Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dyrkning og genmanipulering af entomopatogene nematoder

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

Entomopatogene nematoder lever i symbiose med bakterier, og sammen inficerer de med succes insekter ved at underminere deres medfødte immunsystem. For at fremme forskning på det genetiske grundlag for nematodeinfektion beskrives metoder til opretholdelse og genetisk manipulation af entomopatogene nematoder.

Abstract

Entomopatogene nematoder i slægterne Heterorhabditis og Steinernema er obligatoriske parasitter af insekter, der lever i jorden. Hovedkarakteristika for deres livscyklus er den mutualistiske tilknytning til henholdsvis bakterierne Photorhabdus og Xenorhabdus. Nematodeparasitterne er i stand til at lokalisere og komme ind i egnede insektværter, undergrave insektimmunresponset og formere sig effektivt for at producere den næste generation, der aktivt vil jage nyt insektbytte for at inficere. På grund af egenskaberne af deres livscyklus er entomopatogene nematoder populære biologiske bekæmpelsesmidler, der anvendes i kombination med insekticider til bekæmpelse af destruktive landbrugsinsekt skadedyr. Samtidig repræsenterer disse parasitære nematoder et forskningsværktøj til at analysere nematodepatogenitet og være vært for anti-nematoderesponser. Denne forskning er hjulpet af den nylige udvikling af genetiske teknikker og transkriptomiske tilgange til forståelse af nematodeudskilte molekylers rolle under infektion. Her gives en detaljeret protokol om opretholdelse af entomopatogene nematoder og anvendelse af en gen knockdown-procedure. Disse metoder fremmer yderligere den funktionelle karakterisering af entomopatogene nematodeinfektionsfaktorer.

Introduction

Forskningen i entomopatogene nematoder (EPN) er blevet intensiveret i de seneste år, primært på grund af nytten af disse parasitter i integrerede skadedyrsbekæmpelsesstrategier og deres inddragelse i biomedicinsk grundforskning 1,2. Nylige undersøgelser har etableret EPN som modelorganismer, hvor man kan undersøge de nematodegenetiske komponenter, der aktiveres i de forskellige stadier af infektionsprocessen. Disse oplysninger giver kritiske spor om arten og antallet af molekyler udskilt af parasitterne for at ændre værtsfysiologi og destabilisere insektets medfødte immunrespons 3,4. Samtidig suppleres denne viden almindeligvis med nye detaljer om typen af insektværts immunsignaleringsveje og de funktioner, de regulerer for at begrænse indtrængen og spredningen af patogenerne 5,6. At forstå disse processer er afgørende for at forestille sig begge sider af det dynamiske samspil mellem EPN og deres insektværter. Bedre forståelse af EPN-insekt værtsforhold vil utvivlsomt lette lignende undersøgelser med pattedyrs parasitiske nematoder, hvilket kan føre til identifikation og karakterisering af infektionsfaktorer, der forstyrrer det menneskelige immunsystem.

EPN-nematoderne Heterorhabditis sp. og Steinernema sp. kan inficere en lang række insekter, og deres biologi er tidligere blevet intenst undersøgt. De to nematodeparasitter adskiller sig i deres reproduktionsmåde, idet heterorhabditis er selvbefrugtet og Steinernema gennemgår amphimisk reproduktion, selvom S. hermafroditum for nylig viste sig at reproducere ved selvbefrugtning af hermafroditter eller gennem parthenogenese 7,8,9. En anden forskel mellem Heterorhabditis og Steinernema nematoder er deres symbiotiske gensidighed med to forskellige slægter af gramnegative bakterier, henholdsvis Photorhabdus og Xenorhabdus, som begge er potente patogener af insekter. Disse bakterier findes i epn's fritlevende og ikke-fodrende infektiøse juvenil (IJ) fase, som detekterer modtagelige værter, får adgang til insekthækoel, hvor de frigiver deres tilknyttede bakterier, der replikerer hurtigt og koloniserer insektvæv. Både EPN og deres bakterier producerer virulensfaktorer, der afvæbner insektforsvar og forringer homeostase. Efter insektdød udvikler nematoden IJ'er sig til at blive voksen EPN og fuldføre deres livscyklus. En ny kohorte af IJ'er dannet som reaktion på fødevaremangel og overbelægning inden for insektkadaveret dukker endelig op i jorden for at jage passende værter 9,10,11,12.

Her beskrives en effektiv protokol til vedligeholdelse, forstærkning og genmanipulering af EPN-nematoder. Protokollen skitserer især replikationen af symbiotiske H. bacteriophora og S. carpocapsae IJs, dannelsen af axeniske nematode IJ'er, produktionen af H. bacteriophora hermafroditter til mikroinjektion, fremstillingen af dsRNA og mikroinjektionsteknikken. Disse metoder er afgørende for at forstå det molekylære grundlag for nematodepatogenitet og værtsantimatodeimmunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion af symbiotiske nematodeinfektive unge

  1. Dæk en petriskål (10 cm) med et stykke filterpapir og tilsæt ca. 10-15 larver (figur 1A).
  2. Ved hjælp af en pipette doseres 2 ml vand indeholdende ca. 25-50 IJ pr. 10 μL suspension på voksormene. Opbevar petriskålen i et skab ved stuetemperatur.
  3. Afhængigt af filterpapirets fugtighed tilsættes 1-2 ml vand hver 2. dag. Voksorm inficeret med IJs vil normalt dø inden for 48 timer.
  4. Forbered Whites vandfælder ca. 10 dage efter, at voksormene er inficeret med IJs8 (figur 1B, C). Overfør forsigtigt de døde insekter til den uudsugede del af filterpapiret. Brug ledningsvand til at fylde den nederste petriskål og læg en hætte på et 15 ml rør som afstandsstykke til ventilation.
  5. Overfør de bløde og skrøbelige voksorme forsigtigt ved at løfte dem langsomt fra filterpapiret ved hjælp af et par plastiktang. Brug ledningsvand i stedet for demineraliseret eller deioniseret vand. Sidstnævnte forårsager nematodeaggregering.
    1. Sørg for, at vandstanden i vandlåsen når ca. halvdelen af petriskålens højde. Forvent, at vandstanden vil ændre sig over tid afhængigt af temperatur- og fugtighedsforhold i rummet.
  6. Når vandet i den lille petriskål bliver uklart på grund af tilstedeværelsen af nematoder, skal du bruge en pipette til at flytte den nye generation af IJ'er til en T25- eller T75-cellekulturkolbe.
  7. Tilsæt ledningsvand op til ca. 40% af volumenet, indtil den passende densitet er nået (figur 1C). Undgå overbelastning af nematoder, og opbevar cellekulturkolberne vandret.
  8. Tilsæt mere vand til bunden petriskål og gentag trin 1.6 og 1.7, indtil IJ'er holder op med at dukke op fra insektkroppene om cirka 3-5 dage.

2. Produktion af axeniske nematodeinfektive unger

BEMÆRK: Axeniske nematoder anvendes, fordi hver mutualistisk partner fremkalder et særskilt værtsimmunrespons5, efter at nematode-bakteriekomplekset dissocierer inde i insektet. Den mutante stamme Ret16 af Photorhabdus temperata anvendes, fordi disse bakterier understøtter væksten af H. bacteriophora, men undlader at kolonisere nematodetarmen13,14.

  1. Heterorhabditis bacteriophora smitsomme unge
    1. Brug en steril pipettespids eller spatel til at skrabe flere flager af en frossen kultur af P. temperata Ret16 på en MacConkey-plade og stribe til enkeltkolonier. Pladen inkuberes i 2-3 dage ved 28 °C.
    2. Inokuler 10 ml LB bouillon med en koloni i et 50 ml rør og inkuber kulturen natten over ved 28 ° C i en rystende inkubator. Brug kun de primære fasekolonier, der er røde på MacConkey agar. De sekundære fasekolonier vil være off-white på MacConkey agar.
    3. 100 μL natkultur vaskes med 900 μL 1x PBS ved centrifugering i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved 17.900 x g. Dekanter supernatanten. Fortynd kulturen 10x i 1x PBS. Lad røret ligge på is.
    4. Dyp voksormene i en 70% ethanolopløsning, tør insekterne med et papirhåndklæde og læg dem i et 50 ml rør.
    5. Læg røret på is i 20 minutter for at immobilisere voksormene.
    6. Brug et filterpapir til at dække den øverste og nederste halvdel af en petriskål (10 cm). Brug petriskålens låg dækket med filterpapir som basisstøtte til injektion. Fugt filterpapiret på den nederste petriskål og overfør på is for at hjælpe de injicerede voksorme med at komme sig.
    7. Pipetter 50 μL iskolde bakterier på et stykke parafilm, og forbered 22 G nålesprøjten. Tryk forsigtigt på stemplet for at fjerne luften ved spidsen af nålen.
    8. Hold en voksorm tæt på den bageste ende under stereoskopet (figur 2).
    9. Injicer 50 μL af bakteriekulturen i brystkassens dorsale side, fortrinsvis ved krydset mellem to segmenter. For at minimere indre skader skal du injicere lige under neglebåndet, så parallelt med voksormen som muligt. Det er naturligt, at en dråbe hæmolymfe bløder ud, når voksormen er gennemboret
    10. Overfør de injicerede insekter til genopretningsskålen.
    11. Trin 2.1.7-2.1.9 gentages, indtil alle insekter injiceres med bakterierne. For at bedøve insekterne skal du placere dem på is i 5 minutter.
    12. Læg petriskålen i mørke (f.eks. skuffe eller skab), og tilsæt postevand til filterpapiret, hvis det ser tørt ud. Voksorm vil bukke under 2 dage efter injektion og fremstå murstenrøde efter ca. 3-4 dage. Hvis insekterne ser brune ud, har bakterieinfektionen været mislykket.
    13. 7 dage efter infektion overføres insekterne med den karakteristiske murstenrøde farve til en frisk filterpapirforet petriskål og fortsætter med "Produktion af symbiotiske nematodeinfektive unger" fra trin 1. Hvis du bruger symbiotiske nematoder, gentages proceduren fra trin 2.1. ved hjælp af de nyproducerede IJ'er fra første runde.
    14. Overfladesteriliserende H. bakteriophora IJs
      1. Saml tilstrækkelig symbiotisk H. bakteriophora og kandidatakseniske IJ'er ved centrifugering for at fremstille en 100 μL pellet i et 1,5 ml centrifugerør.
      2. Der tilsættes 500 μL 5% blegemiddel til pelleten i hvert mikrocentrifugerør og inverteres. Inkuberes i 10 min. Centrifuger ved 17.900 x g i 1 min. Fjern supernatanten.
      3. Pelleten vaskes med 1 ml sterilt vand og gentages centrifugeringen. Fjern supernatanten. Gentag dette trin fire gange mere.
    15. Bekræftelse af axenicitet
      1. Pipetter 400 μL sterilt vand til de vaskede symbiotiske og kandidataksiske H. bakteriophora nematoder.
      2. Placer nematoderne over insekterne i petriskålen og mærk behandlingerne i overensstemmelse hermed.
      3. Placer petriskålene med de inficerede insekter i mørket og kontroller med jævne mellemrum, om voksormene bliver røde.
        BEMÆRK: Voksorm inficeret med H. bakteriophora symbiotiske nematoder bliver røde inden for 2 dage efter infektion. Misfarvning af voksorm skyldes udskillelsen af forskellige forbindelser produceret af mutualistiske Photorhabdus-bakterier under infektionsprocessen. Mangel på rød farve i de inficerede voksorm 4 dage efter infektion bekræfter, at H. bakteriophora er axeniske. Dette skyldes , at P. temperata Ret16 bakterier ikke er til stede i nematode tarmen.
    16. Alternativ metode til verifikation af axenicitet
      1. Overfladesterilisere symbiotiske H. bacteriophora IJs og kandidatakseniske H. bacteriophora IJs som beskrevet i trin 2.1.14.
      2. Homogeniser ca. 500 IJ i 500 μL steril 1x PBS i mikrofugerør ved hjælp af sterile pistiller. Spin homogenatet ned, dekanter supernatanten, og spred det på LB agar. Pladerne inkuberes ved 28 °C i 24 timer.
      3. Tæl de kolonidannende enheder (CFU) for hver plade. Prøver fra axenisk H. bakteriophora vil ikke danne nogen kolonier af de symbiotiske P. luminescens bakterier.
  2. Steinernema carpocapsae Smitsomme unge
    1. Fremstilling af lipidagarplader (300 ml opløsning gør ca. 20 splittede plader)
      1. Væg 2,4 g næringsstof bouillon, 4,5 g gærekstrakt og 1,5 g agar og tilsæt dem til 267 ml deioniseret vand. Autoklave løsningen.
      2. Tilsæt 3 ml 1 M MgCl2, 1,2 ml majsolie og 28,8 ml 7% majssirup.
      3. Der fremstilles og tilsættes 300 μL 30 mg/ml kanamycin og 300 μL 50 mg/ml ampicillin (steriliseret med 0,2 μm filter).
      4. Dekanter blandingen på den ene halvdel af et delt petriskål/splittallerken.
    2. Fremstilling af X. nematophila (stamme ΔrpoS) bakteriel græsplæne
      1. Dyrkning X. nematophila (Xn) ΔrpoS direkte fra en frossen bakteriebestand i 2 ml LB/kan/amp-opløsning på en ryster ved 30 °C natten over.
      2. Inokuler 5 ml LB-medium indeholdende 30 μg / ml kanamycin og 50 μg / ml ampicillin med 250 μL af natkulturen og dyrk bakterierne natten over på en shaker.
        BEMÆRK: Xn-bakterier vokser ikke godt, når de stribes direkte på selektionslipidagarmedier fra en frossen bestand. Om nødvendigt kan primær og sekundær fase Xn først bekræftes på NBTA-medier (næringsagar suppleret med 25 mg bromothymol blå l-1 og 40 mg triphenyltetrazoliumchlorid l-1), inden der startes en frisk flydende kultur.
      3. Pipette 100 μL af kulturen på lipidagarpladerne og spred på hele pladen med en steril podningssløjfe. Pladerne inkuberes i 24 timer ved 30 °C.
    3. Overfladesteriliserende S. carpocapsae IJs
      1. Efterlad en kolbe indeholdende IJ'er i en vinkel, således at IJ'erne synker ned i et hjørne af kolben. Aspirer 1 ml af de bundfældede IJ'er i et mikrocentrifugerør. Centrifuge ved 17.900 x g i 10 s. Fjern supernatanten.
      2. Tilsæt 1 ml 1% frisklavet blegemiddelopløsning. Inverter rør for at blande grundigt. Inkuberes i 1 minut (langvarig blegemiddelinkubation vil føre til IJ-død). Drej igen i 10 s. Fjern supernatant.
      3. For at fjerne blegemiddelrester vaskes nematoderne med 1 ml sterilt destilleret vand og centrifugeres i 10 s. Fjern supernatant. Gentag vasken fire gange mere.
      4. Estimer IJ-tallet pr. ml ved at tælle 10-20 μL af de vaskede IJ'er under stereoskopet, og juster koncentrationen af IJ'erne i overensstemmelse hermed.
    4. Opdræt S. carpocapsae IJs
      1. Overfør med en pipette omkring 1000 IJ til lipid agar split plader (figur 3, venstre billede). Placer pladerne i et befugtet skab eller skuffe. Brug fugtige papirhåndklæder til at øge fugtigheden. Pladerne vedligeholdes ved stuetemperatur (22-25 °C).
      2. Tjek køkkenrullerne hver anden dag for at sikre, at de forbliver fugtige. Tilsæt om nødvendigt vand hver anden dag til papirhåndklæderne for at opretholde fugtigheden i skabet eller skuffen. Alternativt kan du placere et vandbad i bunden af kabinettet for at øge fugtigheden.
      3. Når IJ'er kun vises, skal du tilføje vand til den anden side af pladen og placere et lag filterpapir over midten af pladen (vandfælde, figur 3, højre billede). Dette vand indeholdende den første runde IJ'er opsamles i en T75-cellekulturkolbe. Disse er runde I S. carpocapsae nematoder.
      4. Overfladesteriliseres med blegemiddel (trin 2.2.3) igen, og processen gentages fra trin 2.2 ved hjælp af runde 1 S. carpocapsae nematoderne. Resultatet bliver runde 2 S. carpocapsae nematoder.
      5. Kontroller under et stereoskop hvert par dage for at spore udviklingen af nematoderne.
    5. Verifikation af den akseniske tilstand af S. carpocapsae IJs
      1. Overfladesterilisere runde 1, runde 2 og symbiotiske S. carpocapsae IJs med blegemiddel som beskrevet i trin 2.2.3.
      2. Homogeniser ca. 400-700 IJ'er i mikrofugerør ved hjælp af sterile plastpestler. Homogenatet centrifugeres, supernatanten dekanteres, og opløsningen fordeles på LB-agarplader. Agarpladerne opbevares i en inkubator indstillet ved 28 °C i 24 timer.
      3. Tæl dannelsen af CFU for hver plade. Prøver fra axeniske nematoder vil ikke producere nogen bakterievækst.
    6. Verifikation af den akseniske tilstand af S. carpocapsae IJs af PCR
      1. Overfladesterilisere runde 1, runde 2 og symbiotiske S. carpocapsae IJs med blegemiddel som beskrevet i trin 2.2.3.
      2. Ekstrakt DNA fra homogenatet. En detaljeret udtræksprocedure er beskrevet i punkt 4.1.2 nedenfor.
      3. Udfør PCR ved hjælp af XptA2 primere med udglødningstemperatur 61 °C:
        XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
        XptA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
        BEMÆRK: Disse primere forstærker det insekticide gen XptA2 af X. nematophila, hvilket producerer en 231 bp størrelse amplicon. Cykelprogrammet var som følger: 95 °C i 2 min, 34 cyklusser på 95 °C i 30 s, udglødningstemperatur på 61 °C i 1 min og 73 °C i 1 min efterfulgt af 72 °C i 10 min.
      4. Visualiser de forstærkede fragmenter ved adskillelse i en 1,5% agarosegel. Axeniske overfladesteriliserede prøver danner ingen bånd.

3. Opdræt af H. bakteriophora hermafroditter til mikroinjektion

  1. Forbered 6 cm petriskålplader med NA + chol (1,5x næringsbouillon, 1,5% agar og 10 μg / ml kolesterol).
  2. Forbered 3 ml PP3-opløsning (2% Protease Peptone #3, PP3) i et 10 ml kulturrør.
  3. Brug en steril 20 μL spids til at skrabe toppen af P. luminescens glycerol-stammen (25% vol / vol steril glycerol) opretholdt ved -80 ° C og slip den i kulturrøret.
  4. Røret inkuberes natten over i en temperaturstyret ryster indstillet ved 28 °C, 200 o / min.
  5. Den følgende dag vil kulturen være lys rød i farven. Plade 50 μL af kulturen på en 6 cm NA + chol petriskål og spred den ved hjælp af en bakteriel spreder på en cirkulær måde.
  6. Pladerne anbringes i en 28 °C kuvøse. P. luminescens græsplænen vil være klar i 24-36 timer og vil fremstå lys rød i farven.
  7. Pladen podes med 50-100 overfladesteriliserede IJ'er, og pladen fastholdes ved 28 °C.
  8. Sund L4 hermafrodit begynder at dukke op ca. 48-54 timer efter podning. Sund, ikke-sultet sen L4 H. bakteriophora hermafroditter er påkrævet til injektion.

4. Forberedelse af dsRNA

  1. Primer design
    1. Design primere til dsRNA til at målrette ~ 500 basepar exon regioner af H. bakteriophora DNA.
      1. Primere til regioner af interesse kan bestemmes ved hjælp af Primer3 (https://primer3.ut.ee) eller et lignende program, der vælger en optimal produktlængde på 500 basepar, Tm på 60 ° C og primerlængde på 22 nukleotider.
      2. Tilsæt et T7-sted (TAATACGACTCACTATAGGG) til 5 ′-enderne af hver fremadgående primer for at muliggøre in vitro-transkription.
  2. Genomisk DNA-isolering
    1. Brug genomisk DNA isoleret fra frosne pellets på ~ 50.000 H. bakteriophora IJs til dsRNA-syntese.
    2. Brug en IJ-pellet, der er resuspenderet i 50 μL lysisbuffer (50 mM KCl, 0,05% (w/v) gelatine, 10 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,45% Tween 20, 60 μg/ml Proteinase K, 2,5 mM MgCl2) anbragt ved −80 °C i mindst 30 min.
    3. Homogeniser pelleten med en lille rørpistle.
    4. Opløsningen opvarmes til stuetemperatur og inkuberes ved 60 °C i 2 timer, hvirvel hvert 15. minut.
    5. Denaturer proteinasen K ved at inkubere det homogeniserede væv i 15 minutter ved 95 °C.
    6. Prøven afkøles til 4 °C, og der centrifugeres ved 3.400 x g i 1 min.
    7. Brug den resulterende supernatant som en skabelon til efterfølgende PCR.
    8. Opret en 50 μL PCR-reaktion ved hjælp af en kommerciel mastermix med 200 ng skabelon-DNA, 0,2 μM frem- og bakprimer og producentens foreslåede cykelforhold.
    9. Analyser PCR-reaktionen på en 1,2% agarosegel for at kontrollere, at reaktionerne producerede enkeltbånd af den forudsagte størrelse.
  3. dsRNA syntese
    1. Brug et kommercielt transkriptionssæt.
    2. Brug en 5 μL PCR-reaktion til in vitro transkription. Følg producentens anvisninger.
    3. Reaktionen inkuberes i 16 timer ved 37 °C.
    4. In vitro-transkriptionsreaktionerne rengøres med et kommercielt kit ved hjælp af ammoniumacetat/ethanoludfældning for at koncentrere dsRNA'et.
    5. Suspender det pelleterede dsRNA i 10 μL RNasefrit vand.
    6. Kvantificer RNA'et ved hjælp af et spektrofotometer.
    7. Vurder kvaliteten ved at adskille dsRNA'et på en 1,2% agarosegel

5. Mikroinjektion

BEMÆRK: En injektionspude er en glasovertrækslip med et lag på 2% (w/ v) agarose på midten. Når ormene, der skal injiceres, overføres til disse puder, vil agaroselaget immobilisere dem til proceduren. Normalt holdes ekstra puder i nærheden af mikroskopet til generel brug.

  1. Klargøring af injektionspuden
    1. Kog 2% agarose i vand ved at tilsætte 0,2 g agarose til 10 ml vand.
    2. Anbring 1-4 dråber (~ 50 μL) på midten af en 50 mm x 70 mm tynd glasdæksler.
    3. Brug en anden dækslip til at flade dråben.
    4. Lad dækslippen tørre i 2-3 min, før du skubber dækslippen af sidelæns.
    5. Marker med et 'R' højre side af den opadvendte dækslip.
    6. Lad gliderne tørre ved stuetemperatur i 1 dag, før du bruger dem.
  2. Fremstilling af injektionsnåle
    1. Brug 1,0 mm glaskapillærer indeholdende en intern fin filament. Dette muliggør effektiv påfyldning af nålen.
      BEMÆRK: Enhver kommerciel nåletrækker (f.eks. Narishige PB-7) kan bruges.
    2. Tænd nåletrækkeren.
    3. Sørg for, at varmelegemet er indstillet til max, og solenoiden er indstillet til 8,40 for at sikre den nødvendige nåleskarphed og korrekt længde.
    4. Indsæt kapillarrøret i den øverste knapryg gennem filamentet, og stram den øverste knap. Toppen af kapillarrøret vil være i niveau med toppen af nåletrækkeren, og varmefilamentet vil være midt i kapillæren.
    5. Flyt den nederste enhed til toppen, og stram derefter den nederste knap. Sørg for, at kapillæren er sikkert placeret.
    6. Luk dækslet på nåletrækkeren, og tryk på start. Det grønne lys tændes. Efter et par minutter opvarmes kapillæren og trækkes fra hinanden for at adskille i to halvdele.
      BEMÆRK: De to adskilte nåle er ikke af samme længde, men de kan begge bruges til injektionerne. Længere nålepunkter foretrækkes.
    7. Arranger nålene lodret med deres punkter nedad ved hjælp af et stykke modellervoks. Alternativt kan du opbevare nålene i et petriskål, der holdes på plads af to strimler modellervoks.
  3. Indlæsning af nålen
    BEMÆRK: Nukleinsyreopløsningen skal centrifugeres i mindst 10 minutter ved 20,784 x g til pellet urenheder, der kan være til stede i suspensionen. Centrifugeringen af urenhederne forhindrer dem i at blokere strømmen af injektionsnålen.
    1. Brug en af de to metoder til at indlæse nukleinsyrer i nålene.
    2. Metode 1
      1. Der anvendes en pipette til at overføre ca. 0,5 μL af den centrifugerede DNA-prøve til den upullede ende af injektionsnålen. Dette vil fremstå som en lille dråbe væske, der sidder oven på kapillarrøret.
      2. Stå ved i 5 til 7 minutter for at lade væskeprøven optage enden af nålen. Det endelige produkt vil være en fyldt nål uden luftbobler til stede.
      3. Brug et dissektionsmikroskop til at bekræfte tilstedeværelsen af opløsning i nålespidsen før injektion.
    3. Metode 2
      1. Brug indlæsningstip til mikroinjektoren.
      2. Ved hjælp af denne påfyldningsspids pipetteres 5 μL af nukleinsyreopløsningen.
      3. Mens den trak nål er på nåletrækkeren, skal du løsne den øverste knap, flytte den øverste trak nål lidt opad og stramme knappen igen.
      4. Indsæt forsigtigt spidsen af læsseren i kapillarrøret og stræk den til bunden af injektionsnålen.
      5. Pipetter nukleinsyreopløsningen i injektionsnålen.
      6. Fjern læsseren fra den trak nål, og hold den adskilt for yderligere belastning, hvis det er nødvendigt. Sørg for at skifte læssere ud, når du lægger en anden nukleinsyreblanding.
  4. Forberedelse af injektionsmikroskopet
    BEMÆRK: Et omvendt mikroskop med diffus belysning fra mikroskopbasen bruges til ormforberedelse, mikroinjektion og genopretning. Anvendelsen af et omvendt mikroskop med høj opløsning med 10x og 40x mål er beskrevet. Mikroskopet er udstyret med en nålemanipulator, der holder nålen og bringer den på plads til injektionen. Mikroinjektionsolie bruges til at forhindre ormen i hurtig dehydrering, mens den er på injektionspudens agaroselag. Den foreslåede olie at bruge er Halocarbon Oil 700.
    1. Tænd lampen, og kalibrer lysstyrken med kontrolpanelet.
    2. Kontroller nummeret på kondensatoren Wollaston prisme; det svarer til det anvendte mål (40x).
    3. Bekræft, at DIC-tårnet, markeret med "DIC", er på den rigtige position.
    4. Sørg for, at knappen på målet er indstillet til nul (0).
    5. Drej Ph-ringen til højre indtil slutningen.
    6. Juster polarisatoren på en måde, så pilen er i vandret position.
    7. Sæt et stykke papir på scenen for at observere fokuspunktet (lys).
    8. Luk feltmembranen til det punkt, at der er et sted på papiret.
    9. Brug drejeknappen til venstre til at flytte kondensatoren op og ned til det punkt, hvor der ses et meget skarpt lyspunkt på stykket papir.
    10. Åbn feltmembranen langsomt op til det punkt, hvor en lille cirkel af lys er synlig.
    11. Tag papiret væk.
    12. Sørg for, at lyspunktet er i midten af målet. Ellers skal du stille lyspunktet op med midten af målet ved at justere sølvskruerne på toppen af kondensatoren.
    13. Åbn feltmembranen helt.
    14. Kontroller, at analysatoren ICT/P er trykket ind.
  5. Montering af injektionsnålen på mikroskopet
    1. Tænd for nitrogengasstrømmen til mikroinjektionsnålen. Gastrykket til nålen vil være ca. 20 psi.
    2. Kontroller mikromanipulatorknapperne (den del af mikroskopet, der bevæger nålen) er placeret til midten, hvilket giver mulighed for det bredeste bevægelsesområde, når nålen er monteret.
    3. Skru enheden, der holder metalstangen, af for at fjerne den fra nåleholderen.
    4. Indsæt den nye nål i den øverste del af mikroskopet; Installer derefter gummipakningen for at holde nålen på plads.
    5. Fastgør den nederste del af nåleholderen ved at montere den på samlingen.
    6. Sæt nålen i rillen på mikromanipulatoren, og skru den ordentligt for at holde den stabil. Sørg for, at skruen er ca. 1 in fra enden af mikromanipulatoren.
    7. Anbring spidsen af nålen midt i synsfeltet i en vinkel på ca. 45° i forhold til trinpladen ved hjælp af knapper og grove betjeningsanordninger fra mikromanipulatoren. Det er vigtigt at lade nålespidsen være høj nok, så den ikke går i stykker ved et uheld.
  6. At bryde nålene
    1. Anbring nålen i mikromanipulatoren, hvor nålens spids normalt går i stykker for at tillade nukleinsyreopløsningen at strømme gennem den.
    2. Bryd en kapillær og læg den oven på et glasglas med en dråbe mikroinjektionsolie.
    3. Placer diaset på mikroskopet og fokuser.
    4. Nålens spids bringes op på samme niveau som kapillærens side ved hjælp af mikroskopets fine betjeningselementer (figur 4).
    5. Tænd nitrogenstrømmen kortvarigt ved hjælp af fodaktuatoren for at bekræfte, at nålens spids ikke er brudt. En hurtig on-off er tilstrækkelig.
    6. Flyt nålen forsigtigt, så den næppe rører kapillærens side.
    7. Tryk let på siden af mikroskopet for at bryde nålespidsen.
    8. Fjern nålen fra kapillæren, og tænd for nitrogenstrømmen for at kontrollere, at nålen er brudt korrekt.
    9. Nålen vil skabe et lille injektionsfald, der er ca. fem gange større end nålens spids (figur 4). Hvis injektionsfaldet er af mindre størrelse, skal du bryde spidsen yderligere. Hvis injektionsdråben er af større størrelse, skal du prøve at bruge en frisk nål.

6. Mikroinjektion

  1. Pipetter en dråbe mikroinjektionsolie på en injektionspude.
  2. Dyp en flammestiliseret pluk i mikroinjektionsoliedråben og saml en ung H. bakteriophora voksen nematode fra pladen.
  3. Vælg nematoderne fra dele af pladen, som ikke er tæt på bakterieplænen for at forhindre overførsel af et stort antal bakterieceller til injektionspuden. Høst også en nematode med velformede gonader.
  4. Flyt nematoderne til injektionspuden og placer dem lodret, så gonaderne vender mod nålen. Sørg for, at vulva peger i samme retning som injektionsnålen, og de to distale gonadarme er i modsat retning og op mod nematodekroppen.
    BEMÆRK: Ligesom Pristionchus pacificus migrerer gonaden af H. bakteriophora dorsalt fra den ventrale vulvaposition og vandrer derefter tilbage til den ventrale position.
  5. Kontroller, at mængden af olie er tilstrækkelig til at forhindre udtørring af nematoden uden at lade nematoden vandre rundt.
  6. Bring nematoden i fokus med 10x målet ved at holde nålen godt over diaset. I olie ses nematodegonaderne som to klare regioner tæt på ormens forreste og bageste. Sørg for, at gonaderne er i fokus og ikke de andre dele af ormen.
  7. Arranger nematoden i en vinkel på 15 ° til 45 ° mod injektionsnålen, hvilket vil give mere plads til nålen inde i gonaden. Denne tilgang forhindrer også nålen i at passere gennem hele nematodekroppen, når nålen indføres inde i gonaden.
  8. Placer injektionsnålen og nematoden til samme niveau ved gradvist at sænke nålen, indtil den bringes i fokus (figur 5). Sørg for, at når nålen sænkes, forbliver den ved siden af nematoden og ikke over ormen.
  9. Brug 40x-målet til at fokusere på nematodens syncytial gonad-arm.
  10. Flyt nålen op og ned ved hjælp af finjusteringen, indtil spidsen er i fokus sammen med nematode syncytial gonad arm.
  11. Flyt nematoden langsomt mod nålen ved hjælp af glidetrinnet. Skub derefter forsigtigt gonaden til position med nålen mod nematodens kropsvæg, hvilket vil resultere i effektiv nåleindtrængning inde i nematodekroppen.
  12. Træd kort på fodaktuatoren for at starte strømmen af nukleinsyreopløsningen. En hurtig on-off er tilstrækkelig. Hvis nålen er inde i gonaden, vil gonaden fylde med opløsningen og svulme.
  13. Når nålen er sikret i den rigtige position, skal du fylde gonaden med nukleinsyreopløsningen, indtil gonadens arme er fyldt. Det er vigtigt at undgå udvisning af væske fra ormen gennem hullet, hvor nålen punkterede den.
  14. Brug glidetrinnet til forsigtigt at flytte ormen væk fra nålen.
  15. Løft nålen, og drej den mod uret.
  16. Placer en dråbe 1x PBS-buffer oven på ormen for at få den til at flyde.
  17. Brug den flammestiliserede pluk til at løfte ormen og læg den i en anden dråbe M9 på en frisk P. luminescensfrøplade for at befri ormen for overskydende olie.
  18. Fjern nematoden fra M9 og læg den på den anden side af bakterieplænen.
  19. Brug den samme plade til at overføre flere injicerede nematoder.
  20. Om 2-3 dage evalueres den første generation (F1) nematoder for den transgene fænotype. Adskil de transgene F1 nematoder på individuelle plader for at bestemme, hvilke orme der vil generere stabile transgene linjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at vurdere status for H. bakteriophora nematoder, der har gennemgået axeniseringen, blev tilstedeværelsen eller fraværet af P. luminescens bakteriekolonier i IJs bestemt. For at gøre dette blev en pellet på ca. 500 IJ'er, der tidligere var blevet overfladesteriliseret og homogeniseret i PBS, opsamlet. Den positive kontrolbehandling bestod af en pille på ca. 500 IJ fra nematodekulturen indeholdende symbiotiske P. luminescensbakterier . Pellets af axeniserede og positive kontrol nematoder blev homogeniseret i 1x PBS. Homogenaterne blev pipetteret på agar og spredt for at lette væksten af individuelle kolonier. Agarpladerne blev inkuberet ved 28 °C i 24 timer. Den næste dag blev forekomsten af P. luminescens kolonier (CFU) observeret. Som forventet bar H. bakteriophora fra stamkulturen symbiotiske P. luminsecens celler; nematoder uden deres tilknyttede P. luminecens-bakterier var imidlertid akseniske og opbevaret separat til fremtidig forsøg (figur 6).

Knockdown af nol-5 genekspression blev brugt som et eksempel til at vise effekten af RNAi ved hjælp af mikroinjektionsprocessen. Mikroinjektion blev udført i forældregenerationen, og effekten blev observeret i F1-afkommet. Knockdown af nol-5 ved hjælp af RNAi mikroinjektion resulterede i fravær af kimlinje i gonaden af 60% af afkommet (figur 7).

Figure 1
Figur 1: Generering af infektiøse unger (frit levende stadium af entomopatogene nematoder). (a) Infektion af Galleria mellonella insektlarver (opbevares i petriskål) med nematodeinfektive unger (opbevares i vævskulturkolbe). b) Foldning af et stykke filterpapir til fremstilling af en vandlås. c) Opstilling af en vandlås af entomopatogene nematoder med døde insektlarver indeholdende infektiøse unge fugle (12 dage efter nematodeinfektion). Den nye generation af infektiøse unge vil forlade de døde insekter og flytte til vandet, som derefter opbevares i en vævskulturkolbe. Billeder er lavet ved hjælp af BioRender grafisk software (https://biorender.com). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Injektion af Galleria mellonella insektlarver med bakteriestammen Photorhabdus temperata Ret16. Voksorm opbevares i en petriskål, og de immobiliseres gennem kold behandling (dvs. de placeres på is i et par minutter). Den bageste del af insektkroppen presses med et par tang for at skabe en hævet overflade, der er egnet til injektion. Injektionsvinklen er lav for at forhindre skade på indre insektvæv, hvilket ville føre til insektdød på grund af skødesløs håndtering. Billeder er lavet ved hjælp af BioRender grafisk software (https://biorender.com). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Generation af axeniske Steinernema carpocapsae entomopatogene nematoder. Den ene halvdel af en opdelt petriskål indeholder en græsplæne af Xenorhabdus nematophila ΔrpoS bakterier på lipidagar og infektiøse unge af S. carpocapsae nematoder. Denne in vitro-metode får de infektiøse unge til at blive voksne nematoder, som senere vil producere æg, der klækkes for at give anledning til den nye generation af parasitterne. Når et stort antal nyligt genererede S. carpocapsae-infektiøse unger vises i denne del af den opdelte petriskål, tilsættes vand til den anden halvdel af skålen sammen med et stykke filterpapir for at lette nematodernes migration. Billeder er lavet ved hjælp af BioRender grafisk software (https://biorender.com) Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Brydning af nålespidsen. Nålens spids er normalt lukket. Den korrekte strøm af nukleinsyreopløsningen kontrolleres, inden den faktiske injektion udføres. På et glasglas skal du placere en dråbe halocarbonolie. Placer et kapillarrør, der bruges til fremstilling af nålen, lodret som vist på figuren. Bring kapillæren til at fokusere på 40x og forsigtigt bringe nålen ned i plan med kapillæren. Rør forsigtigt nålespidsen til kapillæren. Dette skaber en åbning for den glatte strøm af dsRNA'et. Hvis der ikke kommer væske ud, skal du udføre en hurtig on-off nitrogenstrøm ved hjælp af fodaktuatoren. Trykket fra nitrogenet og nålespidsens kontakt med kapillæren vil bryde nålen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Injektionssted. Gonaden af H. bakteriophora migrerer dorsalt fra den ventrale vulvaposition og migrerer derefter tilbage til den ventrale position. De migrerende arme krydser hinanden nær vulvaen og strækker sig ud over vulvaen på begge sider. Omkring 48 timer er de udstrakte arme af gonaden af en ung voksen, dyrket fra IJ, synlige nær vulvaen. Mikroinjektion udføres på denne position. Skalalinje: 0,1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Validering af heterorhabditis bakteriophora axenisering. Succesen med axeniseringsproceduren blev estimeret ved at bekræfte fraværet af Photorhabdus luminescens bakterieceller i behandlede H. bakteriophora infektiøse juveniler. Til dette blev en pellet på ca. 500 overfladesteriliserede orme fra stamkulturen (symbiotisk) eller orme, der havde gennemgået axeniseringsprocessen (axenisk), homogeniseret. Derefter blev homogenatet spredt på agarplader, og efter en 24 timers inkubation blev udseendet af bakteriekolonier (kolonidannende enheder, CFU) overvåget. Mangel på bakteriekolonier på pladerne tyder på, at H. bakteriophora nematoder er fri for deres P. luminescens symbiotiske bakterier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: RNAi medieret knockdown af nol-5 gen. RNAi medieret knockdown af H. bacteriophora nol-5 gen resulterer i en fænotype uden kimlinje. Afkommet af en vild type, ikke-injiceret H. bacteriophora nematode (a) indeholder æg i sine gonader. Afkommet af en vild type, nol-5 RNAi injiceret H. bakteriophora nematode (b) indeholder ingen æg i sine tomme gonader på grund af knockdown af nol-5 RNA. Skalalinje: 0,1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelse af det molekylære grundlag for entomopatogen nematodeinfektion og insekt-anti-nematodeimmunitet kræver adskillelse af parasitterne fra de mutualistisk associerede bakterier 13,15,16. De entomopatogene nematoder H. bacteriophora og S. carpocapsae lever sammen med de gramnegative bakterier P. luminescens og X. nematophila henholdsvis17. Begge bakteriearter har tidligere vist sig at kode faktorer, der giver patogenicitet ved at målrette insektvæv og modvirke det medfødte immunsystem under infektion18,19. Dette hindrer bestræbelserne på at identificere de strategier, som nematoder har udviklet til at interagere med insektværten. Derfor kan identifikation og funktionel karakterisering gennem gen knockdown af nematodekomponenterne, der også deltager i infektionsprocessen, lettes ved generering af axeniske orme. Her præsenteres effektive protokoller til fremstilling af axeniske entomopatogene nematoder og udførelse af RNAi-genhæmning i H. bakteriophora.

Et kritisk trin i begge protokoller for vellykket generering af axeniske nematoder er overfladesteriliseringen af H. bacteriophora og S. carpocapsae IJs14,20. Denne del af metoden involverer behandling af ormene med blegemiddelopløsning og betragtes som afgørende for axeniseringsprocessens succes, fordi den fjerner P. luminescens og X. nematophila bakterier fra nematode neglebåndet. Dette er en vigtig procedure for at sikre, at kun de mutualistiske bakterier på overfladen af ormene ryddes og ikke dem inde i parasitterne. Afslutning af dette trin kræver opmærksomhed, fordi udvidet blegemiddelbehandling vil påvirke nematodeoverlevelsen.

En lighed mellem den nuværende axeniseringsprotokol for S. carpocapsae nematoder med en tidligere etableret metode er brugen af X. nematophila ΔrpoS mutant bakterier, som ikke er i stand til at kolonisere ormene21. En forskel mellem den nuværende metode og en tidligere rapporteret protokol, der introducerede overfladesteriliserede nematodeæg pånæringsagar 22, er tilsætning af antibiotika i kulturmediet for at hæmme mikrobiel forurening, der sandsynligvis vil påvirke nematodevækst og fitness.

RNAi ved mikroinjektion er en nem og pålidelig metode til at levere RNA til oocytterne. Udbruddet af væske inde i gonaden giver visuel bekræftelse af frigivelsen af nukleinsyreopløsningen under injektionsprocessen. Det blev vist, at RNAi ved mikroinjektion er signifikant bedre end RNAi ved blødning. Dette skyldes sandsynligvis RNAi-opløsningens evne til at nå oocytter, der er på forskellige stadier af differentiering inde i gonaden.

Under optimering af processen anbefales det at teste forskellige koncentrationer af RNA-opløsning for bedre resultater. Forskellige koncentrationer af RNA fra 50 ng / μL til 10 μg / μL blev testet. Det blev konstateret, at en koncentration på 6 μg/μL virkede bedre end andre koncentrationer. For at øge RNA-udbyttet under in vitro-transkriptionstrinnet blev protokollen modificeret fra en 4 timers inkubationsperiode til 16 timer. Dette resulterede i en betydelig stigning i det endelige udbytte af RNA. En af nøglefaktorerne for vellykket mikroinjektion er den tid, som en nematode bruger på injektionspuden. Mindre tid resulterer i en sund overlevende nematode og sundt afkom med en øget chance for at observere den tilsigtede fænotype.

Den nuværende protokol for dyrkning og genmanipulering af entomopatogene nematoder er et væsentligt bidrag til fremtidige undersøgelser inden for nematologi, immunologi og værtsparasitinteraktioner. Kombination af tilgange, der tillader manipulation af entomopatogene nematoder, vil føre til opdagelsen af de genetiske faktorer, der definerer samspillet mellem nematodeeffektormolekyler og værtsimmunsignaleringskomponenter, der koder for faktorer med anti-nematodeegenskaber. Det vil yderligere bestemme, hvilke vigtige nematodemolekylære komponenter der bestemmer det symbiotiske forhold til de relaterede bakterier. Besvarelse af disse spørgsmål er vigtig for at forbedre landbrugspraksis og udvikle nye midler til bekæmpelse af humane parasitære nematoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer af Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University for kritisk læsning af manuskriptet. Alle grafiske figurer er lavet ved hjælp af BioRender. Forskning i I. E., J. H. og D. O'H. laboratorier er blevet støttet af George Washington University og Columbian College of Arts and Sciences, der letter midler og tværfaglige forskningsmidler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  2. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila. Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).
  3. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  4. Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants. Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).
  5. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  6. Eleftherianos, I., Heryanto, C. Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection. Genes. 12 (2), 202 (2021).
  7. Ciche, T. The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook. , 1-9 (2007).
  8. Stock, S. P. Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes. Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).
  9. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), (2021).
  10. Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).
  11. Abd-Elgawad, M. M. M. Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes. Plants. 10 (8), 1660 (2021).
  12. Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds. Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).
  13. Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism. Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).
  14. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes. Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).
  15. Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).
  16. Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).
  17. Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).
  18. Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. Photorhabdus and a host of hosts. Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).
  19. Ozakman, Y., Eleftherianos, I. Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus. Microbiological Research. 240, 126568 (2020).
  20. Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes. BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).
  21. Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila. Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).
  22. McMullen, J. G., Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).

Tags

Immunologi og infektion udgave 181 entomopatogene nematoder heterorhabditis Steinernema parasitisme værtsparasitinteraktioner
Dyrkning og genmanipulering af entomopatogene nematoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heryanto, C., Ratnappan, R.,… More

Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter