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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

培养和遗传操纵昆虫致病线虫

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

昆虫致病线虫与细菌共生，它们通过破坏其先天免疫系统成功地感染昆虫。为了促进线虫感染的遗传基础研究，描述了维持和遗传操纵昆虫致病线虫的方法。

Abstract

异形体炎和施泰纳尼马属的昆虫致病性线虫是生活在土壤中的昆虫的专性寄生虫。它们生命周期的主要特征是分别与细菌光环菌和异蕊花虫的互利性关联。线虫寄生虫能够定位并进入合适的昆虫宿主，破坏昆虫的免疫反应，并有效地繁殖，产生下一代将积极捕食新的昆虫猎物进行感染。由于其生命周期的特性，昆虫病原线虫是流行的生物控制剂，与杀虫剂结合使用以控制破坏性的农业害虫。同时，这些寄生线虫代表了分析线虫致病性和宿主抗线虫反应的研究工具。这项研究得到了最近开发的遗传技术和转录组学方法的帮助，这些方法用于了解线虫分泌分子在感染过程中的作用。这里提供了维持昆虫致病性线虫和使用基因敲低程序的详细方案。这些方法进一步促进了致虫性线虫感染因子的功能表征。

Introduction

在过去几年中，对昆虫致病线虫（EPN）的研究已经加强，这主要是由于这些寄生虫在综合虫害管理策略中的实用性以及它们参与基础生物医学研究1，2。最近的研究已经建立了EPN作为模式生物，在其中检查在感染过程的不同阶段激活的线虫遗传成分。这些信息提供了关于寄生虫分泌的分子的性质和数量的关键线索，这些分子改变了宿主的生理学并破坏了昆虫先天免疫反应的稳定性3，4。同时，这些知识通常由昆虫宿主免疫信号通路的类型及其调节功能以限制病原体进入和传播的新细节来补充5，6。了解这些过程对于设想EPN与其昆虫宿主之间动态相互作用的双方至关重要。更好地理解EPN-昆虫宿主关系无疑将促进与哺乳动物寄生线虫的类似研究，这可能导致识别和表征干扰人体免疫系统的感染因素。

EPN线虫 异性带炎 属和 斯坦尼玛 属可以感染多种昆虫，其生物学以前已被深入研究。两种线虫寄生虫的繁殖方式不同， 异性粒体炎 是自我受精的， 斯坦纳尼马 经历两栖生殖，尽管最近雌 雄同体 被证明通过雌雄同体的自受精或通过单性生殖7，8，9来繁殖。 异形体炎 和 斯坦纳尼马 线虫之间的另一个区别是它们与两个不同的革兰氏阴性细菌属，分别是 光环菌 和 异桔梗，它们都是昆虫的有效病原体。这些细菌在EPN的自由生活和非进食感染性幼年（IJ）阶段被发现，它们检测易感宿主，进入昆虫血液，在那里它们释放快速复制的相关细菌，并定植昆虫组织。EPN及其细菌都产生毒力因子，解除昆虫防御并损害体内平衡。在昆虫死亡后，线虫IJ发育成成年EPN并完成其生命周期。为了应对食物匮乏和昆虫尸体内的过度拥挤而形成的一个新的IJ队列最终出现在土壤中，以寻找合适的宿主9，10，11，12。

这里描述了用于维持，扩增和遗传操纵EPN线虫的有效方案。特别是，该协议概述了共生 细菌杆菌 和 卡波囊 链球菌IJ的复制，轴烯线虫IJ的产生，用于显微注射的 细菌 雌雄同体的产生，dsRNA的制备以及显微注射技术。这些方法对于了解线虫致病性和宿主抗线虫免疫的分子基础至关重要。

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Protocol

1.共生线虫感染性幼体的产生

  1. 用一张滤纸盖住培养皿（10厘米），加入约10-15 个梅氏 菌幼虫（图1A）。
  2. 使用移液管，将每10μL悬浮液中含有约25-50 IJs的2mL水分配到蜡虫上。将培养皿在室温下储存在柜中。
  3. 根据滤纸的水分，每2天加入1-2毫升水。感染IJ的蜡虫通常会在48小时内死亡。
  4. 在蜡虫感染IJ8 后约10天准备怀特水捕获器（图1B，C）。小心地将死去的昆虫转移到滤纸的未浸泡部分。使用自来水填充底部培养皿，并放置一个15 mL管的盖子作为通风垫片。
  5. 使用一对塑料镊子将柔软易碎的蜡虫从滤纸上慢慢提起，小心地转移蜡虫。使用自来水代替软化或去离子水。后者引起线虫聚集。
    1. 确保疏水阀中的水位达到培养皿高度的一半左右。预计水位会随着时间的推移而变化，具体取决于房间的温度和湿度条件。
  6. 当小培养皿中的水由于线虫的存在而变得浑浊时，使用移液器将新一代IJ移动到T25或T75细胞培养瓶中。
  7. 将自来水加入至体积的约40%，直到达到适当的密度（图1C）。避免线虫充血，水平存放细胞培养瓶。
  8. 向底部培养皿中加入更多水，重复步骤1.6和1.7，直到IJ在大约3-5天内停止从昆虫尸体中出现。

2.产生轴质线虫感染性幼鱼

注意：使用轴烯线虫是因为在虫体内线虫 - 细菌复合物解离后，每个互利伴侣都会引发不同的宿主免疫反应5。使用 温带光 子的突变菌株Ret16是因为这些细菌支持 细菌芽孢杆菌 的生长，但未能在线虫肠道中定植13，14。

  1. Heterorhabditis bacteriophora 感染性青少年
    1. 使用无菌移液器吸头或刮刀，将几片冷冻培养物的 蛋黄鹦 鹉Ret16刮到MacConkey板上，并条纹为单个菌落。将板在28°C下孵育2-3天。
    2. 接种10mLLB肉汤，在50mL管中培养菌落，并将培养物在振荡培养箱中于28°C孵育过夜。仅使用麦康基琼脂上呈红色的初级相菌落。第二相菌落在麦康基琼脂上将是灰白色的。
    3. 通过在1.5 mL微量离心管中以17，900× g离心，用900μL 1x PBS洗涤100μL过夜培养物。倾析上清液。在1x PBS中稀释培养物10倍。将管子放在冰上。
    4. 将蜡虫浸入70%乙醇溶液中，用纸巾干燥昆虫，然后将其放入50 mL管中。
    5. 将管子放在冰上20分钟以固定蜡虫。
    6. 使用滤纸覆盖培养皿的上半部分和下半部分（10厘米）。使用覆盖有滤纸的培养皿盖作为注射的基础支撑。润湿底部培养皿的滤纸并在冰上转移以帮助注射的蜡虫恢复。
    7. 将50μL冰冷的细菌移液到一块石蜡膜上，并准备22G针头注射器。轻轻按压柱塞以除去针尖处的空气。
    8. 将蜡虫靠近立体镜下的后端（图2）。
    9. 将50μL细菌培养物注入胸部背侧，优选在两段之间的交界处。为了尽量减少内部损伤，在角质层下方注射，尽可能与蜡虫平行。当蜡虫被刺穿时，血淋巴液滴自然会流血
    10. 将注射的昆虫转移到恢复培养皿中。
    11. 重复步骤2.1.7-2.1.9，直到所有昆虫都注射细菌。为了麻醉昆虫，将它们放在冰上5分钟。
    12. 将培养皿放在黑暗中（例如抽屉或橱柜），如果滤纸看起来干燥，则向滤纸中加入自来水。蜡虫在注射后2天会屈服，大约3-4天后出现砖红色。如果昆虫呈棕色，则细菌感染不成功。
    13. 在感染后7天，将具有特征砖红色的昆虫转移到新鲜的滤纸衬里培养皿上，然后从步骤1继续“共生线虫感染幼体”。如果使用共生线虫，请重复步骤2.1中的步骤。使用第一轮新生产的IJ。
    14. 表面灭菌 细菌嗜好杆菌 IJs
      1. 通过离心收集足够的共生 细菌H.菌团 和候选轴性IJ，以在1.5mL离心管中制造100μL沉淀。
      2. 向每个微量离心管中的沉淀中加入500μL 5%漂白剂并反转。孵育10分钟。以17，900 x g 离心1分钟。取出上清液。
      3. 用1 mL无菌水洗涤沉淀并重复离心。取出上清液。再重复此步骤四次。
    15. 验证轴性
      1. 将400μL无菌水移液到洗涤的共生和候选轴 烯H.细菌 线虫中。
      2. 将线虫放在培养皿中的昆虫上，并相应地标记处理。
      3. 将装有受感染昆虫的培养皿放在黑暗中，并定期检查蜡虫是否变红。
        注意：感染 细菌互 生线虫的蜡虫将在感染后2天内变红。蜡虫变色是由于在感染过程中由互利 光 子菌产生的各种化合物的分泌。感染后4天感染的蜡虫中缺乏红色，证实 细菌 杆菌是轴胛的。这是因为 假单胞菌 Ret16细菌不存在于线虫肠道中。
    16. 验证轴性的替代方法
      1. 如步骤2.1.14中所述，表面灭菌共生 细菌 HJs和候选轴 化细菌H.细菌II 。
      2. 使用无菌杵在微量离心管中，在 500 μL 无菌 1x PBS 中匀浆约 500 IJs。旋转匀浆，倾析上清液，然后将其涂抹在LB琼脂上。将板在28°C孵育24小时。
      3. 计算每个板的菌落形成单位（CFU）。来自 轴烯细菌 菌的样品不会形成共生发光假单 胞菌 的任何菌落。
  2. Steinernema carpocapsae 传染性青少年
    1. 脂质琼脂平板的制备（300 mL溶液可形成约20个分体板）
      1. 称取2.4克营养肉汤，4.5克酵母提取物和1.5克琼脂，并将它们加入267毫升去离子水中。高压灭菌溶液。
      2. 加入3毫升1m氯化镁2，1.2毫升玉米油和28.8毫升7%玉米糖浆。
      3. 制备并加入300μL30mg / mL卡那霉素和300μL 50mg / mL氨苄西林（用0.2μm过滤器灭菌）的溶液中。
      4. 将混合物倒入分成培养皿/分盘的一半。
    2. 嗜线虫（菌株ΔrpoS）细菌草坪的制备
      1. 直接从冷冻的细菌库存中培养 嗜线菌（Xn）ΔrpoS ，在30°C的振荡器上将2mL LB / kan / amp溶液中过夜。
      2. 接种5mL含有30μg/ mL卡那霉素和50μg/ mL氨苄西林的LB培养基与250μL过夜培养物，并在振荡器上生长细菌过夜。
        注意：当直接从冷冻储液中选择脂质琼脂培养基上划线时，Xn细菌不能很好地生长。如有必要，可以首先在NBTA培养基（营养琼脂补充25mg溴乙悸醇蓝l−1和40mg三苯基氯化四唑氯化物l-1）上确认一期和二级Xn，然后再开始新鲜液体培养。
      3. 在脂质琼脂平板上移液100μL培养物，并用无菌接种环在整个板上撒布。将板在30°C下孵育24小时。
    3. 表面灭菌 的 卡波卡普萨伊 氏菌 IJs
      1. 将装有IJ的烧瓶保持在一定角度，使IJ沉到烧瓶的一角。将1mL沉降的IJ吸入微量离心管中。以17，900 x g 离心10秒。取出上清液。
      2. 加入1 mL新鲜制备的1%漂白剂溶液。倒置管子彻底混合。孵育1分钟（长时间的漂白剂孵育将导致IJ死亡）。再次旋转10秒，除去上清液。
      3. 要除去漂白剂残留物，请用1 mL无菌蒸馏水洗涤线虫并离心10秒。除去上清液。再重复洗涤四次。
      4. 通过在立体镜下计数10-20μL洗涤的IJ来估计每mL的IJ计数，并相应地调整IJ的浓度。
    4. 养殖 卡波卡普萨伊 氏菌
      1. 用移液管将约1000 IJs转移到脂质琼脂裂解板上（图3，左图）。将盘子放在加湿的橱柜或抽屉中。使用湿纸巾增加水分。将板保持在室温（22-25°C）下。
      2. 每隔一天检查一次纸巾，以确保它们保持湿润。如有必要，每隔一天在纸巾上加水，以保持橱柜或抽屉中的湿度。或者，在机柜底部放置水浴以增加湿度。
      3. 当IJ只出现时，将水加入板的另一侧，并在板的中间放置一层滤纸（水阱， 图3，右图）。将含有第一轮IJ的水收集到T75细胞培养瓶中。这些是I. 卡波卡普萨伊 圆形线虫。
      4. 再次用漂白剂表面灭菌（步骤2.2.3），并使用圆形1 .碳虫 线虫重复步骤2.2中的过程。结果将是第2轮 碳甲 线虫。
      5. 每隔几天在立体镜下检查一次，以跟踪线虫的发育。
    5. 验证 卡波卡普萨伊氏 菌 IJs 的轴系状态
      1. 如步骤 2.2.3 中所述，对第 1 轮、第 2 轮和共生 的卡波囊链球菌 IJ 进行表面灭菌。
      2. 使用无菌塑料杵在微量离心管中均质化约400-700 IJ。离心匀浆，倾析上清液，并将溶液铺展到LB琼脂平板上。将琼脂平板保存在28°C的培养箱中24小时。
      3. 计算每个板的CFU的形成。来自轴烯线虫的样品不会产生任何细菌生长。
    6. 通过 PCR 验证 卡波盖链 球菌 IJ 的轴心状态
      1. 如步骤 2.2.3 中所述，对第 1 轮、第 2 轮和共生 的卡波囊链球菌 IJ 进行表面灭菌。
      2. 从匀浆中提取DNA。详细的提取过程在下面的 4.1.2 节中描述。
      3. 使用退火温度为61°C的XptA2引物进行PCR：
        断续器 F： 5′-3′.
        断续器 R： 5′-大虫笼草-3′.
        注意：这些引物扩增嗜线芽孢杆菌的杀虫基因XptA2，产生231 bp大小的扩增子。循环程序如下：95°C循环2分钟，95°C循环30秒，退火温度为61°C1分钟，73°C退火1分钟，然后72°C10分钟。
      4. 通过在1.5%琼脂糖凝胶中分离来可视化扩增的片段。轴烯表面灭菌的样品不会形成任何条带。

3. 提高细菌雌雄同体用于显微注射

  1. 用NA + chol（1.5x营养汤，1.5%琼脂和10μg/ mL胆固醇）准备6厘米培养皿板。
  2. 在10mL培养管中制备3mL PP3溶液（2%蛋白酶蛋白胨#3，PP3）。
  3. 使用无菌的20μL吸头刮擦保持在-80°C的 荧光 假单胞菌甘油储备（25%vol / vol无菌甘油）的顶部，并将其滴入培养管中。
  4. 将试管在温度受控的振荡器中孵育过夜，设置为28°C，200rpm。
  5. 第二天，培养物将呈浅红色。将50μL培养物铺在6cm NA + chol培养皿上，并使用细菌撒布器以圆形方式传播。
  6. 将板置于28°C培养箱中。 P.发光 草坪将在24-36小时内准备就绪，并将呈现浅红色。
  7. 用50-100表面灭菌的IJ接种板，并将板保持在28°C。
  8. 健康的L4雌雄同体将在接种后约48-54小时开始出现。注射需要健康的，非饥饿的晚期L4 H.细菌 雌雄同体。

4. 双核糖核酸的制备

  1. 底漆设计
    1. 为 dsRNA 设计引物，以靶向 细菌 杆菌 DNA 的约 500 个碱基对外显子区域。
      1. 可以使用Primer3（https://primer3.ut.ee）或类似程序确定感兴趣区域的引物，选择500个碱基对的最佳产物长度，Tm为60°C，引物长度为22个核苷酸。
      2. 将T7位点（TAATACG）添加到每个前向引物的5′末端，以允许体外转录。
  2. 基因组基因分离
    1. 使用从约 50，000 株 H. 细菌 IJ 的冷冻沉淀中分离出的基因组 DNA 进行 dsRNA 合成。
    2. 使用IJ沉淀重悬于50μL裂解缓冲液（50mM KCl，0.05%（w / v）明胶，10mM Tris-HCl pH 8.2，0.45%吐温20，60μg/ mL蛋白酶K，2.5mMMgCl2）中，置于−80°C下至少30分钟。
    3. 用小管杵使颗粒均质化。
    4. 将溶液加热至室温并在60°C下孵育2小时，每15分钟涡旋一次。
    5. 通过在95°C下孵育匀浆组织15分钟来使蛋白酶K变性。
    6. 将样品冷却至4°C，并以3，400× g 离心1分钟。
    7. 使用得到的上清液作为后续PCR的模板。
    8. 使用含有 200 ng 模板 DNA、0.2 μM 正向和反向引物以及制造商建议的循环条件的商用预混液建立 50 μL PCR 反应。
    9. 在1.2%琼脂糖凝胶上分析PCR反应，以验证反应是否产生预测大小的单个条带。
  3. 双核糖核酸合成
    1. 使用商业转录试剂盒。
    2. 使用5μLPCR反应进行体外转录。按照制造商的说明进行操作。
    3. 将反应物在37°C下孵育16小时。
    4. 使用商业试剂盒使用乙酸铵/乙醇沉淀来浓缩dsRNA，清洁体外转录反应。
    5. 将沉淀的dsRNA悬浮在10μL无RN酶的水中。
    6. 使用分光光度计定量RNA。
    7. 通过在1.2%琼脂糖凝胶上分离dsRNA来评估质量

5. 显微注射

注意：注射垫是一种玻璃盖玻片，中心有一层2%（w / v）琼脂糖。当要注射的蠕虫转移到这些垫子上时，琼脂糖层将固定它们以进行手术。通常，额外的垫子保存在显微镜附近，供一般使用。

  1. 准备注射垫
    1. 通过在10mL水中加入0.2g琼脂糖，在水中煮沸2%琼脂糖。
    2. 将1-4滴（〜50μL）置于50 mm x 70 mm薄玻璃盖玻片的中心。
    3. 使用另一个盖玻片将墨滴压平。
    4. 让盖玻片干燥2-3分钟，然后将盖玻片从侧面滑落。
    5. 用“R”标记在朝上盖玻片的右侧。
    6. 让载玻片在室温下干燥1天，然后再使用。
  2. 注射针的制备
    1. 使用含有内部细丝的1.0毫米玻璃毛细管。这样可以有效地填充针头。
      注意：可以使用任何商用拉针器（例如，成石PB-7）。
    2. 打开拔针器。
    3. 确保加热器设置为max，电磁阀设置为8.40，以确保所需的针锋利度和适当的长度。
    4. 通过灯丝将毛细管插入顶部旋钮嵴，然后拧紧顶部旋钮。毛细管的顶部将与拉针器的顶部齐平，加热丝将位于毛细管的中间。
    5. 将底部单元移至顶部，然后拧紧底部旋钮。确保毛细管牢固放置。
    6. 合上拔针器的盖子，然后按开始。绿灯将亮起。几分钟后，毛细管将被加热并拉开以分成两半分开。
      注意：两个分离的针头的长度不同，但它们都可用于注射。首选较长的针尖。
    7. 使用一块造型粘土将针头排列在垂直位置，它们的点向下。或者，将针头存放在由两条造型粘土条固定到位的培养皿中。
  3. 装针
    注意：核酸溶液必须在20，784× g 下离心至少10分钟，以沉淀悬浮液中可能存在的杂质。杂质的离心可防止它们阻塞注射针的流动。
    1. 使用两种方法中的任何一种将核酸加载到针中。
    2. 方法 1
      1. 使用移液管将大约0.5μL离心的DNA样品转移到注射针的未拉空端。这将表现为一滴微小的液体坐在毛细管的顶部。
      2. 静置5至7分钟，让液体样品占据针头的末端。最终产品将是一个填充的针，没有气泡存在。
      3. 注射前使用解剖显微镜确认针尖中存在溶液。
    3. 方法 2
      1. 使用微注射器的加载提示。
      2. 使用此上样头，移取5μL核酸溶液。
      3. 当拉出的针位于拉针器上时，松开顶部旋钮，将上拉的针稍微向上移动，然后重新拧紧旋钮。
      4. 小心地将装载机的尖端插入毛细管，并将其延伸到注射针的底部。
      5. 将核酸溶液移液到注射针中。
      6. 如果需要，从拉针上取下装载机，并将其分开以备进一步装载。确保在装载不同的核酸混合物时切换出装载机。
  4. 准备注射显微镜
    注意：具有显微镜底座漫射照明的倒置显微镜用于蠕虫制备，显微注射和恢复。描述了具有10x和40x物镜的高分辨率倒置显微镜的使用。显微镜配有针头操纵器，用于固定针头并将其固定到位以进行注射。显微注射油用于防止蠕虫在注射垫的琼脂糖层上快速脱水。建议使用的油是卤化碳油700。
    1. 打开灯并使用控制面板校准亮度。
    2. 检查冷凝器沃拉斯顿棱镜上的数字;它将对应于使用的目标（40x）。
    3. 确认标有“DIC”的 DIC 炮塔位于正确的位置。
    4. 确保物镜上的旋钮设置为零 （0）。
    5. 将Ph环向右转动，直到最后。
    6. 以箭头处于水平位置的方式调整偏振镜。
    7. 在舞台上放一张纸来观察焦点（光）。
    8. 关闭现场隔膜，直到纸张上有一个点。
    9. 使用左侧的转盘上下移动冷凝器，使其在纸张上看到非常尖锐的光点。
    10. 慢慢打开磁场振膜，直到可以看到一小圈光。
    11. 把那张纸拿走。
    12. 确保光点位于物镜的中心。否则，通过调整冷凝器顶部的银螺钉，将光斑与物镜中心对齐。
    13. 完全打开现场膜片。
    14. 检查分析仪是否已按入 ICT/P。
  5. 将注射针安装在显微镜上
    1. 打开氮气流到显微注射针。对针的气体压力约为20 psi。
    2. 检查显微操作器旋钮（显微镜中移动针头的部分）是否定位到中心，这在安装针头时允许最宽的运动范围。
    3. 拧松固定金属杆的组件，将其从针座上取下。
    4. 将新针插入显微镜的顶部;然后安装橡胶垫圈以保持针就位。
    5. 通过将针座安装到组件上来固定针架的底部。
    6. 将针放入显微操作器上的凹槽中，并正确拧紧以保持稳定。确保螺钉距离显微操作器末端约 1 英寸。
    7. 使用微操作器的旋钮和粗控制装置，将针尖以相对于载物台板约45°的角度放置在视野的中间。至关重要的是，要使针尖足够高，以免意外断裂。
  6. 断针
    1. 将针头放在显微操作器中，针尖通常会断裂，以使核酸溶液流过它。
    2. 打破毛细管，将其放在载有一滴显微注射油的载玻片上。
    3. 将载玻片放在显微镜上并聚焦。
    4. 使用显微镜的精细控制将针尖与毛细管侧的水平相同（图4）。
    5. 使用脚踏致动器短暂打开氮气流，以确认针尖未断裂。快速开关就足够了。
    6. 轻轻移动针头，使其几乎不接触毛细血管的一侧。
    7. 轻轻敲击显微镜的侧面以打破针尖。
    8. 从毛细管中取出针头并打开氮气流以检查针头是否正确断裂。
    9. 针头将产生比针尖大约五倍的小注射液滴（图4）。如果注射液滴较小，请进一步打破尖端。如果注射液滴较大，请尝试使用新鲜针头。

6. 显微注射

  1. 在注射垫上移取一滴显微注射油。
  2. 将火焰灭菌的镐浸入显微注射油滴中，并收集一个年轻的 H。细菌 性 成线虫从板中。
  3. 从不靠近细菌草坪的板部分挑选线虫，以防止大量细菌细胞转移到注射垫上。此外，收获具有良好形状的性腺的线虫。
  4. 将线虫移动到注射垫上，并将它们垂直放置，以使性腺面向针头。确保外阴指向与注射针相同的方向，并且两个远端性腺臂朝向相反的方向，并且朝向线虫体壁。
    注意：像 太平洋棱柱一样， 细菌杆菌 的性腺从腹侧外阴位置向背侧迁移，然后迁移回腹侧位置。
  5. 检查油量是否足以防止线虫干燥，而不允许线虫四处游荡。
  6. 通过将针保持在载玻片上方，使线虫与10x物镜聚焦。在油中，线虫性腺被视为靠近蠕虫前部和后部的两个透明区域。确保性腺处于焦点，而不是蠕虫的其他部分。
  7. 将线虫以15°至45°的角度排列在注射针头上，这将为性腺内的针提供更多空间。此外，当针头进入性腺内时，这种方法可以防止针头穿过整个线虫体。
  8. 通过逐渐降低针头直到使其聚焦，将注射针和线虫定位到同一水平（图5）。确保当针降低时，它仍然在线虫旁边，而不是在蠕虫上方。
  9. 使用40倍物镜聚焦于线虫的合胞体性腺臂。
  10. 使用微调器上下移动针头，直到尖端与线虫合胞体性腺臂一起聚焦。
  11. 使用滑动阶段将线虫缓慢地向针头移动。然后轻轻地将性腺推向针头靠在线虫体壁上的位置，这将导致针头在线虫体内的有效渗透。
  12. 短暂踩踏脚部致动器以启动核酸溶液的流动。快速开关就足够了。如果针头在性腺内，性腺将充满溶液并膨胀。
  13. 一旦针头确保处于正确的位置，用核酸溶液填充性腺，直到性腺的臂被填充。重要的是要避免液体从蠕虫中排出，通过针刺穿它的孔。
  14. 使用滑动载物台，小心地将蠕虫从针上移开。
  15. 提起针头并逆时针旋转。
  16. 将一滴1x PBS缓冲液放在蠕虫的顶部，使其漂浮。
  17. 使用火焰灭菌的镐将蠕虫抬起，并将其放入新鲜 P. 发光 种子板上的另一滴M9中，以清除蠕虫的多余油脂。
  18. 从M9中取出线虫并将其放置在细菌草坪的远侧。
  19. 使用同一板转移几个注射的线虫。
  20. 在2-3天内，评估第一代（F1）线虫的转基因表型。将转基因F1线虫分离到单个板上，以确定哪些蠕虫将产生稳定的转基因系。

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Representative Results

为了评估经过斧化的 细菌 线虫的状态，确定了 IJs 中是否存在发光假单胞菌菌落。为此，收集了先前在PBS中表面灭菌和均质化的约500 IJs颗粒。阳性对照处理包括来自含有共生发光假单胞菌的线虫培养物的约500 IJs的 沉淀。将斧化和阳性对照线虫的颗粒在1x PBS中均质化。将匀浆物移液到琼脂上并扩散以促进单个菌落的生长。将琼脂平板在28°C下孵育24小时。第二天，观察到 发光假单胞菌 落（CFU）的出现。正如预期的那样，来自储备培养 物的细菌杆菌 携带共生的 荧光假单 胞菌细胞;然而，没有相关 荧光假单胞菌 的线虫是轴闪的，并单独储存以供将来实验（图6）。

以敲低 nol-5 基因表达为例，通过显微注射过程验证了RNAi的疗效。在亲代进行显微注射，并在F1后代中观察到效果。使用RNAi显微注射敲低 nol-5 导致60%的后代的性腺中没有种系（图7）。

Figure 1
图1：感染性幼虫的产生（致虫性线虫的自由存活期） （a） 梅氏菌 昆虫幼虫（保存在培养皿中）与线虫感染性幼虫（保存在组织培养瓶中）的感染。（b） 折叠一张滤纸，用于制备疏水器。（c） 将昆虫致病性线虫与含有传染性幼虫的死亡 梅氏菌 昆虫幼虫（线虫感染后12天）设置水阱。新一代感染性幼虫将离开死亡的昆虫并移动到水中，然后将其储存到组织培养瓶中。图像是使用生物渲染图形软件（https://biorender.com）制作的。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：用细菌菌株温带Ret16注射黑球藻昆虫幼虫。将蜡虫保存在培养皿中，并通过冷处理将其固定（即，将它们放在冰上几分钟）。用一对镊子压住昆虫身体的后部，形成适合注射的肿胀表面。注射角度较浅，以防止伤害昆虫内部组织，这会导致昆虫因粗心大意而死亡。图像是使用生物渲染图形软件（https://biorender.com）制作的。请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：轴质 斯坦纳卡普萨科 昆虫病原线虫的产生。 分开的培养皿的一半含有脂质琼脂上的 嗜线虫ΔrpoS 细菌和 卡波虫 线虫的感染性幼虫的草坪。这种 体外 方法诱导感染性幼虫成为成年线虫，随后将产生卵，这些卵将孵化以产生新一代的寄生虫。当大量新生成的 卡波囊 虫感染性幼鱼出现在分割培养皿的这一部分时，将水与一张滤纸一起添加到培养皿的另一半中，以促进线虫的迁移。图像是使用BioRender图形软件制作的（https://biorender.com） 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4：折断针尖。 针尖通常是闭合的。在进行实际注射之前，检查核酸溶液的适当流量。在载玻片上，放置一滴卤代碳油。放置一根毛细管，用于制作针头，如图所示垂直放置。使毛细管聚焦在40x处，然后轻轻地将针头与毛细管平放在一起。轻轻触摸针尖到毛细管。这为dsRNA的顺畅流动创造了一个开口。如果没有液体流出，请使用脚踏执行器进行快速的通断氮气流。来自氮气的压力和针尖与毛细管的接触将破坏针头。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5：注射部位。细菌嗜血杆菌的性腺从腹侧外阴位置向背侧迁移，然后迁移回腹侧位置。迁徙的手臂在外阴附近相互交叉，并延伸到两侧的外阴之外。在大约48小时，从IJ生长出来的年轻成年人的性腺的伸展手臂在外阴附近可见。显微注射在此位置进行。比例尺：0.1毫米，请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图6： 异质性关节炎菌性 轴化的验证。 通过确认在治疗的细菌性嗜血杆菌感染性幼鱼中没有 光 辉菌细菌细胞来估计 斧化 手术的成功。为此，从原液培养物（共生）或经过轴化过程（轴烯化）的蠕虫中取出约500个表面灭菌蠕虫的颗粒被均质化。然后，将匀浆物施用于琼脂平板上，并在24小时孵育后，监测细菌菌落（菌落形成单位，CFU）的外观。平板上缺乏细菌菌落表明 细菌 线虫 不含发光假 单胞菌共生细菌。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图7：RNAi介导的 nol-5 基因敲低。 RNAi介导的 Noll-5细菌杆菌 基因的敲低导致没有种系的表型。野生型，非注射 的细菌 线虫（a）的后代在其性腺中含有卵。野生型的后代， nol-5 RNAi注射 的细菌 线虫（b）由于其空的性腺中不含卵，由于 nol-5 RNA的敲低。比例尺：0.1毫米 ，请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

了解昆虫致病性线虫感染和昆虫抗线虫免疫的分子基础需要将寄生虫与互助相关的细菌13，15，16分离。致虫性线虫 细菌嗜血 杆菌和 卡波囊 虫 分别与革兰氏阴性菌 发光 假单胞菌和 嗜线虫X.生活在一起，17.这两种细菌物种先前已被证明可以通过靶向昆虫组织并在感染期间抵消先天免疫系统来编码赋予致病性的因素18，19。这阻碍了确定线虫进化成与昆虫宿主相互作用的策略的努力。因此，通过对也参与感染过程的线虫成分进行基因敲低来鉴定和功能表征可以通过产生轴蚜虫来促进。本文介绍了用于在 细菌杆菌 中产生轴质致虫病理线虫和进行RNAi基因沉默的有效方案。

成功生成轴线虫的两种方案中的关键步骤是 细菌线虫 和 卡波囊 虫IJs14，20的表面灭菌。该方法的这一部分涉及用漂白剂溶液处理蠕虫，并且被认为对轴化过程的成功至关重要，因为它从线虫角质层中去除 了 发光假单胞菌和嗜线虫X . 。这是一个重要的程序，以确保只有蠕虫表面上的互利细菌被清除，而不是寄生虫内部的细菌。完成此步骤需要注意，因为延长的漂白处理将影响线虫的存活。

目前针对 腕虫 线虫的轴化方案与先前建立的方法的相似之处在于使用 嗜线虫X.嗜线虫ΔrpoS 突变细菌，其不能定植蠕虫21。当前方法与先前报道的方案（将表面灭菌的线虫卵引入营养琼脂22）之间的区别在于，在培养基中添加抗生素以抑制可能影响线虫生长和适应性的微生物污染。

通过显微注射RNA是将RNA递送到卵母细胞的一种简单可靠的方法。性腺内的液体爆裂提供了注射过程中核酸溶液释放的视觉确认。结果表明，通过显微注射的RNAi明显优于通过浸泡的RNAi。这可能是由于RNAi溶液能够到达性腺内处于不同分化阶段的卵母细胞。

在优化工艺的同时，建议测试不同浓度的RNA溶液以获得更好的结果。测试了从50纳克/微升到10微克/微升的各种浓度的RNA。结果发现，浓度为6μg/μL比其他浓度更好。为了 在体外 转录步骤中增加RNA产量，将方案从4小时孵育期修改为16小时。这导致RNA的最终产量大幅增加。成功显微注射的关键因素之一是线虫在注射垫上花费的时间。更少的时间导致健康的存活线虫和健康的后代，增加观察预期表型的机会。

目前用于培养和遗传操纵昆虫病原性线虫的方案对线虫学，免疫学和宿主 - 寄生虫相互作用领域的未来研究做出了重大贡献。结合允许操纵昆虫致病性线虫的方法将导致发现遗传因素，这些因素定义了线虫效应器分子与编码具有抗线虫特性的因子的宿主免疫信号组分之间的相互作用。它将进一步确定哪些关键线虫分子成分决定了与相关细菌的共生关系。回答这些问题对于改善农业实践和开发控制人类寄生线虫的新方法非常重要。

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Disclosures

作者声明没有竞争利益。

Acknowledgments

我们感谢乔治华盛顿大学生物科学系的成员对手稿的批判性阅读。所有图形图形都是使用生物转换器制作的。研究领域：爱德华王子岛、金马龙和道琼斯大学。实验室得到了乔治华盛顿大学和哥伦比亚艺术与科学学院的支持，促进基金和跨学科研究基金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

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References

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免疫学和感染，第181期，昆虫病原性线虫， 异性横纹肌炎， 斯坦纳尼瘤，寄生虫病，宿主 - 寄生虫相互作用
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Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

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