Plazmid DNA’sının iskelet kasına elektroporasyonu, farelerde kas kontraktilitesinden ödün vermeden gen ekspresyonunu modüle etmek için uygun bir yöntemdir.
Plazmid elektroporasyonu ile murin iskelet kasında geçici gen ekspresyon modülasyonu normal ve patolojik fizyolojinin değerlendirilmesinde yararlı bir araçtır. Hedef genlerin aşırı ekspresyonu veya yıkılması, araştırmacıların bireysel moleküler olayları manipüle etmelerini ve böylece kas kütlesini, kas metabolizmasını ve kontraktiliteyi etkileyen mekanizmaları daha iyi anlamalarını sağlar. Ek olarak, floresan etiketlerini kodlayan DNA plazmidlerinin elektroporasyonu, araştırmacıların iskelet kasındaki proteinlerin hücre altı lokalizasyonundaki değişiklikleri in vivo olarak ölçmelerini sağlar. İskelet kasının anahtar fonksiyonel değerlendirmesi, kas kontraktilitesinin ölçülmesini içerir. Bu protokolde, plazmid DNA enjeksiyonu, elektroporasyon ve gen ekspresyon modülasyonundan sonra tüm kas kontraktilitesi çalışmalarının hala mümkün olduğunu gösteriyoruz. Bu eğitici prosedürün amacı, tibialis anterior ve ekstansör digitorum longus kaslarının miyoliflerinde alım ve ekspresyonu kolaylaştırmak için fare iskelet kasına DNA plazmid elektroporasyonunun adım adım yöntemini göstermek ve iskelet kası kontraktilitesinin enjeksiyon ve elektroporasyon ile tehlikeye atılmadığını göstermektir.
İskelet kası içine plazmid DNA elektroporasyonu in vivo olarak iskelet kası fizyolojisindeki değişiklikleri ve moleküler sinyallemeyi değerlendirmek için çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda gen ekspresyonunu modüle ederek önemli bir araçtır 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . İskelet kasına deneysel gen transferi, Wolff ve ark. tarafından 1990 gibi erken bir tarihte gösterilmiştir; burada hem RNA hem de DNA elektroporasyon olmadan başarılı bir şekilde aktarılmış ve lusiferaz ekspresyonu en az 2 ay boyunca korunmuştur10. Sadece enjeksiyonla nispeten düşük transfeksiyon etkinliği sorunludur ve Aihara ve Miyazaki, 1998 yılında bir pCAGGS-IL-5 yapısını tibialis anterior (TA) kasına elektroporasyon yaparak ve serum IL-5 ekspresyonu11’i ölçerek elektroporasyon ile artan gen transferini göstermiştir. O zamandan beri, birçok çalışma, maksimum gen transfer verimliliğini sağlamak için farklı DNA konsantrasyonlarının, hacimlerinin ve elektroporasyon parametrelerinin etkinliğini araştırmıştır. Mir ve ark. voltaj, darbe sayısı, nabız süresi ve frekansın yanı sıra DNA konsantrasyonu da dahil olmak üzere farklı elektroporasyon parametrelerini test ettiler ve daha fazla voltaj, darbe sayısı ve DNA konsantrasyonunun hepsinin elektroporasyon verimliliğinin artmasına katkıda bulunduğunu belirlediler12. Yüksek elektroporasyon voltajına yapılan önemli bir uyarı, miyoliflere artan DNA alımını kolaylaştırırken, aynı zamanda sonuçları karıştırabilecek kas hasarına neden olmasıdır. Schertzer ve ark., 200 V’ta elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra miyoliflerin yaklaşık% 50’sinde hasara neden olduğunu, oysa miyoliflerin sadece% 10’unun 50 V13’te hasar gördüğünü göstermiştir. Etkili DNA transferini etkileyen değişkenleri kas hasarına karşı dikkate aldık ve etkili gen transferini gerçekleştirmek için santimetre kaliper genişliğinde 125 V’luk bir voltajın yeterli olduğunu bulduk.
Elektroporasyon sonrası kas lifi kesit alanının ve tüm kas kontraktilitesinin analizi, gen modülasyonuna bağlı kas büyüklüğü ve fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme yönteminin önemli yönleridir. Biz ve diğerleri daha önce kontrol vektörlerinin elektroporasyonunun tek başına miyofiber alanda bir azalmaya neden olmadığını göstermiştir. Yeşil floresan protein (EGFP) yapısı, bu çalışmalarda DNA transfeksiyonunun yararlı bir floresan göstergesiydi13,14. Bir dizi çalışma, elektroporasyon sonrası TA’nın in situ kontraktilitesini araştırmış ve değişen sonuçlar bulmuştur. Bir çalışma, 75 V / cm elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra tetanik kuvvette yaklaşık% 30’luk bir azalmaya neden olduğunu ve elektroporasyondan 7 gün sonra, tetanik kuvvetin kontrol seviyesine geri döndüğünü, 50 V / cm elektroporasyonun ise kuvvet 13,15’ten ödün vermediğini göstermiştir. Başka bir çalışma, 180 V / cm elektroporasyondan 3 saat sonra% 30’luk bir tetanik kuvvet kaybı olduğunu ve 7 gün16’dan sonra sahte kuvvet seviyelerine geri döndüğünü göstermiştir.
Aşağıdaki ayrıntılı prosedürde, farelerin TA ve ekstansör digitorum longus (EDL) kaslarında bir pcDNA3-EGFP plazmidinin enjeksiyonunu ve elektroporasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca bu yöntemin EDL tüm kas kontraktilitesini etkilemediğini de gösteriyoruz. Amaç, fonksiyon kaybına neden olmadan miyoliflere etkili plazmid alımını göstermektir.
Elektroporasyon ile güçlendirilmiş iskelet kasında in vivo gen transferi, kastaki protein ekspresyonunu modüle etmek için yararlı ve nispeten basit bir araçtır. EDL ve TA kaslarında etkili gen transferi sağlamak için gereken adımları gösterdik ve EDL’nin kontraktilite ölçümünün prosedürü takiben uygulanabilir olduğunu gösterdik. Bu teknik daha karmaşık viral vektörler gerektirmez ve tek bir kasta transfekte ve transfekte olmayan kas lifi kesit alanının karşılaştırılmasına izin …
The authors have nothing to disclose.
Hiç kimse
4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |