Summary

Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

Published: April 06, 2022
doi:

Summary

Plazmid DNA’sının iskelet kasına elektroporasyonu, farelerde kas kontraktilitesinden ödün vermeden gen ekspresyonunu modüle etmek için uygun bir yöntemdir.

Abstract

Plazmid elektroporasyonu ile murin iskelet kasında geçici gen ekspresyon modülasyonu normal ve patolojik fizyolojinin değerlendirilmesinde yararlı bir araçtır. Hedef genlerin aşırı ekspresyonu veya yıkılması, araştırmacıların bireysel moleküler olayları manipüle etmelerini ve böylece kas kütlesini, kas metabolizmasını ve kontraktiliteyi etkileyen mekanizmaları daha iyi anlamalarını sağlar. Ek olarak, floresan etiketlerini kodlayan DNA plazmidlerinin elektroporasyonu, araştırmacıların iskelet kasındaki proteinlerin hücre altı lokalizasyonundaki değişiklikleri in vivo olarak ölçmelerini sağlar. İskelet kasının anahtar fonksiyonel değerlendirmesi, kas kontraktilitesinin ölçülmesini içerir. Bu protokolde, plazmid DNA enjeksiyonu, elektroporasyon ve gen ekspresyon modülasyonundan sonra tüm kas kontraktilitesi çalışmalarının hala mümkün olduğunu gösteriyoruz. Bu eğitici prosedürün amacı, tibialis anterior ve ekstansör digitorum longus kaslarının miyoliflerinde alım ve ekspresyonu kolaylaştırmak için fare iskelet kasına DNA plazmid elektroporasyonunun adım adım yöntemini göstermek ve iskelet kası kontraktilitesinin enjeksiyon ve elektroporasyon ile tehlikeye atılmadığını göstermektir.

Introduction

İskelet kası içine plazmid DNA elektroporasyonu in vivo olarak iskelet kası fizyolojisindeki değişiklikleri ve moleküler sinyallemeyi değerlendirmek için çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda gen ekspresyonunu modüle ederek önemli bir araçtır 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . İskelet kasına deneysel gen transferi, Wolff ve ark. tarafından 1990 gibi erken bir tarihte gösterilmiştir; burada hem RNA hem de DNA elektroporasyon olmadan başarılı bir şekilde aktarılmış ve lusiferaz ekspresyonu en az 2 ay boyunca korunmuştur10. Sadece enjeksiyonla nispeten düşük transfeksiyon etkinliği sorunludur ve Aihara ve Miyazaki, 1998 yılında bir pCAGGS-IL-5 yapısını tibialis anterior (TA) kasına elektroporasyon yaparak ve serum IL-5 ekspresyonu11’i ölçerek elektroporasyon ile artan gen transferini göstermiştir. O zamandan beri, birçok çalışma, maksimum gen transfer verimliliğini sağlamak için farklı DNA konsantrasyonlarının, hacimlerinin ve elektroporasyon parametrelerinin etkinliğini araştırmıştır. Mir ve ark. voltaj, darbe sayısı, nabız süresi ve frekansın yanı sıra DNA konsantrasyonu da dahil olmak üzere farklı elektroporasyon parametrelerini test ettiler ve daha fazla voltaj, darbe sayısı ve DNA konsantrasyonunun hepsinin elektroporasyon verimliliğinin artmasına katkıda bulunduğunu belirlediler12. Yüksek elektroporasyon voltajına yapılan önemli bir uyarı, miyoliflere artan DNA alımını kolaylaştırırken, aynı zamanda sonuçları karıştırabilecek kas hasarına neden olmasıdır. Schertzer ve ark., 200 V’ta elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra miyoliflerin yaklaşık% 50’sinde hasara neden olduğunu, oysa miyoliflerin sadece% 10’unun 50 V13’te hasar gördüğünü göstermiştir. Etkili DNA transferini etkileyen değişkenleri kas hasarına karşı dikkate aldık ve etkili gen transferini gerçekleştirmek için santimetre kaliper genişliğinde 125 V’luk bir voltajın yeterli olduğunu bulduk.

Elektroporasyon sonrası kas lifi kesit alanının ve tüm kas kontraktilitesinin analizi, gen modülasyonuna bağlı kas büyüklüğü ve fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme yönteminin önemli yönleridir. Biz ve diğerleri daha önce kontrol vektörlerinin elektroporasyonunun tek başına miyofiber alanda bir azalmaya neden olmadığını göstermiştir. Yeşil floresan protein (EGFP) yapısı, bu çalışmalarda DNA transfeksiyonunun yararlı bir floresan göstergesiydi13,14. Bir dizi çalışma, elektroporasyon sonrası TA’nın in situ kontraktilitesini araştırmış ve değişen sonuçlar bulmuştur. Bir çalışma, 75 V / cm elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra tetanik kuvvette yaklaşık% 30’luk bir azalmaya neden olduğunu ve elektroporasyondan 7 gün sonra, tetanik kuvvetin kontrol seviyesine geri döndüğünü, 50 V / cm elektroporasyonun ise kuvvet 13,15’ten ödün vermediğini göstermiştir. Başka bir çalışma, 180 V / cm elektroporasyondan 3 saat sonra% 30’luk bir tetanik kuvvet kaybı olduğunu ve 7 gün16’dan sonra sahte kuvvet seviyelerine geri döndüğünü göstermiştir.

Aşağıdaki ayrıntılı prosedürde, farelerin TA ve ekstansör digitorum longus (EDL) kaslarında bir pcDNA3-EGFP plazmidinin enjeksiyonunu ve elektroporasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca bu yöntemin EDL tüm kas kontraktilitesini etkilemediğini de gösteriyoruz. Amaç, fonksiyon kaybına neden olmadan miyoliflere etkili plazmid alımını göstermektir.

Protocol

Hayvanları kullanan tüm deneyler, Penn State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan Penn State College of Medicine’de gerçekleştirildi ve 1964 Helsinki Deklarasyonu’nda ve daha sonraki değişikliklerinde belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirildi. Bu işlem için 12 haftalık dişi C57BL/6 fareler kullanıldı. Tüm cerrahi aletler deneyden önce sterilite için otoklavlandı. 1. TA ve EDL enjeksiyon / elektroporasyon h…

Representative Results

İskelet kasında gen transferini kolaylaştırmak için elektroporasyon, kas fizyolojisindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan yararlı bir tekniktir. Hem TA hem de EDL kaslarında verimli gen transferini gerçekleştirmek için ayrıntılı, adım adım bir prosedür gösterdik. Transfeksiyon verimliliğindeki farklılıklar bir dizi değişken nedeniyle ortaya çıkar. Bu değişkenler arasında elektroporasyon parametreleri (darbeler, voltaj, nabız süresi vb.), Gen yapı boyutu ve enjekte edilen D…

Discussion

Elektroporasyon ile güçlendirilmiş iskelet kasında in vivo gen transferi, kastaki protein ekspresyonunu modüle etmek için yararlı ve nispeten basit bir araçtır. EDL ve TA kaslarında etkili gen transferi sağlamak için gereken adımları gösterdik ve EDL’nin kontraktilite ölçümünün prosedürü takiben uygulanabilir olduğunu gösterdik. Bu teknik daha karmaşık viral vektörler gerektirmez ve tek bir kasta transfekte ve transfekte olmayan kas lifi kesit alanının karşılaştırılmasına izin …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hiç kimse

Materials

4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

References

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Play Video

Cite This Article
Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

View Video