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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

Los nematodos entomopatógenos viven en simbiosis con las bacterias y juntos infectan con éxito a los insectos al socavar su sistema inmunológico innato. Para promover la investigación sobre la base genética de la infección por nematodos, se describen métodos para mantener y manipular genéticamente los nematodos entomopatógenos.

Abstract

Los nematodos entomopatógenos de los géneros Heterorhabditis y Steinernema son parásitos obligados de insectos que viven en el suelo. La principal característica de su ciclo de vida es la asociación mutualista con las bacterias Photorhabdus y Xenorhabdus, respectivamente. Los parásitos nematodos son capaces de localizar e ingresar a los huéspedes de insectos adecuados, subvertir la respuesta inmune del insecto y multiplicarse de manera eficiente para producir la próxima generación que cazará activamente nuevas presas de insectos para infectar. Debido a las propiedades de su ciclo de vida, los nematodos entomopatógenos son agentes de control biológico populares, que se utilizan en combinación con insecticidas para controlar las plagas destructivas de insectos agrícolas. Simultáneamente, estos nematodos parásitos representan una herramienta de investigación para analizar la patogenicidad de los nematodos y las respuestas anti-nematodos del huésped. Esta investigación es ayudada por el reciente desarrollo de técnicas genéticas y enfoques transcriptómicos para comprender el papel de las moléculas secretadas por nematodos durante la infección. Aquí, se proporciona un protocolo detallado sobre el mantenimiento de nematodos entomopatógenos y el uso de un procedimiento de eliminación de genes. Estas metodologías promueven aún más la caracterización funcional de los factores de infección por nematodos entomopatógenos.

Introduction

La investigación sobre nematodos entomopatógenos (NPP) se ha intensificado en los últimos años debido principalmente a la utilidad de estos parásitos en las estrategias de manejo integrado de plagas y su participación en la investigación biomédica básica 1,2. Estudios recientes han establecido la EPN como organismos modelo en los que examinar los componentes genéticos de los nematodos que se activan durante las diferentes etapas del proceso de infección. Esta información proporciona pistas críticas sobre la naturaleza y el número de moléculas secretadas por los parásitos para alterar la fisiología del huésped y desestabilizar la respuesta inmune innata del insecto 3,4. Al mismo tiempo, este conocimiento se complementa comúnmente con nuevos detalles sobre el tipo de vías de señalización inmune del huésped insecto y las funciones que regulan para restringir la entrada y propagación de los patógenos 5,6. Comprender estos procesos es crucial para visualizar ambos lados de la interacción dinámica entre EPN y sus insectos huéspedes. Una mejor apreciación de la relación EPN-insecto huésped sin duda facilitará estudios similares con nematodos parásitos de mamíferos, lo que puede conducir a la identificación y caracterización de factores de infección que interfieren con el sistema inmunológico humano.

Los nematodos EPN Heterorhabditis sp. y Steinernema sp. pueden infectar a una amplia gama de insectos, y su biología ha sido intensamente estudiada anteriormente. Los dos parásitos nematodos difieren en su modo de reproducción, siendo Heterorhabditis autofertilizada y Steinernema sometida a reproducción amphíctica, aunque recientemente se demostró que S. hermaphroditum se reproduce por autofertilización de hermafroditas o a través de partenogénesis 7,8,9. Otra diferencia entre heterorhabditis y nematodos Steinernema es su mutualismo simbiótico con dos géneros distintos de bacterias Gram-negativas, Photorhabdus y Xenorhabdus, respectivamente, que son ambos potentes patógenos de insectos. Estas bacterias se encuentran en la etapa juvenil infecciosa (IJ) de vida libre y no alimenticia de la EPN, que detecta huéspedes susceptibles, obtiene acceso al hemocoel de insectos donde liberan sus bacterias asociadas que se replican rápidamente y colonizan los tejidos de los insectos. Tanto la EPN como sus bacterias producen factores de virulencia que desarman las defensas de los insectos y perjudican la homeostasis. Después de la muerte del insecto, los IJ nematodos se desarrollan para convertirse en EPN adultos y completar su ciclo de vida. Una nueva cohorte de IJ formada en respuesta a la privación de alimentos y el hacinamiento dentro del cadáver de insectos finalmente emerge en el suelo para cazar huéspedes adecuados 9,10,11,12.

Aquí, se describe un protocolo eficiente para mantener, amplificar y manipular genéticamente los nematodos EPN. En particular, el protocolo describe la replicación de los IJ simbióticos H. bacteriophora y S. carpocapsae , la generación de IJ de nematodos axénicos, la producción de hermafroditas de H. bacteriophora para microinyección, la preparación del dsRNA y la técnica de microinyección. Estos métodos son esenciales para comprender las bases moleculares de la patogenicidad de los nematodos y la inmunidad anti-nematodos del huésped.

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Protocol

1. Producción de juveniles infecciosos de nematodos simbióticos

  1. Cubra una placa de Petri (10 cm) con un trozo de papel de filtro y agregue aproximadamente 10-15 larvas de Galleria mellonella (Figura 1A).
  2. Usando una pipeta, dispense 2 ml de agua que contenga aproximadamente 25-50 IJ por suspensión de 10 μL sobre los gusanos de cera. Guarde la placa de Petri en un gabinete a temperatura ambiente.
  3. Dependiendo de la humedad del papel de filtro, agregue 1-2 ml de agua cada 2 días. Los gusanos de cera infectados con IJ normalmente morirán dentro de las 48 h.
  4. Prepare las trampas de agua de White aproximadamente 10 días después de que los gusanos de cera estén infectados con losIJ 8 (Figura 1B, C). Transfiera cuidadosamente los insectos muertos a la parte no empapada del papel de filtro. Use agua del grifo para llenar la placa de Petri inferior y coloque una tapa de un tubo de 15 ml como espaciador para la ventilación.
  5. Transfiera los gusanos de cera suaves y frágiles con cuidado levantándolos lentamente del papel de filtro con un par de pinzas de plástico. Use agua del grifo en lugar de agua desmineralizada o desionizada. Estos últimos causan la agregación de nematodos.
    1. Asegúrese de que el nivel de agua en la trampa de agua alcance aproximadamente la mitad de la altura de la placa de Petri. Espere que el nivel de agua cambie con el tiempo dependiendo de las condiciones de temperatura y humedad en la habitación.
  6. Cuando el agua en la pequeña placa de Petri se vuelve turbia debido a la presencia de nematodos, use una pipeta para mover la nueva generación de IJ a un matraz de cultivo celular T25 o T75.
  7. Agregue agua del grifo hasta aproximadamente el 40% del volumen hasta que se alcance la densidad adecuada (Figura 1C). Evite la congestión de nematodos y almacene los matraces de cultivo celular horizontalmente.
  8. Agregue más agua a la placa de Petri inferior y repita los pasos 1.6 y 1.7 hasta que los IJ dejen de emerger de los cadáveres de insectos en aproximadamente 3-5 días.

2. Producción de juveniles infecciosos de nematodos axénicos

NOTA: Los nematodos axénicos se utilizan porque después de que el complejo nematodo-bacteria se disocia dentro del insecto, cada socio mutualista provoca una respuesta inmune del huésped distinta5. La cepa mutante Ret16 de Photorhabdus temperata se utiliza porque estas bacterias apoyan el crecimiento de H. bacteriophora pero no logran colonizar el intestino del nematodo13,14.

  1. Heterorhabditis bacteriophora juveniles infecciosos
    1. Usando una punta de pipeta estéril o espátula, raspe varias escamas de un cultivo congelado de P. temperata Ret16 en una placa MacConkey y raye para colonias individuales. Incubar la placa durante 2-3 días a 28 °C.
    2. Inocular 10 ml de caldo LB con una colonia en un tubo de 50 ml e incubar el cultivo durante la noche a 28 °C en una incubadora de agitación. Use solo las colonias de fase primaria que son rojas en el agar MacConkey. Las colonias de fase secundaria serán blanquecinas en el agar MacConkey.
    3. Lavar 100 μL de cultivo nocturno con 900 μL de 1x PBS centrifugando en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 17.900 x g. Decantar el sobrenadante. Diluya el cultivo 10x en 1x PBS. Deje el tubo sobre hielo.
    4. Sumerja los gusanos de cera en una solución de etanol al 70%, seque los insectos con una toalla de papel y colóquelos en un tubo de 50 ml.
    5. Coloque el tubo sobre hielo durante 20 minutos para inmovilizar los gusanos de cera.
    6. Use un papel de filtro para cubrir las mitades superior e inferior de una placa de Petri (10 cm). Utilice la tapa de la placa de Petri cubierta con papel de filtro como soporte base para la inyección. Humedezca el papel de filtro de la placa de Petri inferior y transfiéralo sobre hielo para ayudar a los gusanos de cera inyectados a recuperarse.
    7. Pipetear 50 μL de bacterias heladas sobre un trozo de parafilm y preparar la jeringa de aguja de 22 G. Presione el émbolo suavemente para eliminar el aire en la punta de la aguja.
    8. Mantenga un gusano de cera cerca del extremo posterior debajo del estereoscopio (Figura 2).
    9. Inyecte 50 μL del cultivo bacteriano en el lado dorsal del tórax, preferiblemente en la unión entre dos segmentos. Para minimizar el daño interno, inyecte justo debajo de la cutícula, lo más paralelo posible al gusano de cera. Es natural que una gota de hemolinfa se desangre cuando se perfora el gusano de cera.
    10. Transfiera los insectos inyectados a la placa de Petri de recuperación.
    11. Repita los pasos 2.1.7-2.1.9 hasta que todos los insectos sean inyectados con la bacteria. Para anestesiar a los insectos, colóquelos en hielo durante 5 minutos.
    12. Coloque la placa de Petri en la oscuridad (por ejemplo, cajón o gabinete) y agregue agua del grifo al papel de filtro si parece seco. Los gusanos de cera sucumbirán 2 días después de la inyección y aparecerán de color rojo ladrillo después de aproximadamente 3-4 días. Si los insectos aparecen marrones, la infección bacteriana no ha tenido éxito.
    13. A los 7 días después de la infección, transfiera los insectos con el característico color rojo ladrillo a una placa de Petri forrada de papel de filtro fresco, y continúe con "Producción de juveniles infecciosos de nematodos simbióticos" del paso 1. Si usa nematodos simbióticos, repita el procedimiento del paso 2.1. utilizando los IJ recién producidos de la primera ronda.
    14. Esterilizantes de superficie H. bacteriophora IJs
      1. Recolectar suficiente H. bacteriophora simbiótica y IJ axénicos candidatos por centrifugación para hacer un pellet de 100 μL en un tubo centrífugo de 1,5 ml.
      2. Añadir 500 μL de lejía al 5% al pellet en cada tubo de microcentrífuga e invertir. Incubar durante 10 min. Centrifugadora a 17.900 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante.
      3. Lavar el pellet con 1 ml de agua estéril y repetir la centrifugación. Retire el sobrenadante. Repita este paso cuatro veces más.
    15. Verificación de la axenicidad
      1. Pipete 400 μL de agua estéril a los nematodos simbióticos lavados y candidatos-axénicos H. bacteriophora .
      2. Coloque los nematodos sobre los insectos en la placa de Petri y etiquete los tratamientos en consecuencia.
      3. Coloque las placas de Petri con los insectos infectados en la oscuridad y verifique periódicamente si los gusanos de cera se vuelven rojos.
        NOTA: Los gusanos de cera infectados con nematodos simbióticos H. bacteriophora se volverán rojos dentro de los 2 días posteriores a la infección. La decoloración del gusano de cera se debe a la secreción de varios compuestos producidos por la bacteria Photorhabdus mutualista durante el proceso de infección. La falta de color rojo en los gusanos de cera infectados 4 días después de la infección confirma que los H. bacteriophora son axénicos. Esto se debe a que las bacterias P. temperata Ret16 no están presentes en el intestino del nematodo.
    16. Método alternativo para verificar la axenicidad
      1. Esterilizar en superficie los IJ simbióticos H. bacteriophora y los IJ de H. bacteriophora simbióticos candidatos-axénicos como se describe en el paso 2.1.14.
      2. Homogeneizar aproximadamente 500 IJs en 500 μL de PBS estéril 1x en tubos de microfuge utilizando morteros estériles. Gire hacia abajo el homogeneizado, decante el sobrenadante y extiéndalo sobre el agar LB. Incubar las placas a 28 °C durante 24 h.
      3. Cuente las unidades formadoras de colonias (UFC) para cada placa. Las muestras de H. bacteriophora axénica no formarán ninguna colonia de la bacteria simbiótica P. luminescens .
  2. Steinernema carpocapsae Juveniles infecciosos
    1. Preparación de placas de agar lipídico (la solución de 300 ml hace aproximadamente 20 placas divididas)
      1. Pesar 2,4 g de caldo de nutrientes, 4,5 g de extracto de levadura y 1,5 g de agar y agregarlos a 267 ml de agua desionizada. Autoclave la solución.
      2. Agregue 3 ml de 1 M MgCl2, 1.2 ml de aceite de maíz y 28.8 ml de jarabe de maíz al 7%.
      3. Preparar y añadir a la solución 300 μL de 30 mg/ml de kanamicina y 300 μL de 50 mg/ml de ampicilina (esterilizada con filtro de 0,2 μm).
      4. Decantar la mezcla en la mitad de una placa de Petri dividida/placa partida.
    2. Preparación de césped bacteriano X. nematophila (cepa ΔrpoS)
      1. Cultivo X. nematophila (Xn) ΔrpoS directamente de una stockina bacteriana congelada 2 ml de solución LB/kan/amp en un agitador a 30 °C durante la noche.
      2. Inocular 5 ml de LB medio que contenga 30 μg/ml de kanamicina y 50 μg/ml de ampicilina con 250 μL del cultivo nocturno y cultivar la bacteria durante la noche en un agitador.
        NOTA: Las bacterias Xn no crecen bien cuando se rayan directamente en el medio de agar lipídico de selección de un stock congelado. Si es necesario, la fase primaria y secundaria de Xn se puede confirmar en primer lugar en medios NBTA (agar nutriente suplementado con 25 mg de azul de bromotimol l−1 y 40 mg de cloruro de trifeniltetrazolio l−1) antes de comenzar un cultivo líquido fresco.
      3. Pipete 100 μL del cultivo en las placas de agar lipídico y extiéndalo en toda la placa con un asa inoculante estéril. Incubar las placas durante 24 h a 30 °C.
    3. Esterilización superficial de S. carpocapsae IJs
      1. Deje un matraz que contenga IJ en un ángulo tal que los IJ se hundan en una esquina del matraz. Aspire 1 ml de los IJ asentados en un tubo de microcentrífuga. Centrífuga a 17.900 x g durante 10 s. Retire el sobrenadante.
      2. Agregue 1 ml de solución de lejía recién preparada al 1%. Invierta los tubos para mezclar bien. Incubar durante 1 minuto (la incubación prolongada de lejía conducirá a la muerte de IJ). Girar de nuevo durante 10 s. Quitar sobrenadante.
      3. Para eliminar los residuos de lejía, lave los nematodos con 1 ml de agua destilada estéril y centrífuga durante 10 s. Retire el sobrenadante. Repita el lavado cuatro veces más.
      4. Estimar el recuento de IJ por ml contando 10-20 μL de los IJ lavados bajo el estereoscopio y ajustar la concentración de los IJ en consecuencia.
    4. Cría de IJs de S. carpocapsae
      1. Transfiera con una pipeta alrededor de 1000 IJ a las placas divididas de agar lipídico (Figura 3, imagen izquierda). Coloque las placas en un gabinete o cajón humidificado. Use toallas de papel húmedas para aumentar la humedad. Mantenga las placas a temperatura ambiente (22-25 °C).
      2. Revise las toallas de papel cada dos días para asegurarse de que permanezcan húmedas. Si es necesario, agregue agua cada dos días a las toallas de papel para mantener la humedad en el gabinete o cajón. Alternativamente, coloque un baño de agua en la parte inferior del gabinete para aumentar la humedad.
      3. Cuando solo aparezcan IJ, agregue agua al otro lado de la placa y coloque una capa de papel de filtro en el centro de la placa (trampa de agua, Figura 3, imagen de la derecha). Recoge esta agua que contiene los primeros IJ redondos en un matraz de cultivo celular T75. Estos son los nematodos Round I S. carpocapsae .
      4. Esterilizar la superficie con lejía (paso 2.2.3) de nuevo y repetir el proceso del paso 2.2 utilizando los nematodos Round 1 S. carpocapsae . El resultado será la Ronda 2 S. carpocapsae nematodos.
      5. Verifique bajo un estereoscopio cada pocos días para rastrear el desarrollo de los nematodos.
    5. Verificación del estado axénico de los IJ de S. carpocapsae
      1. Esterilizar en superficie los IJ de S. carpocapsae Redondos 1, Redondo 2 y simbióticos con lejía como se describe en el paso 2.2.3.
      2. Homogeneizar aproximadamente 400-700 IJs en tubos de microfuge utilizando morteros de plástico estériles. Centrifugar el homogeneizado, decantar el sobrenadante y extender la solución sobre placas de agar LB. Mantenga las placas de agar en una incubadora a 28 °C durante 24 h.
      3. Cuente la formación de UFC para cada placa. Las muestras de nematodos axénicos no producirán ningún crecimiento bacteriano.
    6. Verificación del estado axénico de los IJ de S. carpocapsae mediante PCR
      1. Esterilizar en superficie los IJ de S. carpocapsae Redondos 1, Redondo 2 y simbióticos con lejía como se describe en el paso 2.2.3.
      2. Extraer ADN del homogeneizado. En la sección 4.1.2 se describe un procedimiento de extracción detallado.
      3. Realizar PCR utilizando los cebadores XptA2 con temperatura de recocido 61 °C:
        XptA F: 5′-GCCTGGAAAGAGTGGACGAA-3′.
        XptA R: 5′-GTAAGACCAAGGGGCACTCC-3′.
        NOTA: Estos cebadores amplifican el gen insecticida XptA2 de X. nematophila, produciendo un amplicon de tamaño de 231 pb. El programa de ciclismo fue el siguiente: 95 °C durante 2 min, 34 ciclos de 95 °C durante 30 s, temperatura de recocido de 61 °C durante 1 min y 73 °C durante 1 min seguido de 72 °C durante 10 min.
      4. Visualice los fragmentos amplificados por separación en un gel de agarosa al 1,5%. Las muestras axénicas esterilizadas por superficie no formarán ninguna banda.

3. Cría de hermafroditas de H. bacteriophora para microinyección

  1. Prepare placas de Petri de 6 cm con NA+chol (caldo de nutrientes 1.5x, agar al 1.5% y colesterol de 10 μg/ml).
  2. Preparar 3 ml de solución de PP3 (peptona de proteasa al 2% #3, PP3) en un tubo de cultivo de 10 ml.
  3. Utilice una punta estéril de 20 μL para raspar la parte superior del stock de glicerol de P. luminescens (25% vol/vol de glicerol estéril) mantenido a -80 °C y déjelo caer en el tubo de cultivo.
  4. Incubar el tubo durante la noche en un agitador de temperatura controlada a 28 °C, 200 rpm.
  5. Al día siguiente, el cultivo será de color rojo claro. Placa 50 μL del cultivo sobre una placa de Petri NA+chol de 6 cm y extiéndela utilizando un esparcidor bacteriano de forma circular.
  6. Coloque las placas en una incubadora de 28 °C. El césped de P. luminescens estará listo en 24-36 h y aparecerá de color rojo claro.
  7. Inocular la placa con 50-100 IJ esterilizados en superficie y mantener la placa a 28 °C.
  8. La hermafrodita L4 sana comenzará a aparecer aproximadamente 48-54 h después de la inoculación. Se requieren L4 H. bacteriophora hermaphrodites sanos, no hambrientos para la inyección.

4. Preparación de dsRNA

  1. Diseño de imprimación
    1. Diseñe cebadores para dsRNA para apuntar a ~ 500 regiones de exones de pares de bases de ADN de H. bacteriophora .
      1. Los cebadores para regiones de interés se pueden determinar utilizando Primer3 (https://primer3.ut.ee) o un programa similar, seleccionando una longitud óptima del producto de 500 pares de bases, Tm de 60 ° C y una longitud de imprimación de 22 nucleótidos.
      2. Agregue un sitio T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) a los extremos de 5′ de cada imprimación delantera para permitir la transcripción in vitro.
  2. Aislamiento de ADN genómico
    1. Utilice ADN genómico aislado de gránulos congelados de ~ 50,000 H. bacteriophora IJs para la síntesis de dsRNA.
    2. Utilice un pellet IJ resuspendido en 50 μL de tampón de lisis (50 mM KCl, gelatina al 0,05% (p/v), 10 mM Tris-HCl pH 8,2, Tween 20 al 0,45%, 60 μg/mL Proteinasa K, 2,5 mM MgCl2) colocado a -80 °C durante al menos 30 min.
    3. Homogeneizar el pellet con un pequeño mortero de tubo.
    4. Calentar la solución a temperatura ambiente e incubar a 60 °C durante 2 h, vórtice cada 15 min.
    5. Desnaturaliza la Proteinasa K incubando el tejido homogeneizado durante 15 min a 95 °C.
    6. Enfriar la muestra a 4 °C y centrifugar a 3.400 x g durante 1 min.
    7. Utilice el sobrenadante resultante como plantilla para la PCR posterior.
    8. Configure una reacción de PCR de 50 μL utilizando una mezcla maestra comercial con 200 ng de ADN de plantilla, 0,2 μM de imprimación hacia adelante y hacia atrás, y las condiciones de ciclo sugeridas por el fabricante.
    9. Analizar la reacción de PCR en un gel de agarosa al 1,2% para verificar que las reacciones produjeron bandas individuales del tamaño previsto.
  3. Síntesis de dsRNA
    1. Utilice un kit de transcripción comercial.
    2. Utilice una reacción de PCR de 5 μL para la transcripción in vitro. Siga las instrucciones del fabricante.
    3. Incubar la reacción durante 16 h a 37 °C.
    4. Limpie las reacciones de transcripción in vitro con un kit comercial utilizando precipitación de acetato de amonio/etanol para concentrar el dsRNA.
    5. Suspender el dsRNA peletizado en 10 μL de agua libre de RNasa.
    6. Cuantificar el ARN usando un espectrofotómetro.
    7. Evaluar la calidad separando el dsRNA en un gel de agarosa al 1,2%

5. Microinyección

NOTA: Una almohadilla de inyección es una funda de vidrio con una capa de agarosa al 2% (p/v) en el centro. Cuando los gusanos a inyectar se transfieren a estas almohadillas, la capa de agarosa los inmovilizará para el procedimiento. Normalmente, las almohadillas adicionales se mantienen cerca del microscopio para uso general.

  1. Preparación de la almohadilla de inyección
    1. Hervir 2% de agarosa en agua agregando 0.2 g de agarosa a 10 ml de agua.
    2. Coloque 1-4 gotas (~ 50 μL) en el centro de una cubierta de vidrio delgada de 50 mm x 70 mm.
    3. Use otro cubrecohetes para aplanar la gota.
    4. Deje que el coverslip se seque durante 2-3 min antes de deslizar el coverslip hacia los lados.
    5. Marque con una 'R' el lado derecho de la cubierta orientada hacia arriba.
    6. Deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante 1 día antes de usarlos.
  2. Preparación de agujas de inyección
    1. Utilice capilares de vidrio de 1,0 mm que contengan un filamento fino interno. Esto permite un llenado eficiente de la aguja.
      NOTA: Se puede utilizar cualquier extractor de aguja comercial (por ejemplo, Narishige PB-7).
    2. Encienda el extractor de agujas.
    3. Asegúrese de que el calentador esté ajustado al máximo y que el solenoide esté ajustado a 8.40 para garantizar la nitidez de la aguja requerida y la longitud adecuada.
    4. Inserte el tubo capilar en la cresta de la perilla superior a través del filamento y apriete la perilla superior. La parte superior del tubo capilar estará nivelada con la parte superior del extractor de agujas y el filamento de calentamiento estará en el medio del capilar.
    5. Mueva la unidad inferior a la parte superior y luego apriete la perilla inferior. Asegúrese de que el capilar esté colocado de forma segura.
    6. Cierre la tapa del extractor de agujas y pulse Start. La luz verde se encenderá. Después de unos minutos, el capilar se calentará y se separará para separarlo en dos mitades.
      NOTA: Las dos agujas separadas no son de la misma longitud, pero ambas se pueden usar para las inyecciones. Se prefieren puntos de aguja más largos.
    7. Coloque las agujas en posición vertical con sus puntos hacia abajo utilizando una pieza de arcilla de modelado. Alternativamente, guarde las agujas en una placa de Petri sostenida en su lugar por dos tiras de arcilla de modelado.
  3. Carga de la aguja
    NOTA: La solución de ácido nucleico debe centrifugarse durante al menos 10 min a 20.784 x g para granular las impurezas que puedan estar presentes en la suspensión. La centrifugación de las impurezas evita que bloqueen el flujo de la aguja de inyección.
    1. Use cualquiera de los dos métodos para cargar ácidos nucleicos en las agujas.
    2. Método 1
      1. Use una pipeta para transferir aproximadamente 0,5 μL de la muestra de ADN centrifugado al extremo no pulsado de la aguja de inyección. Esto aparecerá como una pequeña gota de líquido sentada en la parte superior del tubo capilar.
      2. Espere de 5 a 7 minutos para permitir que la muestra líquida ocupe el extremo de la aguja. El producto final será una aguja llena sin burbujas de aire presentes.
      3. Use un microscopio de disección para confirmar la presencia de solución en la punta de la aguja antes de la inyección.
    3. Método 2
      1. Use puntas de carga para el microinyector.
      2. Usando esta punta de carga, pipetee 5 μL de la solución de ácido nucleico.
      3. Mientras la aguja tirada está en el extractor de la aguja, afloje la perilla superior, mueva la aguja tirada superior ligeramente hacia arriba y vuelva a apretar la perilla.
      4. Inserte cuidadosamente la punta del cargador en el tubo capilar y extiéndala hasta la parte inferior de la aguja de inyección.
      5. Pipetear la solución de ácido nucleico en la aguja de inyección.
      6. Retire el cargador de la aguja tirada y manténgalo separado para una carga adicional, si es necesario. Asegúrese de cambiar los cargadores cuando cargue una mezcla de ácido nucleico diferente.
  4. Preparación del microscopio de inyección
    NOTA: Se utiliza un microscopio invertido con iluminación difusa desde la base del microscopio para la preparación, microinyección y recuperación de gusanos. Se describe el uso de un microscopio invertido de alta resolución con objetivos de 10x y 40x. El microscopio está equipado con un manipulador de agujas que sostiene la aguja y la coloca en posición para la inyección. El aceite de microinyección se usa para evitar que el gusano se deshidrate rápidamente mientras está en la capa de agarosa de la almohadilla de inyección. El aceite sugerido para usar es Halocarbon Oil 700.
    1. Encienda la lámpara y calibre el brillo con el panel de control.
    2. Compruebe el número en el prisma Wollaston del condensador; corresponderá al objetivo utilizado (40x).
    3. Confirme que la torreta DIC, marcada por "DIC", está en la posición correcta.
    4. Asegúrese de que la perilla del objetivo esté establecida en cero (0).
    5. Gire el anillo Ph hacia la derecha hasta el final.
    6. Ajuste el polarizador de manera que la flecha esté en posición horizontal.
    7. Coloque un pedazo de papel en el escenario para observar el punto focal (luz).
    8. Cierre el diafragma de campo hasta el punto de que haya una mancha en el papel.
    9. Use el dial de la izquierda para mover el condensador hacia arriba y hacia abajo hasta el punto de que se vea un punto de luz muy nítido en el pedazo de papel.
    10. Abra el diafragma de campo lentamente hasta el punto en que un pequeño círculo de luz sea visible.
    11. Quita el pedazo de papel.
    12. Asegúrese de que el punto de luz esté en el centro del objetivo. De lo contrario, alinee el punto de luz con el centro del objetivo ajustando los tornillos plateados en la parte superior del condensador.
    13. Abra completamente el diafragma de campo.
    14. Compruebe que el analizador ICT/P está presionado.
  5. Montaje de la aguja de inyección en el microscopio
    1. Encienda el flujo de gas nitrógeno a la aguja de microinyección. La presión del gas a la aguja será de aproximadamente 20 psi.
    2. Verifique que las perillas del micromanipulador (la parte del microscopio que mueve la aguja) estén colocadas en el centro, lo que permite el rango de movimiento más amplio cuando se monta la aguja.
    3. Desenrosque el conjunto que sujeta la varilla metálica para retirarla del soporte de la aguja.
    4. Inserte la nueva aguja en la parte superior del microscopio; luego instale la junta de goma para mantener la aguja en su posición.
    5. Asegure la parte inferior del soporte de la aguja ajustándola al conjunto.
    6. Coloque la aguja en la ranura del micromanipulador y atorníllela correctamente para mantenerla estable. Asegúrese de que el tornillo esté aproximadamente a 1 pulgada del extremo del micromanipulador.
    7. Coloque la punta de la aguja en el centro del campo visual en un ángulo de aproximadamente 45 ° en relación con la placa del escenario, utilizando las perillas y los controles gruesos del micromanipulador. Es fundamental dejar la punta de la aguja lo suficientemente alta para que no se rompa por accidente.
  6. Romper las agujas
    1. Coloque la aguja en el micromanipulador donde la punta de la aguja normalmente se romperá para permitir que la solución de ácido nucleico fluya a través de ella.
    2. Rompe un capilar y colócalo encima de un portaobjetos de vidrio que lleve una gota de aceite de microinyección.
    3. Coloque el portaobjetos en el microscopio y enfoque.
    4. Lleve la punta de la aguja al mismo nivel que el lado del capilar utilizando los controles finos del microscopio (Figura 4).
    5. Encienda el flujo de nitrógeno brevemente usando el actuador del pie para confirmar que la punta de la aguja no está rota. Un rápido encendido y apagado será suficiente.
    6. Mueva la aguja suavemente para que apenas toque el lado del capilar.
    7. Golpee ligeramente el costado del microscopio para romper la punta de la aguja.
    8. Retire la aguja del capilar y encienda el flujo de nitrógeno para verificar que la aguja esté rota correctamente.
    9. La aguja creará una pequeña gota de inyección aproximadamente cinco veces mayor que la punta de la aguja (Figura 4). Si la gota de inyección es de menor tamaño, rompa la punta aún más. Si la gota de inyección es de mayor tamaño, trate de usar una aguja fresca.

6. Microinyección

  1. Pipetear una gota de aceite de microinyección en una almohadilla de inyección.
  2. Sumerja una púa esterilizada por llama en la gota de aceite de microinyección y recoja una H joven. bacteriophora nematodo adulto de la placa.
  3. Recoger los nematodos de las partes de la placa que no están cerca del césped bacteriano para evitar la transferencia de un gran número de células bacterianas a la almohadilla de inyección. Además, cosecha un nematodo con gónadas bien formadas.
  4. Mueva los nematodos a la almohadilla de inyección y colóquelos verticalmente para que las gónadas miren hacia la aguja. Asegúrese de que la vulva apunte en la misma dirección que la aguja de inyección, y que los dos brazos de la gónada distal estén en la dirección opuesta y contra la pared del cuerpo del nematodo.
    NOTA: Al igual que Pristionchus pacificus, la gónada de H. bacteriophora migra dorsalmente desde la posición vulvar ventral y luego migra de nuevo a la posición ventral.
  5. Compruebe que la cantidad de aceite es suficiente para evitar la desecación de nematodos sin permitir que el nematodo deambule.
  6. Enfoca el nematodo con el objetivo 10x sosteniendo la aguja muy por encima de la diapositiva. En el aceite, las gónadas de nematodos se ven como dos regiones claras cerca de la parte anterior y posterior del gusano. Asegúrese de que las gónadas estén enfocadas y no las otras partes del gusano.
  7. Coloque el nematodo en un ángulo de 15 ° a 45 ° hacia la aguja de inyección, lo que le dará más espacio a la aguja dentro de la gónada. Además, este enfoque evita que la aguja pase a través de todo el cuerpo del nematodo cuando la aguja se introduce dentro de la gónada.
  8. Coloque la aguja de inyección y el nematodo al mismo nivel bajando gradualmente la aguja hasta que se enfoque (Figura 5). Asegúrese de que a medida que se baja la aguja, permanece al lado del nematodo y no por encima del gusano.
  9. Utilice el objetivo 40x para centrarse en el brazo de la gónada sincitial del nematodo.
  10. Mueva la aguja hacia arriba y hacia abajo con el ajustador fino hasta que la punta esté enfocada junto con el brazo de la gónada sincitial del nematodo.
  11. Mueva el nematodo lentamente hacia la aguja usando la etapa deslizante. Luego empuje suavemente la gónada a la posición con la aguja contra la pared del cuerpo del nematodo, lo que dará como resultado una penetración eficiente de la aguja dentro del cuerpo del nematodo.
  12. Pise brevemente el actuador del pie para iniciar el flujo de la solución de ácido nucleico. Un encendido y apagado rápido es suficiente. Si la aguja está dentro de la gónada, la gónada se llenará con la solución y se hinchará.
  13. Una vez que la aguja esté asegurada en la posición correcta, llene la gónada con la solución de ácido nucleico hasta que se llenen los brazos de la gónada. Es importante evitar la expulsión de líquido del gusano a través del orificio donde la aguja lo perforó.
  14. Usando la etapa deslizante, mueva cuidadosamente el gusano lejos de la aguja.
  15. Levante la aguja y gírela en sentido contrario a las agujas del reloj.
  16. Coloque una gota de 1x búfer PBS en la parte superior del gusano para que flote.
  17. Use la púa esterilizada por llama para levantar el gusano y colóquelo en otra gota de M9 en una placa fresca con semillas de P. luminescens para eliminar el exceso de aceite del gusano.
  18. Retire el nematodo del M9 y colóquelo en el otro lado del césped bacteriano.
  19. Use la misma placa para transferir varios nematodos inyectados.
  20. En 2-3 días, evalúe los nematodos de primera generación (F1) para el fenotipo transgénico. Separe los nematodos transgénicos F1 en placas individuales para determinar qué gusanos generarán líneas transgénicas estables.

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Representative Results

Para evaluar el estado de los nematodos de H. bacteriophora que han pasado por la axenización, se determinó la presencia o ausencia de colonias bacterianas de P. luminescens en IJs. Para ello, se recogió un pellet de aproximadamente 500 IJ que habían sido previamente esterilizados en superficie y homogeneizados en PBS. El tratamiento de control positivo consistió en un pellet de aproximadamente 500 IJ del cultivo de nematodos que contenía bacterias simbióticas P. luminescens . Los gránulos de nematodos axenizados y de control positivo se homogeneizaron en 1x PBS. Los homogeneizados se pipetearon en agar y se extendieron para facilitar el crecimiento de colonias individuales. Las placas de agar se incubaron a 28 °C durante 24 h. Al día siguiente, se observó la aparición de colonias de P. luminescens (UFC). Como era de esperar, H. bacteriophora del cultivo de stock portaba células simbióticas de P. luminsecens ; sin embargo, los nematodos desprovistos de su bacteria P. luminecens asociada fueron axénicos y almacenados por separado para futuras experimentaciones (Figura 6).

El derribo de la expresión del gen nol-5 se utilizó como ejemplo para mostrar la eficacia del ARNi utilizando el proceso de microinyección. La microinyección se realizó en la generación parental y el efecto se observó en la progenie F1. La eliminación de nol-5 mediante microinyección de ARNi resultó en la ausencia de línea germinal en la gónada del 60% de la progenie (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: Generación de juveniles infecciosos (etapa de vida libre de nematodos entomopatógenos). (a) Infección de larvas de insectos Galleria mellonella (mantenidas en placa de Petri) con juveniles infecciosos de nematodos (mantenidos en matraz de cultivo tisular). b) Plegado de un trozo de papel de filtro para la preparación de una trampa de agua. c) La disposición de una trampa de agua de nematodos entomopatógenos con larvas muertas de insectos Galleria mellonella que contienen juveniles infecciosos (12 días después de la infección por nematodos). La nueva generación de juveniles infecciosos dejará los insectos muertos y se moverá al agua, que luego se almacena en un matraz de cultivo de tejidos. Las imágenes se realizan utilizando el software gráfico BioRender (https://biorender.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Inyección de larvas de insecto Galleria mellonella con la cepa de bacteria Photorhabdus temperata Ret16. Los gusanos de cera se mantienen en una placa de Petri y se inmovilizan mediante tratamiento en frío (es decir, se colocan en hielo durante unos minutos). La parte posterior del cuerpo del insecto se presiona con un par de fórceps para crear una superficie hinchada que es adecuada para la inyección. El ángulo de inyección es poco profundo para evitar lesiones en los tejidos internos de los insectos, lo que conduciría a la muerte de los insectos debido a un manejo descuidado. Las imágenes se realizan utilizando el software gráfico BioRender (https://biorender.com). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Generación de nematodos axénicos de Steinernema carpocapsae entomopatógenos. La mitad de una placa de Petri dividida contiene un césped de la bacteria Xenorhabdus nematophila ΔrpoS en agar lipídico y juveniles infecciosos de nematodos S. carpocapsae . Este método in vitro induce a los juveniles infecciosos a convertirse en nematodos adultos, que más tarde producirán huevos que eclosionarán para dar lugar a la nueva generación de los parásitos. Cuando aparece un gran número de juveniles infecciosos de S. carpocapsae recién generados en esta parte de la placa de Petri dividida, se agrega agua a la otra mitad del plato junto con un trozo de papel de filtro para facilitar la migración de los nematodos. Las imágenes se realizan utilizando el software gráfico BioRender (https://biorender.com) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Romper la punta de la aguja. La punta de la aguja generalmente está cerrada. Se comprueba el flujo adecuado de la solución de ácido nucleico antes de realizar la inyección real. En un portaobjetos de vidrio, coloque una gota de aceite de halocarbono. Coloque un tubo capilar, utilizado para hacer la aguja, verticalmente como se muestra en la figura. Lleve el capilar para enfocar a 40x y baje suavemente la aguja en plano con el capilar. Toque suavemente la punta de la aguja en el capilar. Esto crea una abertura para el flujo suave del dsRNA. Si no sale líquido, realice un flujo rápido de nitrógeno de encendido y apagado con el actuador del pie. La presión del nitrógeno y el contacto de la punta de la aguja con el capilar romperán la aguja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Sitio de inyección. La gónada de H. bacteriophora migra dorsalmente desde la posición vulvar ventral y luego migra de nuevo a la posición ventral. Los brazos migratorios se cruzan entre sí cerca de la vulva y se extienden más allá de la vulva a ambos lados. Alrededor de las 48 h, los brazos extendidos de la gónada de un adulto joven, cultivado a partir de IJ, son visibles cerca de la vulva. La microinyección se realiza en esta posición. Barra de escala: 0.1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Validación de la axenización de Heterorhabditis bacteriophora . El éxito del procedimiento de axenización se estimó confirmando la ausencia de células bacterianas de Photorhabdus luminescens en juveniles infecciosos de H. bacteriophora tratados. Para ello, se homogeneizó un pellet de aproximadamente 500 gusanos esterilizados superficialmente del cultivo de stock (simbióticos) o gusanos que habían sido sometidos al proceso de axenización (axénico). Luego, el homogeneizado se extendió sobre placas de agar y después de una incubación de 24 h, se monitoreó la aparición de colonias bacterianas (unidades formadoras de colonias, UFC). La falta de colonias bacterianas en las placas sugiere que los nematodos H. bacteriophora están libres de sus bacterias simbióticas P. luminescens . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Derribo mediado por ARNi del gen nol-5. El derribo mediado por ARNi del gen H. bacteriophora nol-5 da como resultado un fenotipo sin línea germinal. La progenie de tipo salvaje, el nematodo H. bacteriophora (a) no inyectado contiene huevos en sus gónadas. La progenie de un tipo salvaje, el nematodo H. bacteriophora inyectado por ARNi nol-5 (b) no contiene huevos en sus gónadas vacías debido a la eliminación del ARN nol-5. Barra de escala: 0.1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Comprender las bases moleculares de la infección por nematodos entomopatógenos y la inmunidad antineomatodos de insectos requiere la separación de los parásitos de las bacterias mutuamente asociadas 13,15,16. Los nematodos entomopatógenos H. bacteriophora y S. carpocapsae conviven con las bacterias Gram-negativas P. luminescens y X. nematophila, respectivamente17. Se ha demostrado previamente que ambas especies bacterianas codifican factores que confieren patogenicidad al dirigirse a los tejidos de los insectos y contrarrestar el sistema inmune innato durante la infección18,19. Esto dificulta los esfuerzos para identificar las estrategias que los nematodos han desarrollado para interactuar con el insecto huésped. Por lo tanto, la identificación y caracterización funcional a través de la eliminación de genes de los componentes nematodos que también participan en el proceso de infección puede facilitarse mediante la generación de gusanos axénicos. Aquí, se presentan protocolos eficientes para producir nematodos entomopatógenos axénicos y realizar silenciamiento génico de ARNi en H. bacteriophora.

Un paso crítico en ambos protocolos para generar con éxito nematodos axénicos es la esterilización superficial de H. bacteriophora y S. carpocapsae IJs14,20. Esta parte del método implica el tratamiento de los gusanos con solución de lejía y se considera crucial para el éxito del proceso de axenización porque elimina las bacterias P. luminescens y X. nematophila de la cutícula de nematodos. Este es un procedimiento importante para garantizar que solo se eliminen las bacterias mutualistas en la superficie de los gusanos y no las que están dentro de los parásitos. La finalización de este paso requiere atención porque el tratamiento prolongado con lejía afectará la supervivencia de los nematodos.

Una similitud del actual protocolo de axenización para nematodos S. carpocapsae con un método previamente establecido es el uso de la bacteria mutante X. nematophila ΔrpoS que no son capaces de colonizar los gusanos21. Una diferencia entre la metodología actual y un protocolo previamente informado, que introdujo huevos de nematodos esterilizados en superficie en el agar nutriente22, es la adición de antibióticos en los medios de cultivo para inhibir la contaminación microbiana que probablemente afectaría el crecimiento y la aptitud de los nematodos.

El ARNi por microinyección es un método fácil y confiable de administrar el ARN a los ovocitos. La explosión de líquido dentro de la gónada proporciona una confirmación visual de la liberación de la solución de ácido nucleico durante el proceso de inyección. Se demostró que el ARNi por microinyección es significativamente mejor que el ARNi por remojo. Esto se debe probablemente a la capacidad de la solución de ARNi para llegar a ovocitos que se encuentran en diferentes etapas de diferenciación dentro de la gónada.

Al optimizar el proceso, se recomienda probar diferentes concentraciones de solución de ARN para obtener mejores resultados. Se probaron varias concentraciones de ARN que oscilaban entre 50 ng/μL y 10 μg/μL. Se encontró que una concentración de 6 μg/μL funcionó mejor que otras concentraciones. Para aumentar el rendimiento de ARN durante la etapa de transcripción in vitro , el protocolo se modificó de un período de incubación de 4 horas a 16 horas. Esto resultó en un aumento sustancial en el rendimiento final de ARN. Uno de los factores clave para una microinyección exitosa es la cantidad de tiempo que un nematodo pasa en la almohadilla de inyección. Menos tiempo resulta en un nematodo sobreviviente sano y una progenie sana con una mayor probabilidad de observar el fenotipo previsto.

El protocolo actual para el cultivo y la manipulación genética de nematodos entomopatógenos es una contribución significativa para futuros estudios en los campos de la nematología, la inmunología y las interacciones huésped-parásito. La combinación de enfoques que permitan la manipulación de nematodos entomopatógenos conducirá al descubrimiento de los factores genéticos que definen la interacción entre las moléculas efectoras de nematodos y los componentes de señalización inmune del huésped que codifican factores con propiedades anti-nematodos. Además, determinará qué componentes moleculares clave de los nematodos determinan la relación simbiótica con las bacterias relacionadas. Responder a estas preguntas es importante para mejorar las prácticas agrícolas y desarrollar nuevos medios para el control de los nematodos parásitos humanos.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Agradecemos a los miembros del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington por la lectura crítica del manuscrito. Todas las figuras gráficas se hicieron utilizando BioRender. Investigación en el I. E., J. H. y D. O'H. los laboratorios han sido apoyados por la Universidad George Washington y el Colegio Colombino de Artes y Ciencias facilitando fondos y Fondos de Investigación Interdisciplinaria.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

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References

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