلي ، حقن تحت البشرة مباشرة ، بالتوازي مع دودة الشمع قدر الإمكان. من الطبيعي أن تنزف قطرة من الهيموليمف عندما يتم ثقب دودة الشمع
    10. نقل الحشرات المحقونة إلى طبق بتري الانتعاش.
    11. كرر الخطوات 2.1.7-2.1.9 حتى يتم حقن جميع الحشرات بالبكتيريا. لتخدير الحشرات ، ضعها على الجليد لمدة 5 دقائق.
    12. ضع طبق بتري في الظلام (على سبيل المثال، درج أو خزانة) وأضف ماء الصنبور إلى ورقة الترشيح إذا بدا جافا. سوف تستسلم ديدان الشمع بعد يومين من الحقن ، وتظهر حمراء من الطوب بعد حوالي 3-4 أيام. إذا ظهرت الحشرات بنية اللون ، فإن العدوى البكتيرية لم تنجح.
    13. في 7 أيام بعد الإصابة ، انقل الحشرات ذات اللون الأحمر المميز من الطوب إلى طبق بتري جديد مبطن بورق الترشيح ، واستمر في "إنتاج الأحداث المعدية للديدان الخيطية التكافلية" من الخطوة 1. في حالة استخدام الديدان الخيطية التكافلية، كرر الإجراء من الخطوة 2.1. باستخدام IJs المنتجة حديثا من الجولة الأولى.
    14. تعقيم سطح H. bacteriophora IJs
      1. جمع ما يكفي من H. bacteriophora التكافلية و IJs المحورية المرشحة عن طريق الطرد المركزي لصنع بيليه 100 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي 1.5 مل.
      2. أضف 500 ميكرولتر من المبيض بنسبة 5٪ إلى الكريات في كل أنبوب طرد مركزي دقيق وعكسه. احتضان لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 17,900 × g لمدة 1 دقيقة. إزالة supernatant.
      3. اغسل الكريات ب 1 مل من الماء المعقم وكرر الطرد المركزي. إزالة supernatant. كرر هذه الخطوة أربع مرات أخرى.
    15. التحقق من المحورية
      1. ماصة 400 ميكرولتر من الماء المعقم إلى الديدان الخيطية التكافلية المغسولة والمرشحة H. bacteriophora.
      2. ضع الديدان الخيطية فوق الحشرات في طبق بتري وقم بتسمية العلاجات وفقا لذلك.
      3. ضع أطباق بتري مع الحشرات المصابة في الظلام وتحقق بشكل دوري مما إذا كانت ديدان الشمع تتحول إلى اللون الأحمر.
        ملاحظة: سوف تصبح ديدان الشمع المصابة بالديدان الخيطية التكافلية H. bacteriophora حمراء في غضون 2 أيام من الإصابة. يرجع تغير لون دودة الشمع إلى إفراز مركبات مختلفة تنتجها بكتيريا Photorhabdus المتبادلة أثناء عملية العدوى. عدم وجود اللون الأحمر في ديدان الشمع المصابة بعد 4 أيام من الإصابة يؤكد أن H. bacteriophora هي axenic. وذلك لأن بكتيريا P. temperata Ret16 غير موجودة في أمعاء الديدان الخيطية.
    16. طريقة بديلة للتحقق من المحورية
      1. تعقيم السطح H. bacteriophora IJs التكافلية و H. bacteriophora IJs المرشحة كما هو موضح في الخطوة 2.1.14.
      2. تجانس ما يقرب من 500 IJs في 500 ميكرولتر من 1x PBS المعقمة في أنابيب microfuge باستخدام المدقات المعقمة. قم بتدوير المتجانس ، وصب السوبرناتانت ، وانشره على LB agar. احتضن الألواح عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
      3. عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) لكل لوحة. لن تشكل العينات المأخوذة من بكتيريا H. bacteriophora المحورية أي مستعمرات لبكتيريا P. luminescens التكافلية.
  2. Steinernema carpocapsae الأحداث المعدية
    1. تحضير ألواح أجار الدهون (محلول 300 مل يجعل حوالي 20 لوحة مقسمة)
      1. يزن 2.4 غرام من مرق المغذيات ، و 4.5 غرام من مستخلص الخميرة ، و 1.5 غرام من الأجار وإضافتها إلى 267 مل من الماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف الحل.
      2. أضف 3 مل من 1 م مج كل 2 و1.2 مل من زيت الذرة و 28.8 مل من شراب الذرة 7٪.
      3. تحضير وإضافة إلى الحل 300 ميكرولتر من 30 ملغ / مل كاناميسين و 300 ميكرولتر من 50 ملغ / مل أمبيسلين (معقم مع مرشح 0.2 ميكرومتر).
      4. ضعي المزيج على نصف طبق بتري مقسم/طبق مقسم.
    2. تحضير X. نيماتوفيلا (سلالة ΔrpoS) العشب البكتيري
      1. الثقافة X. نيماتوفيلا (Xn) ΔrpoS مباشرة من مخزون بكتيري مجمد في 2 مل من محلول LB / kan / amp على شاكر عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      2. قم بتلقيح 5 مل من وسط LB يحتوي على 30 ميكروغرام / مل كاناميسين و 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين مع 250 ميكرولتر من الثقافة الليلية وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها على شاكر.
        ملاحظة: لا تنمو بكتيريا Xn بشكل جيد عند خطها مباشرة على وسائط أجار دهنية مختارة من مخزون مجمد. إذا لزم الأمر ، يمكن تأكيد المرحلة الأولية والثانوية Xn أولا على وسائط NBTA (أجار المغذيات المكملة ب 25 ملغ من البروموثيمول الأزرق l−1 و 40 ملغ من كلوريد ثلاثي فينيل تترازوليوم l−1) قبل البدء في زراعة سائلة طازجة.
      3. ماصة 100 ميكرولتر من الثقافة على لوحات أجار الدهون وتنتشر على اللوحة بأكملها مع حلقة تلقيح معقمة. احتضن الألواح لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية.
    3. تعقيم السطح S. carpocapsae IJs
      1. اترك قارورة تحتوي على IJs بزاوية بحيث تغرق IJs في زاوية من القارورة. استنشاق 1 مل من IJs المستقرة في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير. جهاز طرد مركزي عند 17,900 × g لمدة 10 ثوان. إزالة supernatant.
      2. أضف 1 مل من محلول التبييض الطازج بنسبة 1٪. عكس الأنابيب لتخلط جيدا. احتضان لمدة 1 دقيقة (حضانة التبييض لفترات طويلة سوف تؤدي إلى وفاة IJ). تدور مرة أخرى لمدة 10 ثوان إزالة supernatant.
      3. لإزالة بقايا التبييض ، اغسل الديدان الخيطية ب 1 مل من الماء المقطر المعقم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثوان. كرر الغسيل أربع مرات أخرى.
      4. تقدير عدد IJ لكل مل عن طريق حساب 10-20 ميكرولتر من IJs المغسولة تحت المنظار المجسم وضبط تركيز IJs وفقا لذلك.
    4. تربية S. carpocapsae IJs
      1. انقل باستخدام ماصة حوالي 1000 IJs إلى ألواح تقسيم أجار الدهون (الشكل 3 ، الصورة اليسرى). ضع الألواح في خزانة أو درج مبلل. استخدم مناشف ورقية مبللة لزيادة الرطوبة. الحفاظ على الألواح في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية).
      2. تحقق من المناشف الورقية كل يومين للتأكد من بقائها رطبة. إذا لزم الأمر ، أضف الماء كل يومين إلى المناشف الورقية للحفاظ على الرطوبة في الخزانة أو الدرج. بدلا من ذلك ، ضع حماما مائيا في الجزء السفلي من الخزانة لزيادة الرطوبة.
      3. عندما تظهر IJs فقط ، أضف الماء إلى الجانب الآخر من اللوحة ، وضع طبقة من ورق الترشيح عبر منتصف اللوحة (مصيدة الماء ، الشكل 3 ، الصورة اليمنى). اجمع هذه المياه التي تحتوي على الجولة الأولى من IJs في قارورة زراعة خلايا T75. هذه هي الديدان الخيطية الجولة الأولى S. carpocapsae.
      4. قم بتعقيم السطح باستخدام المبيض (الخطوة 2.2.3) مرة أخرى وكرر العملية من الخطوة 2.2 باستخدام الديدان الخيطية Round 1 S. carpocapsae. ستكون النتيجة الجولة 2 S. كاربوكابسي الديدان الخيطية.
      5. تحقق تحت منظار مجسمة كل بضعة أيام لتتبع تطور الديدان الخيطية.
    5. التحقق من الحالة المحورية ل S. carpocapsae IJs
      1. قم بتعقيم سطح الجولة 1 والجولة 2 و S. carpocapsae IJs التكافلية باستخدام المبيض كما هو موضح في الخطوة 2.2.3.
      2. تجانس ما يقرب من 400-700 IJs في أنابيب microfuge باستخدام مدقات بلاستيكية معقمة. الطرد المركزي المتجانسة، صب supernatant، ونشر الحل على لوحات أجار LB. احتفظ بألواح الأجار في حاضنة عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
      3. عد تشكيل CFU لكل لوحة. العينات من الديدان الخيطية axenic لن تنتج أي نمو بكتيري.
    6. التحقق من الحالة المحورية ل S. carpocapsae IJs بواسطة PCR
      1. قم بتعقيم سطح الجولة 1 والجولة 2 و S. carpocapsae IJs التكافلية باستخدام المبيض كما هو موضح في الخطوة 2.2.3.
      2. استخراج الحمض النووي من التجانس. يتم وصف إجراء استخراج مفصل في القسم 4.1.2 أدناه.
      3. إجراء PCR باستخدام الاشعال XptA2 مع درجة حرارة التلدين 61 درجة مئوية:
        إكسبتا F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
        إكسبتا R: 5′-GTAAGACCAAGGCACTCC-3′.
        ملاحظة: تعمل هذه الاشعال على تضخيم الجين المبيد للحشرات XptA2 من X. nematophila ، مما ينتج عنه مضخم بحجم 231 نقطة أساس. كان برنامج ركوب الدراجات على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، و 34 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ودرجة حرارة التلدين 61 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 73 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      4. تصور الشظايا المضخمة عن طريق الفصل في هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪. لن تشكل العينات المعقمة على السطح Axenic أي نطاقات.

3. رفع H. البكتيريا خنثى للحقن المجهري

  1. تحضير أطباق بتري 6 سم مع NA + chol (1.5x مرق المغذيات ، 1.5 ٪ أجار ، و 10 ميكروغرام / مل من الكوليسترول).
  2. تحضير 3 مل من محلول PP3 (2٪ بيرتياز الببتون # 3 ، PP3) في أنبوب زراعة 10 مل.
  3. استخدم طرف معقم 20 ميكرولتر لكشط الجزء العلوي من مخزون الجلسرين P. luminescens (25٪ vol / vol glycerol المعقم) الذي يتم الحفاظ عليه عند -80 درجة مئوية وإسقاطه في أنبوب الثقافة.
  4. احتضن الأنبوب بين عشية وضحاها في شاكر يتم التحكم في درجة حرارته عند 28 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة.
  5. في اليوم التالي ، ستكون الثقافة حمراء فاتحة اللون. طبق 50 ميكرولتر من المزرعة على طبق بتري 6 سم NA + chol Petri وانشره باستخدام موزع بكتيري بطريقة دائرية.
  6. ضع الألواح في حاضنة 28 درجة مئوية. سيكون العشب P. luminescens جاهزا في 24-36 ساعة وسيظهر باللون الأحمر الفاتح.
  7. قم بتلقيح اللوحة ب 50-100 IJs معقمة على السطح والحفاظ على اللوحة عند 28 درجة مئوية.
  8. سيبدأ خنثى L4 الصحي في الظهور بعد حوالي 48-54 ساعة من التلقيح. مطلوب صحية ، غير جائعة في وقت متأخر L4 H. البكتيريا الخنثى للحقن.

4. إعداد dsRNA

  1. تصميم التمهيدي
    1. تصميم الاشعال ل dsRNA لاستهداف ~ 500 منطقة إكسون زوج قاعدة من الحمض النووي H. bacteriophora.
      1. يمكن تحديد الاشعال للمناطق ذات الأهمية باستخدام Primer3 (https://primer3.ut.ee) أو برنامج مماثل ، واختيار طول المنتج الأمثل من 500 زوج أساسي ، Tm من 60 درجة مئوية ، وطول التمهيدي من 22 نيوكليوتيدات.
      2. أضف موقع T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) إلى نهايات 5 ′ لكل تمهيدي أمامي للسماح بالنسخ في المختبر.
  2. عزل الحمض النووي الجينومي
    1. استخدم الحمض النووي الجينومي المعزول من الكريات المجمدة التي تبلغ حوالي 50000 H. bacteriophora IJs لتخليق dsRNA.
    2. استخدم حبيبة IJ المعاد تعليقها في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (50 mM KCl ، 0.05٪ (w / v) الجيلاتين ، 10 mM Tris-HCl pH 8.2 ، 0.45٪ Tween 20 ، 60 ميكروغرام / مل Proteinase K ، 2.5 mM MgCl2) وضعت عند -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    3. تجانس الكريات مع مدقة أنبوب صغير.
    4. قم بتسخين المحلول إلى درجة حرارة الغرفة واحتضنه عند 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ، مع دوامة كل 15 دقيقة.
    5. قم بتشويه Proteinase K عن طريق احتضان الأنسجة المتجانسة لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
    6. قم بتبريد العينة إلى 4 درجات مئوية وجهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 1 دقيقة.
    7. استخدم supernatant الناتج كقالب ل PCR اللاحق.
    8. قم بإعداد تفاعل PCR 50 ميكرولتر باستخدام مزيج رئيسي تجاري مع 200 نانوغرام من الحمض النووي للقالب ، و 0.2 ميكرومتر من التمهيدي الأمامي والخلفي ، وظروف ركوب الدراجات المقترحة من الشركة المصنعة.
    9. قم بتحليل تفاعل PCR على هلام الأغاروز بنسبة 1.2٪ للتحقق من أن التفاعلات أنتجت نطاقات مفردة من الحجم المتوقع.
  3. تركيب الحمض النووي الريبوزي المرسال
    1. استخدم مجموعة نسخ تجارية.
    2. استخدم تفاعل PCR 5 ميكرولتر للنسخ في المختبر. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
    3. احتضن التفاعل لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    4. قم بتنظيف تفاعلات النسخ في المختبر باستخدام مجموعة تجارية باستخدام أسيتات الأمونيوم / هطول الأمطار الإيثانول لتركيز dsRNA.
    5. dsRNA الحبيبي في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
    6. حدد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    7. تقييم الجودة عن طريق فصل dsRNA على هلام الأغاروز بنسبة 1.2٪

5. الحقن المجهري

ملاحظة: وسادة الحقن عبارة عن غطاء زجاجي مع طبقة من 2٪ (ث / v) من الأغاروز في الوسط. عندما يتم نقل الديدان المراد حقنها إلى هذه الفوط ، فإن طبقة الأغاروز ستشل حركتها لهذا الإجراء. عادة ، يتم الاحتفاظ منصات إضافية بالقرب من المجهر للاستخدام العام.

  1. تحضير وسادة الحقن
    1. تغلي 2٪ من الأغاروز في الماء بإضافة 0.2 غرام من الأغاروز إلى 10 مل من الماء.
    2. ضع 1-4 قطرات (~ 50 ميكرولتر) في وسط غطاء زجاجي رفيع 50 مم × 70 مم.
    3. استخدم غطاء آخر لتسطيح القطرة.
    4. اترك الغطاء يجف لمدة 2-3 دقائق قبل أن ينزلق الغطاء جانبيا.
    5. ضع علامة "R" على الجانب الأيمن من الغطاء المواجه لأعلى.
    6. دع الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 يوم قبل استخدامها.
  2. تحضير إبر الحقن
    1. استخدم شعيرات دموية زجاجية مقاس 1.0 مم تحتوي على خيوط دقيقة داخلية. هذا يسمح بملء الإبرة بكفاءة.
      ملاحظة: يمكن استخدام أي أداة سحب إبرة تجارية (على سبيل المثال، Narishige PB-7).
    2. قم بتشغيل مجتذب الإبرة.
    3. تأكد من ضبط السخان على الحد الأقصى وضبط الملف اللولبي على 8.40 لضمان حدة الإبرة المطلوبة والطول المناسب.
    4. أدخل الأنبوب الشعري في حافة المقبض العلوي من خلال الخيوط وشد المقبض العلوي. سيكون الجزء العلوي من الأنبوب الشعري مستويا مع الجزء العلوي من مجتذب الإبرة وستكون خيوط التسخين في منتصف الشعيرات الدموية.
    5. حرك الوحدة السفلية إلى الأعلى ثم شد المقبض السفلي. تأكد من وضع الشعيرات الدموية بشكل آمن.
    6. أغلق غطاء مجتذب الإبرة واضغط على زر البدء. سيتم تشغيل الضوء الأخضر. بعد بضع دقائق سيتم تسخين الشعيرات الدموية وسحبها بعيدا لفصلها إلى نصفين.
      ملاحظة: الإبرتان المنفصلتان ليستا بنفس الطول، ولكن يمكن استخدامهما في الحقن. يفضل نقاط إبرة أطول.
    7. رتب الإبر في وضع رأسي مع نقاطها لأسفل باستخدام قطعة من طين النمذجة. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الإبر في طبق بتري مثبت في مكانه بواسطة شريطين من طين النمذجة.
  3. تحميل الإبرة
    ملاحظة: يجب طرد محلول الحمض النووي مركزيا لمدة 10 دقائق على الأقل عند 20,784 × جم لحبيبات الشوائب التي قد تكون موجودة في التعليق. الطرد المركزي للشوائب يمنعها من منع تدفق إبرة الحقن.
    1. استخدم أي من الطريقتين لتحميل الأحماض النووية في الإبر.
    2. الطريقة 1
      1. استخدم ماصة لنقل ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي بالطرد المركزي إلى الطرف غير المسحوب من إبرة الحقن. سيظهر هذا كقطرة صغيرة من السائل تجلس فوق الأنبوب الشعري.
      2. قف لمدة 5 إلى 7 دقائق للسماح للعينة السائلة باحتلال نهاية الإبرة. سيكون المنتج النهائي إبرة مملوءة بدون وجود فقاعات هواء.
      3. استخدم مجهر التشريح للتأكد من وجود محلول في طرف الإبرة قبل الحقن.
    3. الطريقة 2
      1. استخدم نصائح التحميل للحاقن الدقيق.
      2. باستخدام طرف التحميل هذا ، ماصة 5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي.
      3. أثناء وجود الإبرة المسحوبة على مجتذب الإبرة ، قم بفك المقبض العلوي ، وحرك الإبرة العلوية المسحوبة لأعلى قليلا ، وأعد تشديد المقبض.
      4. أدخل طرف اللودر بعناية في الأنبوب الشعري ومدده إلى أسفل إبرة الحقن.
      5. ماصة محلول الحمض النووي في إبرة الحقن.
      6. قم بإزالة اللودر من الإبرة المسحوبة وابقيه منفصلا لمزيد من التحميل، إذا لزم الأمر. تأكد من تبديل اللوادر عند تحميل مزيج مختلف من الأحماض النووية.
  4. تحضير مجهر الحقن
    ملاحظة: يتم استخدام مجهر مقلوب مع إضاءة منتشرة من قاعدة المجهر لإعداد الديدان والحقن المجهري والاسترداد. يتم وصف استخدام المجهر المقلوب عالي الدقة مع أهداف 10x و 40x. تم تجهيز المجهر بمناور إبرة يحمل الإبرة ويضعها في موضعها للحقن. يستخدم زيت الحقن المجهري لمنع الدودة من الجفاف السريع أثناء وجودها على طبقة الأغاروز من وسادة الحقن. النفط المقترح استخدامه هو زيت الهالوكربون 700.
    1. قم بتشغيل المصباح ومعايرة السطوع باستخدام لوحة التحكم.
    2. تحقق من الرقم الموجود على منشور Wollaston المكثف ؛ سوف يتوافق مع الهدف المستخدم (40x).
    3. تأكد من أن برج DIC ، الذي يتميز ب "DIC" ، في الموضع الصحيح.
    4. تأكد من ضبط المقبض الموجود على الهدف عند صفر (0).
    5. أدر حلقة الأس الهيدروجيني إلى اليمين حتى النهاية.
    6. اضبط المستقطب بطريقة تجعل السهم في وضع أفقي.
    7. ضع قطعة من الورق على المسرح لمراقبة النقطة البؤرية (الضوء).
    8. أغلق الحجاب الحاجز الميداني لدرجة وجود بقعة على الورق.
    9. استخدم القرص الموجود على اليسار لتحريك المكثف لأعلى ولأسفل إلى النقطة التي تظهر فيها بقعة ضوء حادة جدا على الورق المقطع.
    10. افتح الحجاب الحاجز الحقلي ببطء حتى تصبح دائرة صغيرة من الضوء مرئية.
    11. خذ قطعة الورق بعيدا.
    12. تأكد من أن بقعة الضوء في مركز الهدف. خلاف ذلك ، اصطف بقعة الضوء مع مركز الهدف عن طريق ضبط مسامير الفضة في الجزء العلوي من المكثف.
    13. افتح الحجاب الحاجز الحقلي بالكامل.
    14. تحقق من الضغط على محلل ICT/P.
  5. تركيب إبرة الحقن على المجهر
    1. قم بتشغيل تدفق غاز النيتروجين إلى إبرة الحقن المجهري. سيكون ضغط الغاز على الإبرة حوالي 20 رطل لكل بوصة مربعة.
    2. تحقق من وضع مقابض micromanipulator (جزء المجهر الذي يحرك الإبرة) في المركز ، مما يسمح بأوسع نطاق من الحركة عند تركيب الإبرة.
    3. قم بفك التجميع الذي يحمل القضيب المعدني لإزالته من حامل الإبرة.
    4. أدخل الإبرة الجديدة في الجزء العلوي من المجهر ؛ ثم قم بتثبيت الحشية المطاطية للحفاظ على الإبرة في موضعها.
    5. قم بتأمين الجزء السفلي من حامل الإبرة عن طريق تركيبه في التجميع.
    6. ضع الإبرة في الأخدود على المتلاعب الدقيق وقم بتثبيتها بشكل صحيح للحفاظ على ثباتها. تأكد من أن المسمار حوالي 1 بوصة من نهاية المتلاعب الصغير.
    7. ضع طرف الإبرة في منتصف المجال البصري بزاوية 45 درجة تقريبا فيما يتعلق بلوحة المسرح ، باستخدام المقابض وعناصر التحكم الخشنة من المتلاعب الدقيق. من الأهمية بمكان ترك طرف الإبرة مرتفعا بما فيه الكفاية حتى لا ينكسر عن طريق الصدفة.
  6. كسر الإبر
    1. ضع الإبرة في المناور الدقيقة حيث ينكسر طرف الإبرة عادة للسماح لمحلول الحمض النووي بالتدفق من خلاله.
    2. كسر الشعيرات الدموية ووضعها فوق شريحة زجاجية تحمل قطرة من زيت الحقن المجهري.
    3. ضع الشريحة على المجهر وركز عليها.
    4. اجعل طرف الإبرة إلى نفس مستوى جانب الشعيرات الدموية باستخدام عناصر التحكم الدقيقة في المجهر (الشكل 4).
    5. قم بتشغيل تدفق النيتروجين لفترة وجيزة باستخدام مشغل القدم للتأكد من عدم كسر طرف الإبرة. يكفي التشغيل السريع.
    6. حرك الإبرة بلطف بحيث بالكاد تلمس جانب الشعيرات الدموية.
    7. اضغط على جانب المجهر برفق لكسر طرف الإبرة.
    8. قم بإزالة الإبرة من الشعيرات الدموية وقم بتشغيل تدفق النيتروجين للتحقق من كسر الإبرة بشكل صحيح.
    9. ستخلق الإبرة قطرة حقن صغيرة أكبر بخمس مرات تقريبا من طرف الإبرة (الشكل 4). إذا كانت قطرة الحقن أصغر حجما ، فقم بكسر الطرف أكثر. إذا كانت قطرة الحقن أكبر حجما ، فحاول استخدام إبرة جديدة.

6. الحقن المجهري

  1. ماصة قطرة من زيت الحقن المجهري على وسادة الحقن.
  2. اغمس قطفا معقما باللهب في قطرة زيت الحقن المجهري وجمع H الصغير. الديدان الخيطية البكتيرية البالغة من اللوحة.
  3. اختر الديدان الخيطية من أجزاء اللوحة التي ليست قريبة من العشب البكتيري لمنع نقل أعداد كبيرة من الخلايا البكتيرية إلى وسادة الحقن. أيضا ، حصاد الديدان الخيطية مع الغدد التناسلية جيدة التشكيل.
  4. حرك الديدان الخيطية إلى وسادة الحقن وضعها عموديا بحيث تواجه الغدد التناسلية الإبرة. تأكد من أن الفرج يشير إلى نفس اتجاه إبرة الحقن ، وأن ذراعي الغدد التناسلية البعيدتين في الاتجاه المعاكس وأعلى ضد جدار جسم الديدان الخيطية.
    ملاحظة: مثل Pristionchus pacificus ، تهاجر الغدد التناسلية ل H. bacteriophora ظهريا من وضع الفرج البطني ثم تهاجر مرة أخرى إلى الوضع البطني.
  5. تأكد من أن كمية الزيت كافية لمنع جفاف الديدان الخيطية دون السماح للديدان الخيطية بالتجول.
  6. اجعل الديدان الخيطية في بؤرة التركيز مع هدف 10x عن طريق تثبيت الإبرة فوق الشريحة. في النفط ، ينظر إلى الغدد التناسلية الخيطية على أنها منطقتان واضحتان بالقرب من الأمامي والخلفي للدودة. تأكد من أن الغدد التناسلية في بؤرة التركيز وليس الأجزاء الأخرى من الدودة.
  7. رتب الديدان الخيطية بزاوية 15 درجة إلى 45 درجة نحو إبرة الحقن ، مما سيعطي مساحة أكبر للإبرة داخل الغدد التناسلية. أيضا ، يمنع هذا النهج الإبرة من المرور عبر جسم الديدان الخيطية بالكامل عند إدخال الإبرة داخل الغدد التناسلية.
  8. ضع إبرة الحقن والديدان الخيطية على نفس المستوى عن طريق خفض الإبرة تدريجيا حتى يتم التركيز عليها (الشكل 5). تأكد من أنه عند خفض الإبرة ، فإنها تظل بجوار الديدان الخيطية وليس فوق الدودة.
  9. استخدم هدف 40x للتركيز على ذراع الغدد التناسلية المخلوية للديدان الخيطية.
  10. حرك الإبرة لأعلى ولأسفل باستخدام الضابط الدقيق حتى يصبح الطرف في بؤرة التركيز مع ذراع الغدد التناسلية المخلوية الخيطية.
  11. حرك الديدان الخيطية ببطء نحو الإبرة باستخدام مرحلة الانزلاق. ثم ادفع الغدد التناسلية بلطف إلى وضعها بالإبرة ضد جدار جسم الديدان الخيطية ، مما سيؤدي إلى اختراق الإبرة الفعال داخل جسم الديدان الخيطية.
  12. خطوة لفترة وجيزة على المحرك القدم لبدء تدفق محلول الحمض النووي. التشغيل السريع يكفي. إذا كانت الإبرة داخل الغدد التناسلية ، فسوف تمتلئ الغدد التناسلية بالمحلول وتنتفخ.
  13. بمجرد التأكد من الإبرة في الموضع الصحيح ، املأ الغدد التناسلية بمحلول الحمض النووي حتى يتم ملء أذرع الغدد التناسلية. من المهم تجنب طرد السائل من الدودة من خلال الثقب الذي ثقبته الإبرة.
  14. باستخدام المرحلة المنزلقة ، حرك الدودة بعناية بعيدا عن الإبرة.
  15. ارفع الإبرة وقلبها عكس اتجاه عقارب الساعة.
  16. ضع قطرة من المخزن المؤقت PBS 1x فوق الدودة لجعلها تطفو.
  17. استخدم القطيفة المعقمة باللهب لرفع الدودة ووضعها في قطرة أخرى من M9 على طبق جديد من بذور P. luminescens لتخليص الدودة من الزيت الزائد.
  18. قم بإزالة الديدان الخيطية من M9 وضعها على الجانب البعيد من العشب البكتيري.
  19. استخدم نفس اللوحة لنقل العديد من الديدان الخيطية المحقونة.
  20. في غضون 2-3 أيام ، قم بتقييم الجيل الأول (F1) من الديدان الخيطية للنمط الظاهري المعدل وراثيا. افصل الديدان الخيطية F1 المعدلة وراثيا على صفائح فردية لتحديد الديدان التي ستولد خطوطا معدلة وراثيا مستقرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتقييم حالة الديدان الخيطية H. bacteriophora التي مرت عبر الأكسينية ، تم تحديد وجود أو عدم وجود مستعمرات بكتيرية P. luminescens في IJs. للقيام بذلك ، تم جمع حبيبة من حوالي 500 IJs التي تم تعقيمها مسبقا وتجانسها في PBS. تألفت المعالجة الضابطة الإيجابية من حبيبة من حوالي 500 IJs من مزرعة الديدان الخيطية التي تحتوي على بكتيريا P. luminescens التكافلية. تم تجانس كريات الديدان الخيطية المحورية والتحكم الإيجابي في 1x PBS. تم ماصة المتجانسات على الآجار وانتشرت لتسهيل نمو المستعمرات الفردية. تم تحضين ألواح الأجار عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، لوحظ حدوث مستعمرات P. luminescens (CFU). كما هو متوقع ، حملت H. bacteriophora من ثقافة المخزون خلايا P. luminsecens التكافلية. ومع ذلك ، كانت الديدان الخيطية الخالية من بكتيريا P. luminecens المرتبطة بها محورية وتخزينها بشكل منفصل للتجريب المستقبلي (الشكل 6).

تم استخدام ضربة قاضية للتعبير الجيني nol-5 كمثال لإظهار فعالية الحمض النووي الريبي باستخدام عملية الحقن المجهري. تم إجراء الحقن المجهري في الجيل الأبوي ولوحظ التأثير في ذرية F1. أدى هدم nol-5 باستخدام الحقن المجهري RNAi إلى عدم وجود خط جرثومي في الغدد التناسلية ل 60٪ من النسل (الشكل 7).

Figure 1
الشكل 1: توليد الأحداث المعدية (مرحلة العيش الحر من الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية ). (أ) عدوى يرقات الحشرات Galleria mellonella (المحفوظة في طبق بتري) مع الأحداث المعدية الديدان الخيطية (المحفوظة في قارورة زراعة الأنسجة). (ب) طي قطعة من ورق الترشيح لإعداد مصيدة مياه. (ج) ترتيب فخ مائي للديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية مع يرقات حشرات غاليريا ميلونيلا الميتة التي تحتوي على أحداث معدية (بعد 12 يوما من الإصابة بالديدان الخيطية). سيترك الجيل الجديد من الأحداث المعدية الحشرات الميتة وينتقل إلى الماء ، الذي يتم تخزينه بعد ذلك في قارورة زراعة الأنسجة. يتم إنشاء الصور باستخدام برنامج رسومات BioRender (https://biorender.com). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: حقن يرقات الحشرات غاليريا ميلونيلا مع سلالة البكتيريا Photorhabdus temperata Ret16. يتم الاحتفاظ بديدان الشمع في طبق بتري ، ويتم تجميدها من خلال العلاج البارد (أي يتم وضعها على الجليد لبضع دقائق). يتم ضغط الجزء الخلفي من جسم الحشرة بزوج من الملقط لإنشاء سطح متورم مناسب للحقن. زاوية الحقن ضحلة لمنع إصابة أنسجة الحشرات الداخلية ، مما قد يؤدي إلى موت الحشرات بسبب التعامل مع الإهمال. يتم إنشاء الصور باستخدام برنامج رسومات BioRender (https://biorender.com). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توليد الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية Steinernema axenic . يحتوي نصف طبق بتري مقسم على حديقة من بكتيريا Xenorhabdus nematophila ΔrpoS على أجار الدهون والأحداث المعدية من الديدان الخيطية S. carpocapsae. هذه الطريقة في المختبر تحفز الأحداث المعدية على أن يصبحوا ديدان خيطية بالغة ، والتي ستنتج لاحقا بيضا يفقس ليؤدي إلى ظهور جيل جديد من الطفيليات. عندما يظهر عدد كبير من الأحداث المعدية S. carpocapsae التي تم إنشاؤها حديثا في هذا الجزء من طبق Petri المقسم ، يضاف الماء إلى النصف الآخر من الطبق مع قطعة من ورق الترشيح لتسهيل هجرة الديدان الخيطية. يتم إنشاء الصور باستخدام برنامج رسومات BioRender (https://biorender.com) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: كسر طرف الإبرة. عادة ما يتم إغلاق طرف الإبرة. يتم فحص التدفق السليم لمحلول الحمض النووي قبل إجراء الحقن الفعلي. على شريحة زجاجية ، ضع قطرة من زيت الهالوكربون. ضع أنبوبا شعريا ، يستخدم لصنع الإبرة ، عموديا كما هو موضح في الشكل. اجعل الشعيرات الدموية تركز على 40x واخفض الإبرة بلطف في المستوى باستخدام الشعيرات الدموية. المس بلطف طرف الإبرة إلى الشعيرات الدموية. هذا يخلق فتحة للتدفق السلس ل dsRNA. إذا لم يخرج أي سائل ، فقم بإجراء تدفق سريع للنيتروجين أثناء التشغيل باستخدام مشغل القدم. الضغط من النيتروجين وملامسة طرف الإبرة مع الشعيرات الدموية سيكسر الإبرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: موقع الحقن. تهاجر الغدد التناسلية ل H. bacteriophora ظهريا من وضع الفرج البطني ثم تهاجر مرة أخرى إلى الوضع البطني. تعبر الأذرع المهاجرة بعضها البعض بالقرب من الفرج وتمتد إلى ما وراء الفرج على كلا الجانبين. في حوالي 48 ساعة ، يمكن رؤية الأذرع الممتدة للغدد التناسلية لشاب بالغ ، نمت من IJ ، بالقرب من الفرج. يتم إجراء الحقن المجهري في هذا الموقف. شريط الميزان: 0.1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التحقق من صحة التهاب البكتريا غير المتجانسة . تم تقدير نجاح إجراء الأكسينات من خلال تأكيد عدم وجود خلايا بكتيرية Photorhabdus luminescens في الأحداث المعدية H. bacteriophora المعالجة. لهذا ، تم تجانس حبيبة من حوالي 500 دودة معقمة سطحيا من مزرعة المخزون (التكافلي) أو الديدان التي خضعت لعملية الأكسينية (axenic). بعد ذلك ، تم نشر المتجانس على ألواح أجار وبعد حضانة 24 ساعة ، تم رصد ظهور المستعمرات البكتيرية (وحدات تشكيل المستعمرة ، CFU). يشير نقص المستعمرات البكتيرية على الألواح إلى أن الديدان الخيطية H. bacteriophora خالية من بكتيريا P. luminescens التكافلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: الحمض النووي الريبي بوساطة ضربة قاضية لجين nol-5. ينتج عن الضربة القاضية بوساطة الحمض النووي الريبي لجين H. bacteriophora nol-5 نمط ظاهري بدون خط جرثومي. تحتوي ذرية النوع البري ، الديدان الخيطية H. bacteriophora غير المحقونة (أ) على بيض في الغدد التناسلية. ذرية من النوع البري ، nol-5 RNAi حقن H. البكتيريا الخيطية (ب) لا يحتوي على بيض في الغدد التناسلية الفارغة بسبب ضربة قاضية من الحمض النووي الريبي nol-5. شريط الميزان: 0.1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتطلب فهم الأساس الجزيئي لعدوى الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية والمناعة المضادة للنيماتودا الحشرية فصل الطفيليات عن البكتيريا المرتبطة بالتبادلية13،15،16. تعيش الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية H. bacteriophora و S. carpocapsae جنبا إلى جنب مع البكتيريا سالبة الجرام P. luminescens و X. nematophila ، على التوالي17. وقد ثبت سابقا أن كلا النوعين البكتيريين يشفران العوامل التي تمنح الإمراض من خلال استهداف أنسجة الحشرات ومواجهة الجهاز المناعي الفطري أثناء العدوى18,19. وهذا يعيق الجهود المبذولة لتحديد الاستراتيجيات التي طورتها الديدان الخيطية للتفاعل مع مضيف الحشرات. لذلك ، يمكن تسهيل التحديد والتوصيف الوظيفي من خلال الضربة القاضية الجينية لمكونات الديدان الخيطية التي تشارك أيضا في عملية العدوى عن طريق توليد الديدان المحورية. هنا ، يتم تقديم بروتوكولات فعالة لإنتاج الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية المحورية وإجراء إسكات جين RNAi في H. bacteriophora.

ومن الخطوات الحاسمة في كلا البروتوكولين لتوليد الديدان الخيطية المحورية بنجاح التعقيم السطحي ل H. bacteriophora و S. carpocapsae IJs14,20. يتضمن هذا الجزء من الطريقة معالجة الديدان بمحلول التبييض ويعتبر حاسما لنجاح عملية الأكسينات لأنه يزيل بكتيريا P. luminescens و X. nematophila من بشرة الديدان الخيطية. هذا إجراء مهم لضمان إزالة البكتيريا المتبادلة فقط على سطح الديدان وليس تلك الموجودة داخل الطفيليات. يتطلب إكمال هذه الخطوة الاهتمام لأن علاج التبييض الممتد سيؤثر على بقاء الديدان الخيطية.

ومن أوجه التشابه بين بروتوكول الأكسينات الحالي للديدان الخيطية S. carpocapsae مع طريقة محددة مسبقا استخدام البكتيريا الطافرة X. nematophila ΔrpoS التي لا تستطيع استعمار الديدان21. الفرق بين المنهجية الحالية والبروتوكول الذي تم الإبلاغ عنه سابقا ، والذي أدخل بيض الديدان الخيطية المعقمة السطحية على أجار المغذيات22 ، هو إضافة المضادات الحيوية إلى وسائط الثقافة لمنع التلوث الميكروبي الذي من المحتمل أن يؤثر على نمو الديدان الخيطية واللياقة البدنية.

RNAi عن طريق الحقن المجهري هو وسيلة سهلة وموثوقة لتوصيل الحمض النووي الريبي إلى البويضات. يوفر انفجار السائل داخل الغدد التناسلية تأكيدا مرئيا لإطلاق محلول الحمض النووي أثناء عملية الحقن. وقد تبين أن الحمض النووي الريبي عن طريق الحقن المجهري أفضل بكثير من الحمض النووي الريبي عن طريق النقع. ربما يرجع ذلك إلى قدرة محلول RNAi على الوصول إلى البويضات التي هي في مراحل مختلفة من التمايز داخل الغدد التناسلية.

أثناء تحسين العملية ، يوصى باختبار تركيزات مختلفة من محلول الحمض النووي الريبي للحصول على نتائج أفضل. تم اختبار تركيزات مختلفة من الحمض النووي الريبي تتراوح من 50 نانوغرام / ميكرولتر إلى 10 ميكروغرام / ميكرولتر. وقد وجد أن تركيز 6 ميكروغرام/ميكرولتر يعمل بشكل أفضل من التركيزات الأخرى. لزيادة إنتاجية الحمض النووي الريبي خلال خطوة النسخ في المختبر ، تم تعديل البروتوكول من فترة حضانة مدتها 4 ساعات إلى 16 ساعة. وأدى ذلك إلى زيادة كبيرة في العائد النهائي للحمض النووي الريبي. أحد العوامل الرئيسية لنجاح الحقن المجهري هو مقدار الوقت الذي تقضيه الديدان الخيطية على وسادة الحقن. يؤدي الوقت الأقل إلى وجود نيماتودا صحية على قيد الحياة وذرية صحية مع زيادة فرصة مراقبة النمط الظاهري المقصود.

يعد البروتوكول الحالي لزراعة الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية والتلاعب بها وراثيا مساهمة كبيرة للدراسات المستقبلية في مجالات علم النيماتولوجيا وعلم المناعة والتفاعلات بين الطفيليات المضيفة. سيؤدي الجمع بين النهج التي تسمح بالتلاعب بالديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية إلى اكتشاف العوامل الوراثية التي تحدد التفاعل بين جزيئات مستجيب الديدان الخيطية ومكونات الإشارات المناعية المضيفة التي تشفر العوامل ذات الخصائص المضادة للديدان الخيطية. وسيحدد كذلك المكونات الجزيئية الرئيسية للديدان الخيطية التي تحدد العلاقة التكافلية مع البكتيريا ذات الصلة. الإجابة على هذه الأسئلة مهمة لتحسين الممارسات الزراعية وتطوير وسائل جديدة للسيطرة على الديدان الخيطية الطفيلية البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نشكر أعضاء قسم العلوم البيولوجية في جامعة جورج واشنطن على القراءة النقدية للمخطوطة. تم إجراء جميع الأشكال الرسومية باستخدام BioRender. بحث في I. E.، J. H.، و D. O'H. تم دعم المختبرات من قبل جامعة جورج واشنطن والكلية الكولومبية للفنون والعلوم لتسهيل الأموال وصناديق البحوث متعددة التخصصات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
  3. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  4. Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
  5. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  6. Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
  7. Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
  8. Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
  9. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
  10. Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
  11. Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
  12. Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
  13. Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
  14. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
  15. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
  16. Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
  18. Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
  19. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
  20. Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
  21. Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
  22. McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 181 ، الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية ، التهاب الهيتيررابديت ، النيما الشتاينيرية ، التطفل ، التفاعلات بين الطفيليات المضيفة والطفيليات
زراعة الديدان الخيطية المسببة للأمراض الحشرية والتلاعب بها وراثيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heryanto, C., Ratnappan, R.,… More

Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter