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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

昆虫病原性線虫は細菌と共生して生きており、一緒になって自然免疫系を損なうことによって昆虫に感染することに成功しています。線虫感染の遺伝的基盤に関する研究を促進するために、昆虫病原性線虫を維持し、遺伝的に操作する方法が記載されている。

Abstract

ヘテロラブディティス属およびSteinernma属の昆虫病原性線虫は、土壌に生息する昆虫の義務性寄生虫である。それらのライフサイクルの主な特徴は、それぞれ細菌PhotorhabdusおよびXenorhabdusとの相互主義的な関連である。線虫寄生虫は、適切な昆虫宿主を見つけて侵入し、昆虫の免疫応答を覆し、効率的に増殖して、感染する新しい昆虫の獲物を積極的に狩る次世代を作り出すことができる。そのライフサイクルの特性のために、昆虫病原性線虫は、破壊的な農業害虫を防除するために殺虫剤と組み合わせて使用される一般的な生物学的防除剤である。同時に、これらの寄生性線虫は、線虫病原性および宿主抗線虫応答を分析するための研究ツールを表す。この研究は、感染中の線虫分泌分子の役割を理解するための遺伝学的技術およびトランスクリプトーム的アプローチの最近の開発によって支援されている。ここでは、昆虫病原性線虫の維持および遺伝子ノックダウン手順の使用に関する詳細なプロトコルが提供される。これらの方法論は、昆虫病原性線虫感染因子の機能的特徴付けをさらに促進する。

Introduction

昆虫病原性線虫(EPN)に関する研究は、主に統合された害虫管理戦略におけるこれらの寄生虫の有用性と基本的な生物医学研究への関与のために、過去数年間で強化されています1,2。最近の研究では、感染プロセスのさまざまな段階で活性化される線虫の遺伝的成分を調べるためのモデル生物としてEPNが確立されています。この情報は、宿主の生理機能を変え、昆虫の自然免疫応答を不安定化させるために寄生虫によって分泌される分子の性質と数に関する重要な手がかりを提供します3,4。同時に、この知識は、昆虫宿主免疫シグナル伝達経路の種類と、病原体の侵入と拡散を制限するために調節する機能に関する新しい詳細によって一般的に補完される5,6。これらのプロセスを理解することは、EPNとその昆虫宿主との間の動的相互作用の両側を想像するために不可欠です。EPNと昆虫の宿主関係をよりよく理解することは、間違いなく哺乳類寄生線虫との同様の研究を促進し、ヒト免疫系を妨げる感染因子の同定および特徴付けにつながる可能性がある。

EPN線虫ヘテロラブディティス属およびSteinernema sp.は広範囲の昆虫に感染することができ、その生物学は以前に激しく研究されてきた。2つの線虫寄生虫は、ヘテロラブディティスが自己受精し、Steinernemaが両生繁殖を起こして生殖様式が異なるが、最近S. hermaphroditumは雌雄同体の自己受精または単為生殖を介して繁殖することが示された7,8,9。ヘテロラブドリティスとスタイナーネマ線虫のもう一つの違いは、グラム陰性菌の2つの異なる属、フォトラブダスとキセノラブドゥスとの共生的相互主義であり、これらは両方とも昆虫の強力な病原体である。これらの細菌は、EPNの自由生活および非摂食感染性幼若(IJ)段階で発見され、感受性宿主を検出し、昆虫ヘモコエルにアクセスし、そこで急速に複製する関連細菌を放出し、昆虫組織に定着する。EPNとその細菌の両方が、昆虫の防御を武装解除し、恒常性を損なう病原性因子を産生する。昆虫の死に続いて、線虫IJは成体EPNになり、そのライフサイクルを完了するために発達する。昆虫の死体内の食糧不足と過密化に対応して形成されたIJの新しいコホートは、適切な宿主9,10,11,12を狩るために土壌中に最終的に出現する。

ここでは、EPN線虫を維持、増幅、および遺伝的に操作するための効率的なプロトコルが記載されている。特に、このプロトコールは、共生性H.バクテリオフォラおよびS.カルポカプサエIJの複製、軸索線虫IJの生成、マイクロインジェクションのためのH.バクテリオフォラ雌雄同体の生産、dsRNAの調製、およびマイクロインジェクション技術を概説する。これらの方法は、線虫病原性および宿主抗線虫免疫の分子基盤を理解するために不可欠である。

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Protocol

1. 共生線虫感染性幼体の産生

  1. ペトリ皿(10cm)をろ紙で覆い、約10〜15匹の ガレリアメロネラ 幼虫を追加します(図1A)。
  2. ピペットを用いて、懸濁液10μLあたり約25〜50IJを含む2mLの水をワックスワーム上に分注する。ペトリ皿を室温でキャビネットに保管してください。
  3. ろ紙の水分に応じて、2日ごとに1〜2mLの水を加える。IJに感染したワックスワームは、通常、48時間以内に死亡する。
  4. ワックスワームがIJs8 に感染してから約10日後にホワイトのウォータートラップを準備します(図1B、C)。死んだ昆虫を濾紙の浸されていない部分に慎重に移す。水道水を使用して底のペトリ皿を満たし、換気用のスペーサーとして15mLチューブのキャップを置きます。
  5. 柔らかく壊れやすいワックスワームは、プラスチック製の鉗子を使用してろ紙からゆっくりと持ち上げて慎重に移します。脱塩水や脱イオン水の代わりに水道水を使用してください。後者は線虫凝集を引き起こす。
    1. ウォータートラップ内の水位がペトリ皿の高さの約半分に達していることを確認します。部屋の温度や湿度条件によって水位が経時的に変化することが予想されます。
  6. 線虫の存在により小さなシャーレ内の水が濁ったら、ピペットを使用して新世代のIJをT25またはT75細胞培養フラスコに移動します。
  7. 適切な密度に達するまで、体積の約40%まで水道水を加えます(図1C)。線虫の鬱血を避け、細胞培養フラスコを水平に保管してください。
  8. 下部のペトリ皿に水を加え、IJが約3〜5日で昆虫の死骸から出現しなくなるまで、ステップ1.6と1.7を繰り返します。

2. アキセン線虫感染性幼体の産生

注:軸索線虫が使用されるのは、線虫 - 細菌複合体が昆虫内で解離した後、各相互主義的パートナーが別個の宿主免疫応答を惹起するからである5。Photorhabdus temperataの変異株Ret16は、これらの細菌がH. bacteriophoraの増殖を支持するが、線虫腸内に定着できないため、使用される13,14。

  1. Heterorhabditis bacteriophora 感染性未成年者
    1. 滅菌ピペットチップまたはヘラを使用して、 P. temperata Ret16の凍結培養物のいくつかのフレークをMacConkeyプレート上にこすり取り、単一コロニーの筋状にする。プレートを28°Cで2〜3日間インキュベートする。
    2. 50 mLチューブに10 mLのLBブロスにコロニーを接種し、振とうインキュベーター内で28°Cで一晩培養物をインキュベートする。MacConkey寒天培地で赤色の主期コロニーのみを使用してください。二次期のコロニーは、MacConkey寒天培地ではオフホワイトになります。
    3. 100 μL の一晩培養物を 900 μL の 1x PBS で洗浄し、1.5 mL の微量遠心チューブで 17,900 x g で遠心分離します。上清をデカントする。培養物を1x PBSで10倍に希釈する。チューブを氷の上に置きます。
    4. ワックスワームを70%エタノール溶液に浸し、ペーパータオルで昆虫を乾燥させ、50mLチューブに入れる。
    5. チューブを氷の上に20分間置き、ワックスワームを固定します。
    6. ろ紙を使用して、ペトリ皿(10 cm)の上半分と下半分を覆います。ろ紙で覆われたシャーレの蓋を注射用のベースサポートとして使用します。底のペトリ皿のろ紙を湿らせ、注入されたワックスワームが回復するのを助けるために氷の上に移す。
    7. パラフィルム片に氷冷細菌50μLをピペットし、22Gニードルシリンジを調製した。プランジャーを軽く押して、針の先端にある空気を取り除きます。
    8. ワックスワームをステレオスコープの下の後端に近づけます(図2)。
    9. 50μLの細菌培養物を胸郭の背側、好ましくは2つのセグメント間の接合部に注入する。内部損傷を最小限に抑えるには、キューティクルのすぐ下に、ワックスワームとできるだけ平行に注入します。ワックスワームを穿孔すると血リンパ液滴が滲み出るのは自然なことです
    10. 注入された昆虫を回収ペトリ皿に移す。
    11. すべての昆虫に細菌が注入されるまで、手順2.1.7-2.1.9を繰り返します。昆虫を麻酔するには、氷の上に5分間置く。
    12. ペトリ皿を暗闇(引き出しやキャビネットなど)に置き、乾燥しているように見える場合はろ紙に水道水を加えます。ワックスワームは注射の2日後に屈服し、約3〜4日後にレンガの赤く見えます。昆虫が茶色に見える場合、細菌感染は失敗している。
    13. 感染後7日目に、特徴的なレンガ色の赤色の昆虫を新鮮なろ紙が敷かれたペトリ皿に移し、ステップ1の「共生線虫感染性幼体の産生」を続行する。共生線虫を使用する場合は、ステップ2.1の手順を繰り返します。第1ラウンドで新しく生産されたIJを使用する。
    14. 表面殺菌 H.バクテリオフォラ IJs
      1. 十分な共生 H.バクテリオフォラ および候補軸索IJを遠心分離によって収集し、1.5mL遠沈管に100μLペレットを作製する。
      2. 各微量遠心管内のペレットに500μLの5%漂白剤を加え、反転させる。10分間インキュベートする。17,900 x g で 1 分間遠心分離する。上清を除去する。
      3. ペレットを1mLの滅菌水で洗浄し、遠心分離を繰り返す。上清を除去する。この手順をさらに 4 回繰り返します。
    15. アキセニシティの検証
      1. 洗浄した共生および候補軸索 H.バクテリオフォラ 線虫に滅菌水400 μLをピペット。
      2. 線虫をペトリ皿の昆虫の上に置き、それに応じて治療にラベルを付けます。
      3. 感染した昆虫と一緒にペトリ皿を暗闇の中に置き、ワックスワームが赤くなるかどうかを定期的に確認してください。
        注: H.バクテリオフォラ 共生線虫に感染したワックスワームは、感染後2日以内に赤色になります。ワックスワームの変色は、感染プロセス中に相互主義的な フォトラブダス 細菌によって産生される様々な化合物の分泌によるものである。感染後4日目に感染したワックスワームの赤色の欠如は、 H. bacteriophora がアキセニックであることを確認する。これは、 P. temperata Ret16細菌が線虫腸内に存在しないためである。
    16. 軸索性を検証するための代替方法
      1. 工程2.1.14で説明したように、共生性 H.バクテリオフォラ IJsおよび候補-軸索 H.バクテリオフォラ IJsを表面滅菌する。
      2. 滅菌乳棒を使用して、マイクロフュージチューブ中の滅菌1x PBSの500μL中の約500個のIJを均質化する。ホモジネートをスピンダウンし、上清をデカントし、LB寒天上に広げる。プレートを28°Cで24時間インキュベートする。
      3. 各プレートのコロニー形成単位(CFU)を数えます。軸索 H.バクテリオフォラ 由来の試料は、共生 P.ルミネッセンス 属細菌のコロニーを形成しない。
  2. Steinernema carpocapsae 感染性未成年者
    1. 脂質寒天プレートの調製(300mL溶液で約20枚のスプリットプレートを作る)
      1. 栄養ブロス2.4g、酵母エキス4.5g、寒天1.5gの秤量し、267mLの脱イオン水に加える。溶液をオートクレーブする。
      2. 3 mLの1 M MgCl 2、1.2 mLのコーンオイル、および28.8 mLの7%コーンシロップを加える。
      3. 30 mg/mL カナマイシン 300 μL および 50 mg/mL アンピシリン 300 μL (0.2 μm フィルターで滅菌) を調製して加えます。
      4. ミックスを分割ペトリ皿/スプリットプレートの半分にデカントします。
    2. X.線虫(ΔrpoS株)細菌芝生の調製
      1. 培養 物 X. 線虫 (Xn) ΔrpoS を凍結細菌ストックから直接 LB/kan/amp 溶液 2 mL をシェーカー上で 30 °C 一晩。
      2. 30 μg/mL カナマイシンおよび 50 μg/mL アンピシリンを含む LB 培地 5 mL に 250 μL の一晩培養物を接種し、シェーカーで一晩細菌を増殖させます。
        注:Xn細菌は、凍結ストックから選択脂質寒天培地に直接縞模様を付けるとよく増殖しません。必要に応じて、新鮮な液体培養を開始する前に、一次相および第二次相XnをNBTA培地(25mgのブロモチモールブルーl−1および40mgのトリフェニルテトラゾリウムクロリドl−1を添加した栄養寒天)で最初に確認することができる。
      3. 培養物のピペット100 μLを脂質寒天プレート上に、滅菌接種ループでプレート全体に広げた。プレートを30°Cで24時間インキュベートする。
    3. 表面殺菌 S. carpocapsae IJ
      1. IJが入ったフラスコを、IJがフラスコの角に沈むような角度で放置します。沈降したIJの1mLを微量遠心管に吸引する。17,900 x g で 10 秒間遠心分離機。上清を除去する。
      2. 1%新しく調製した1%漂白剤溶液1mLを加える。チューブを反転させて徹底的に混合します。1分間インキュベートする(長時間の漂白剤インキュベーションはIJ死につながる)。もう一度10秒間スピンし、上清を除去します。
      3. 漂白剤残渣を除去するには、線虫を1mLの滅菌蒸留水で洗浄し、10秒間遠心分離する。洗濯をさらに4回繰り返します。
      4. 洗浄されたIJを立体鏡で10〜20μLカウントすることによってmLあたりのIJカウントを推定し、それに応じてIJの濃度を調整する。
    4. S. carpocapsae IJの飼育
      1. 約1000IJsをピペットで脂質寒天スプリットプレート上に移す(図3、左画像)。プレートを加湿したキャビネットまたは引き出しに入れます。湿らせたペーパータオルを使用して水分を増やします。プレートを室温(22-25°C)に維持します。
      2. ペーパータオルを1日おきにチェックして、湿った状態を保っていることを確認してください。必要に応じて、キャビネットまたは引き出しの湿度を維持するために、ペーパータオルに1日おきに水を加えます。または、キャビネットの底にウォーターバスを配置して湿度を上げます。
      3. IJのみが表示された場合は、プレートの反対側に水を加え、プレートの中央にろ紙の層を置きます(ウォータートラップ、図3、右 図)。第1ラウンドIJを含むこの水をT75細胞培養フラスコに集める。これらはラウンドI S.カルポカプサエ 線虫です。
      4. 漂白剤で表面殺菌し(ステップ2.2.3)、ラウンド1 S. carpocapsae 線虫を使用してステップ2.2のプロセスを繰り返す。結果はラウンド2 S. carpocapsae 線虫になります。
      5. 線虫の発達を追跡するために数日ごとにステレオスコープでチェックしてください。
    5. S. carpocapsae IJの軸索状態の検証
      1. ステップ2.2.3で説明したように、ラウンド1、ラウンド2、および共生 S.カルポカプセ IJを漂白剤で表面滅菌します。
      2. 滅菌プラスチック乳棒を使用して、マイクロフュージチューブ内の約400〜700個のIJを均質化する。ホモジネートを遠心分離し、上清をデカントし、溶液をLB寒天プレート上に広げる。寒天プレートを28°Cに設定したインキュベーターに24時間保管してください。
      3. 各プレートのCFUの形成をカウントします。軸索性線虫からのサンプルは、細菌の増殖を生じさせない。
    6. PCRによる S. carpocapsae IJの軸索状態の検証
      1. ステップ2.2.3で説明したように、ラウンド1、ラウンド2、および共生 S.カルポカプセ IJを漂白剤で表面滅菌します。
      2. ホモジネートからDNAを抽出します。詳細な抽出手順については、以下のセクション 4.1.2 で説明します。
      3. アニーリング温度61°CのXptA2プライマーを用いてPCRを行う:
        ティッカー F: 5'-GCCTGGAAAGAGTGGGGACGAA-3'.
        ティッカー R: 5'-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3'.
        注:これらのプライマーは、線虫菌の殺虫遺伝子XptA2を増幅し、231 bpサイズのアンプリコンを生成します。サイクリングプログラムは、95°Cで2分間、95°Cで30秒間を34サイクル、アニーリング温度を61°Cで1分間、73°Cで1分間、続いて72°Cで10分間行った。
      4. 増幅された断片を1.5%アガロースゲル中で分離して可視化する。axenic表面滅菌サンプルはバンドを形成しません。

3. マイクロインジェクションのためのH.バクテリオフォラ雌雄同体を飼育する

  1. NA+chol(1.5倍の栄養スープ、1.5%寒天、および10μg/mLコレステロール)を含む6cmのシャーレプレートを用意する。
  2. 3 mLのPP3溶液(2%プロテアーゼペプトン#3、PP3)を10 mLの培養管に調製する。
  3. 滅菌 20 μL チップを使用して、-80 °C に維持された P. ルミネッセンス グリセロールストック (25% vol/vol 滅菌グリセロール) の上部をこすり取り、培養管に落とします。
  4. チューブを28°C、200rpmに設定した温度制御シェーカーで一晩インキュベートする。
  5. 翌日、培養物の色は淡い赤色になります。培養物50 μLを6 cm NA+cholペトリ皿にプレートし、細菌スプレッダーを使用して円形に広げた。
  6. プレートを28°Cのインキュベーターに入れる。 P.ルミネッセンス 芝生は24〜36時間で準備が整い、色は淡い赤色に見えます。
  7. プレートに50〜100個の表面滅菌IJを接種し、プレートを28°Cに維持する。
  8. 健康なL4雌雄同体が接種後約48〜54時間に現れ始めます。健康な、飢餓していない後期L4 H.バクテリオフォラ 雌雄同体が注射に必要です。

4. dsRNAの調製

  1. プライマー設計
    1. H.バクテリオフォラDNAの〜500塩基対エクソン領域を標的とするdsRNAのプライマーを設計する。
      1. 関心領域のプライマーは、Primer3(https://primer3.ut.ee)または同様のプログラムを用いて決定することができ、最適な生成物長500塩基対、Tm60°C、およびプライマー長22ヌクレオチドについて選択することができる。
      2. 各フォワードプライマーの5'末端にT7部位(TAATACACTCACTATAGGG)を付加して、インビトロ転写を可能にする。
  2. ゲノムDNA単離
    1. dsRNA合成には、約50,000H .バクテリオフォラ IJの凍結ペレットから単離されたゲノムDNAを使用します。
    2. 50 μL の溶解バッファー (50 mM KCl、0.05% (w/v) ゼラチン、10 mM Tris-HCl pH 8.2、0.45% Tween 20、60 μg/mL プロテイナーゼ K、2.5 mM MgCl2) に再懸濁した IJ ペレットを -80 °C に少なくとも 30 分間置きます。
    3. 小さなチューブ乳棒でペレットを均質化する。
    4. 溶液を室温に温め、60°Cで2時間インキュベートし、15分ごとにボルテックスする。
    5. ホモジナイズした組織を95°Cで15分間インキュベートすることによりプロテイナーゼKを変性させる。
    6. サンプルを4°Cに冷却し、3,400 x g で1分間遠心分離します。
    7. 得られた上清をその後のPCRの鋳型として使用します。
    8. 市販のマスターミックスと 200 ng の鋳型 DNA、0.2 μM のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、およびメーカーが推奨するサイクリング条件を使用して、50 μL PCR 反応をセットアップします。
    9. 1.2% アガロースゲル上の PCR 反応を分析して、反応が予測サイズの単一バンドを生成したことを確認します。
  3. dsRNA 合成
    1. 市販の文字起こしキットを使用してください。
    2. インビトロ転写には5 μL PCR反応を使用します。製造元の指示に従います。
    3. 反応物を37°Cで16時間インキュベートする。
    4. dsRNAを濃縮するために酢酸アンモニウム/エタノール沈殿を使用して市販のキットでin vitro転写反応を洗浄する。
    5. ペレット状のdsRNAを10μLのRNaseフリー水に懸濁する。
    6. 分光光度計を用いてRNAを定量する。
    7. 1.2%アガロースゲル上のdsRNAを分離して品質を評価する

5. マイクロインジェクション

メモ:インジェクションパッドは、中央に2%(w / v)のアガロースの層が付いたガラスカバースリップです。注入されるワームがこれらのパッドに移されると、アガロース層は手順のためにそれらを固定化する。通常、余分なパッドは、一般的な使用のために顕微鏡の近くに保管されています。

  1. インジェクションパッドの準備
    1. 10mLの水に0.2gのアガロースを加えて、2%のアガロースを水で沸騰させる。
    2. 50 mm x 70 mm の薄いガラスカバースリップの中央に 1 ~ 4 滴 (~50 μL) を置きます。
    3. 別のカバースリップを使用して、ドロップを平らにします。
    4. カバースリップを2~3分間乾かしてから、カバースリップを横にスライドさせます。
    5. 上向きのカバースリップの右側に「R」を付けます。
    6. スライドを使用する前に、スライドを室温で1日間乾燥させます。
  2. 注射針の調製
    1. 内部の微細フィラメントを含む1.0mmのガラスキャピラリーを使用してください。これにより、針の効率的な充填が可能になる。
      注:任意の市販のニードルプーラー(例えば、ナリシゲPB-7)を使用することができます。
    2. 針引き器をオンにします。
    3. ヒーターが最大に設定され、ソレノイドが8.40に設定され、必要な針の鋭さと適切な長さを確認してください。
    4. キャピラリーチューブをフィラメントを通して上部ノブリッジに挿入し、上部ノブを締めます。キャピラリーチューブの上部はニードルプーラーの上部と水平になり、加熱フィラメントはキャピラリーの中央になります。
    5. 下部ユニットを上部に移動し、下部ノブを締めます。毛細血管がしっかりと配置されていることを確認してください。
    6. ニードルプーラーのカバーを閉じ、スタートボタンを押します。緑色のライトが点灯します。数分後、毛細血管は加熱され、引き離されて2つの半分に分かれます。
      注:2本の分離された針は同じ長さではありませんが、両方とも注射に使用できます。針先が長い方が好ましい。
    7. モデリング粘土を使用して、針を垂直位置に配置し、その点を下向きにします。あるいは、針を2枚のモデリング粘土で固定されたペトリ皿に保管します。
  3. 針を装填する
    注:懸濁液中に存在する可能性のある不純物をペレット化するには、核酸溶液を20,784 x g で少なくとも10分間遠心分離する必要があります。不純物の遠心分離は、それらが注射針の流れを遮断するのを防ぎます。
    1. 2つの方法のいずれかを使用して、針に核酸をロードします。
    2. 方法1
      1. ピペットを使用して、遠心分離したDNAサンプルの約0.5 μLを注射針の引き抜かれていない端に移します。これは、キャピラリーチューブの上に座っている液体の小さな滴として表示されます。
      2. 液体サンプルが針の端を占めるように5〜7分間待機します。最終製品は、気泡が存在しない充填された針になります。
      3. 解剖顕微鏡を使用して、注射前に針先の溶液の存在を確認します。
    3. 方法2
      1. マイクロインジェクターのローディングチップを使用してください。
      2. このローディングチップを用いて、5 μLの核酸溶液をピペットでつないだ。
      3. 引っ張った針が針引き器についた状態で、上のつまみを緩め、上の引っ張った針を少し上方向に動かして、つまみを締め直します。
      4. ローダーの先端をキャピラリーチューブに慎重に挿入し、注射針の底まで伸ばします。
      5. 核酸溶液を注射針にピペットで入れる。
      6. 引いた針からローダーを取り外し、必要に応じてさらにローディングするためにローダを別々に保管します。別の核酸ミックスをロードするときは、必ずローダーを切り替えてください。
  4. 射出顕微鏡の準備
    注:顕微鏡ベースからの拡散照明を備えた倒立顕微鏡は、ワームの準備、マイクロインジェクション、および回収に使用されます。対物レンズが10倍および40倍に及ぶ高解像度倒立顕微鏡の使用が説明されています。顕微鏡には、針を保持し、注射用の所定の位置に収める針マニピュレータが装備されています。マイクロインジェクションオイルは、インジェクションパッドのアガロース層上にワームが急速に脱水するのを防ぐために使用されます。使用する推奨オイルはハロカーボンオイル700です。
    1. ランプのスイッチを入れ、コントロールパネルで明るさを調整します。
    2. コンデンサーウォラストンプリズムの番号を確認してください。それは使用された目的(40倍)に対応します。
    3. 「DIC」でマークされたDIC砲塔が正しい位置にあることを確認します。
    4. 目標のつまみがゼロ(0)に設定されていることを確認します。
    5. Phリングを最後まで右に回します。
    6. 矢印が水平になるように偏光子を調整します。
    7. ステージ上に紙を1枚置いて、焦点(光)を観察します。
    8. 用紙に斑点があるところまでフィールドダイアフラムを閉じます。
    9. 左側のダイヤルを使用して、コンデンサーを上下に動かして、ピースペーパー上の非常にシャープな光スポットが見えるようにします。
    10. フィールドダイアフラムをゆっくりと開き、小さな光の円が見えるようにします。
    11. 紙片を取り除いてください。
    12. ライト スポットが目標の中心にあることを確認します。それ以外の場合は、コンデンサーの上部にある銀色のネジを調整して、ライトスポットを対物レンズの中心に揃えます。
    13. フィールドダイヤフラムを完全に開きます。
    14. アナライザICT/Pが押し込まれていることを確認します。
  5. 顕微鏡への注射針の装着
    1. マイクロインジェクション針への窒素ガスの流れをオンにします。針へのガス圧は約20psiになります。
    2. マイクロマニピュレータノブ(針を動かす顕微鏡の部分)が中央に配置され、針が取り付けられたときに最も広い可動域が可能であることを確認します。
    3. 金属棒を保持しているアセンブリのネジを外して、ニードルホルダーから取り外します。
    4. 顕微鏡の上部に新しい針を挿入します;次に、ゴム製ガスケットを取り付けて針を所定の位置に保ちます。
    5. ニードルホルダーの底部をアセンブリに取り付けて固定します。
    6. マイクロマニピュレータの溝に針を入れ、正しくネジで締めて安定させます。ネジがマイクロマニピュレータの端から約 1 インチ離れていることを確認します。
    7. マイクロマニピュレータのノブと粗いコントロールを使用して、針の先端をステージプレートに対して約45°の角度で視野の中央に置きます。針先が誤って折れないように、針先を十分に高くしておくことが重要です。
  6. 針を折る
    1. 針をマイクロマニピュレーターに置き、針の先端が通常壊れる場所に置き、核酸溶液が針の中を流れるようにします。
    2. キャピラリーを壊し、マイクロインジェクションオイルを一滴運ぶスライドガラスの上に置きます。
    3. スライドを顕微鏡の上に置き、焦点を合わせます。
    4. 顕微鏡の細かいコントロールを使用して、針の先端を毛細血管の側面と同じレベルにします(図4)。
    5. フットアクチュエーターを使用して窒素の流れを短時間オンにし、針の先端が折れていないことを確認します。迅速なオン/オフで十分です。
    6. 針を優しく動かして、毛細血管の側面にほとんど触れないようにします。
    7. 顕微鏡の側面を軽く叩いて針先を折ります。
    8. 針を毛細血管から取り外し、窒素フローをオンにして、針が正しく壊れていることを確認します。
    9. 針は、針の先端の約5倍の大きさの小さな注射滴を作り出します(図4)。注入ドロップのサイズが小さい場合は、先端をさらに壊します。注射液滴のサイズが大きい場合は、新鮮な針を使用してみてください。

6. マイクロインジェクション

  1. 注入パッド上のマイクロインジェクションオイルの滴をピペットで留める。
  2. マイクロインジェクションオイルドロップに火炎滅菌ピックを浸し、若いHを集め ます。プレートからの バクテリオフォラ 成虫線虫。
  3. 細菌芝生に近くないプレートの部分から線虫を選んで、多数の細菌細胞が注射パッドに移るのを防ぎます。また、整形した生殖腺を持つ線虫を収穫する。
  4. 線虫を注射パッドに移動し、生殖腺が針に向くように垂直に配置します。外陰部が注射針と同じ方向を指し、2つの遠位生殖腺腕が反対方向にあり、線虫の体壁に対して上向きであることを確認してください。
    注: Pristionchus pacificusと同様に、 H. bacteriophora の生殖腺は腹側外陰部位置から背側に移動し、その後腹側位置に戻る。
  5. 線虫が歩き回るのを許さずに線虫の乾燥を防ぐのに十分な量の油分があることを確認してください。
  6. 線虫を10倍の対物レンズでピントを合わせるには、針をスライドのかなり上に保持します。油では、線虫の生殖腺は、ワームの前部および後部に近い2つの明確な領域として見なされる。生殖腺がワームの他の部分ではなく、焦点を合わせていることを確認してください。
  7. 線虫を注射針に向かって15°〜45°の角度で配置し、生殖巣の内側の針により多くのスペースを与えます。また、このアプローチは、針が生殖腺の内部に導入されたときに針が線虫本体全体を通過するのを防ぐ。
  8. 注射針と線虫を同じレベルに位置付け、針が焦点を合わせるまで針を徐々に下げます(図5)。針が下がったとき、それは線虫の隣にとどまり、ワームの上ではないことを確認してください。
  9. 40xの目的を使用して、線虫の合胞体生殖腺腕に焦点を当てます。
  10. 先端が線虫合胞性生殖腺腕と一緒に焦点を合わせるまで、細かいアジャスターを使用して針を上下に動かします。
  11. 線虫をスライドステージを使用して針に向かってゆっくりと動かします。次に、線虫の体壁に針を当てて位置させるために生殖腺を静かに押し込み、線虫体内に効率的な針の浸透をもたらす。
  12. フットアクチュエータを短時間踏み込み、核酸溶液の流れを開始する。迅速なオン/オフで十分です。針が生殖腺の内側にある場合、生殖腺は溶液で満たされ、腫れます。
  13. 針が正しい位置に確保されたら、生殖巣の腕が満たされるまで核酸溶液で生殖巣を満たします。針がそれを穿刺した穴を通してワームから液体が排出されるのを避けることが重要です。
  14. スライドステージを使用して、ワームを針から慎重に離します。
  15. 針を持ち上げて反時計回りに回します。
  16. ワームの上に1x PBSバッファをドロップしてフロートさせます。
  17. 火炎滅菌ピックを使用してワームを持ち上げ、新鮮な P.ルミネッセンスの 播種プレート上のM9の別の滴に入れて、ワームから余分な油を取り除きます。
  18. M9から線虫を取り除き、細菌芝生の向こう側に置きます。
  19. 同じプレートを使用して、注入された複数の線虫を移します。
  20. 2〜3日で、トランスジェニック表現型について第1世代(F1)線虫を評価する。トランスジェニックF1線虫を個々のプレートに分離して、どのワームが安定したトランスジェニックラインを生成するかを決定します。

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Representative Results

軸索化を経た H.バクテリオフォラ 線虫の状態を評価するために、IJsにおける P.ルミネッセンス 細菌コロニーの有無を決定した。これを行うために、以前に表面滅菌され、PBS中で均質化された約500のIJのペレットが収集された。陽性対照処置は、共生 P.ルミネッセンス 細菌を含む線虫培養物からの約500個のIJのペレットから成っていた。軸索化線虫および陽性対照線虫のペレットを1x PBS中でホモジナイズした。ホモジネートを寒天上にピペットで処理し、個々のコロニーの成長を促進するために広げた。寒天プレートを28°Cで24時間インキュベートした。翌日、 P.ルミネッセンス コロニー(CFU)の発生は観察されなかった。予想通り、ストック培養 物からのH.バクテリオフォラは 共生 P.ルミネセセン細胞 を運んだ。しかし、関連する P. luminecens 属細菌を欠いた線虫は軸索性であり、将来の実験のために別々に保存された(図6)。

nol-5遺伝子発現のノックダウンは、マイクロインジェクションプロセスを用いたRNAiの有効性を示すために例として用いた。マイクロインジェクションは親世代で実施され、その効果はF1子孫で観察された。RNAiマイクロインジェクションを用いたnol-5のノックダウンは、子孫の60%の生殖巣に生殖細胞系列の不在をもたらした(図7)。

Figure 1
図1:感染性幼体の生成(昆虫病原性線虫の自由生活段階)。(a)ガレリア・メロネラ昆虫幼虫(ペトリ皿に保管)と線虫感染性幼若体(組織培養フラスコに保管)との感染。(b)ウォータートラップの準備のためのろ紙の破片の折り畳み。(c)感染性幼体を含む死んだガレリア・メロネラ昆虫幼虫(線虫感染後12日目)を有する昆虫病原性線虫のウォータートラップの配置。新世代の感染性幼体は死んだ昆虫を残して水に移動し、その後組織培養フラスコに貯蔵されます。画像はBioRenderグラフィックソフトウェア(https://biorender.com)を使用して作成されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2: ガレリア・メロネラ 昆虫の幼虫と細菌株 Photorhabdus temperata Ret16との注射。 ワックスワームはペトリ皿に保管され、冷たい処理によって固定化されます(すなわち、氷の上に数分間置かれます)。昆虫体の後部を一対の鉗子で押さえて、注射に適した腫れた表面を作り出す。注入角度は浅く、不注意な取り扱いのために昆虫の死につながる内部昆虫組織を傷つけるのを防ぎます。画像はBioRenderグラフィックソフトウェア(https://biorender.com)を使用して作成されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:軸索性 スタイネルネマ・カルポカプサエ・ 昆虫病原性線虫の生成。 分割されたペトリ皿の半分には、脂質寒天上の ゼノラブドゥス線虫ΔrpoS 細菌の芝生と S. carpocapsae 線虫の感染性幼体が含まれています。この in vitro 法は、感染性幼体を成虫線虫に誘導し、その後、新世代の寄生虫を生じさせるために孵化する卵を産生する。分割されたペトリ皿のこの部分に多数の新しく生成された S. carpocapsae 感染性幼体が現れると、線虫の移動を促進するために濾紙とともに皿の他の半分に水が加えられる。画像はBioRenderグラフィックソフトウェア(https://biorender.com)を使用して作成されています この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:針先を壊す 針の先端は通常閉じています。核酸溶液の適切な流れは、実際の注射を行う前にチェックされる。スライドガラスの上に、ハロカーボンオイルを一滴置きます。針を作るのに使うキャピラリーチューブを図のように縦置きします。毛細血管を40倍に焦点を合わせ、針を毛細血管と水平に静かに下ろします。針先を毛細血管にそっと触れます。これにより、dsRNAのスムーズな流れのための開口部が作成されます。液体が出てこない場合は、フットアクチュエータを使用して窒素を素早くオンオフします。窒素からの圧力と針先と毛細血管との接触は針を折るでしょう。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:注射部位H. bacteriophoraの生殖腺は、腹側外陰部位置から背側に移動し、その後腹側位置に戻る。移動する腕は外陰部の近くで互いに交差し、両側の外陰部を超えて伸びています。約48時間で、IJから成長した若年成人の生殖腺の伸長する腕が外陰部の近くに見える。マイクロインジェクションはこの位置で行われる。スケール バー: 0.1 mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:ヘテロラブディティス・バクテリオフォラ・アキセニン化の検証。 軸索化手順の成功は、処理されたH.バクテリオフォラ感染性幼体におけるPhotorhabdus luminescens細菌細胞の不在を確認することによって推定された。このために、ストック培養物から約500個の表面滅菌ワーム(共生)または軸索化プロセスを経たワーム(axenic)のペレットを均質化した。次いで、ホモジネートを寒天プレート上に広げ、24時間インキュベーションした後、細菌コロニー(コロニー形成単位、CFU)の外観をモニターした。プレート上の細菌コロニーの欠如は、H. bacteriophora線虫がそれらのP. luminescens共生細菌を含まないことを示唆している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:RNAi媒介性ノックダウンのnol-5遺伝子。H. bacteriophora nol-5遺伝子のRNAi媒介ノックダウンは、生殖細胞系列を有さない表現型をもたらす。野生型、非注射H.バクテリオフォラ線虫(a)の子孫は、その生殖腺に卵を含む。野生型、nol-5 RNAi注射H. bacteriophora線虫(b)の子孫は、nol-5 RNAのノックダウンのために空の生殖腺に卵を含まない。スケール バー: 0.1 mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

昆虫病原性線虫感染および昆虫抗線虫免疫の分子基盤を理解するには、相互に関連する細菌から寄生虫を分離することが必要である13、15、16。昆虫病原性線虫H.バクテリオフォラおよびS.カルポカプセは、それぞれグラム陰性菌P.ルミネッセンスおよびX.線虫と共に生息する17。両方の細菌種は、昆虫組織を標的とし、感染中の自然免疫系に対抗することによって病原性を付与する因子をコードすることが以前に示されている18,19。これは、線虫が昆虫宿主と相互作用するように進化した戦略を特定する努力を妨げる。したがって、感染プロセスにも関与する線虫成分の遺伝子ノックダウンによる同定および機能的特徴付けは、軸索虫の発生によって促進され得る。ここでは、軸索昆虫病原性線虫を産生し、H.バクテリオフォラにおいてRNAi遺伝子サイレンシングを行うための効率的なプロトコールが提示される。

軸索性線虫を首尾よく生成するための両方のプロトコルにおける重要なステップは、H. bacteriophoraおよびS. carpocapsae IJsの表面滅菌である14,20。この方法のこの部分は、漂白剤溶液によるワームの処理を含み、線虫キューティクルからP.ルミネッセンスおよびX.線虫細菌を除去するので、軸索化プロセスの成功にとって重要であると考えられている。これは、ワームの表面上の相互主義的な細菌のみが除去され、寄生虫内の細菌が除去されないようにするための重要な手順です。このステップの完了は、延長された漂白剤処理が線虫の生存率に影響を与えるため、注意が必要である。

S. carpocapsae線虫に対する本アキセン化プロトコルと以前に確立された方法との類似性は、ワーム21に定着することができないX.線虫ΔrpoS変異細菌の使用である。現在の方法論と、表面滅菌線虫卵を栄養寒天22に導入した以前に報告されたプロトコルとの違いは、線虫の成長と適応度に影響を与える可能性のある微生物汚染を抑制するために抗生物質を培養培地に添加することです。

マイクロインジェクションによるRNAiは、卵母細胞にRNAを送達する簡単で信頼性の高い方法である。生殖巣内の液体のバーストは、注入プロセス中の核酸溶液の放出を視覚的に確認する。マイクロインジェクションによるRNAiは、浸漬によるRNAiよりも有意に優れていることが示された。これはおそらく、生殖腺内の分化の異なる段階にある卵母細胞に到達するRNAi溶液の能力によるものである。

プロセスを最適化しながら、より良い結果を得るために異なる濃度のRNA溶液を試験することが推奨される。50 ng/μL から 10 μg/μL までの様々な濃度の RNA を試験しました。6μg/μLの濃度が他の濃度よりも良好に機能することがわかった。イン ビトロ 転写工程中のRNA収率を増加させるために、プロトコールを4時間のインキュベーション期間から16時間に変更した。これは、RNAの最終収率の大幅な増加をもたらした。マイクロインジェクションを成功させるための重要な要素の1つは、線虫が注入パッドに費やす時間の長さです。時間が短くなると、健康な生存線虫および健康な子孫が得られ、意図された表現型を観察する機会が増加する。

昆虫病原性線虫を培養し、遺伝的に操作するための現在のプロトコルは、線虫学、免疫学、および宿主 - 寄生虫相互作用の分野における将来の研究に大きく貢献している。昆虫病原性線虫の操作を可能にするアプローチを組み合わせることで、線虫エフェクター分子と、抗線虫特性を有する因子をコードする宿主免疫シグナル伝達成分との間の相互作用を定義する遺伝的因子の発見につながる。さらに、どの重要な線虫分子成分が関連細菌との共生関係を決定するかを決定する。これらの質問に答えることは、農業慣行を改善し、ヒト寄生線虫の防除のための新しい手段を開発するために重要である。

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Disclosures

著者らは、競合する利益を宣言していない。

Acknowledgments

ジョージワシントン大学生物科学部のメンバーに、原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。すべてのグラフィカルな図はBioRenderを使用して作成されました。I.E.、J.H.、D.O'H.の研究研究室は、ジョージワシントン大学とコロンビア芸術科学大学によって支援されており、資金と学際的な研究資金を促進しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

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References

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