Summary

Eksperimentell modell for å evaluere oppløsning av lungebetennelse

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Dette manuskriptet beskriver etableringen av en smittsom modell av lungebetennelse hos mus og den respektive karakteriseringen av skadeoppløsning sammen med metoder for dyrking av bakterier og intratrakeal instillasjon. En ny tilnærming som bruker høydimensjonal flowcytometri for å evaluere immunlandskapet er også beskrevet.

Abstract

Akutt respiratorisk distress syndrom (ARDS) forårsaker akutt lungeskade, preget av rask alveolær skade og alvorlig hypoksemi. Dette fører igjen til høy sykelighet og dødelighet. Foreløpig er det ingen prekliniske modeller som rekapitulerer kompleksiteten til human ARDS. Imidlertid kan infeksiøse modeller av lungebetennelse (PNA) replikere de viktigste patofysiologiske egenskapene til ARDS. Her beskriver vi en modell av PNA indusert av intratrakeal instillasjon av levende Streptococcus pneumoniae og Klebsiella pneumoniae i C57BL6-mus. For å evaluere og karakterisere modellen, etter å ha indusert skade, utførte vi seriemålinger av kroppsvekt og bronkoalveolær skylling (BAL) for å måle markører for lungeskade. I tillegg høstet vi lunger for celletall og differensialer, BAL-proteinkvantifisering, cytospinn, bakteriekolonidannende enhetstellinger og histologi. Til slutt ble høydimensjonal flowcytometri utført. Vi foreslår denne modellen som et verktøy for å forstå immunlandskapet under de tidlige og sene oppløsningsfasene av lungeskade.

Introduction

Akutt respiratorisk distress syndrom (ARDS) er fortsatt et vanlig dødelig og invalidiserende syndrom som rammer omtrent 10 % av pasientene på intensivavdelingen (ICU) og opptil 23 % av individene under mekanisk ventilasjon, noe som fører til en sykehusdødelighet på 35 %-46 %1. Dessuten har den nylige COVID-19-pandemien på nytt understreket viktigheten av å studere ARDS. Covid-19-positive tilfeller har stått for en økning i ARDS-dødelighet, noe som fremhever begrensningen av farmakologiske terapier2.

Hos mennesker er ARDS preget av raskt innsettende hypoksemi (PaO2/FiO2 < 300) og bevis på ikke-hydrostatisk bilateralt lungeødem på grunn av overdreven alveolær-kapillær permeabilitet og alveolitt3. Selv om ARDS tradisjonelt har blitt beskrevet som et mønster av akutt lungeskade (ALI) sekundært til en rekke fornærmelser, er bakteriell og viral lungebetennelse (PNA) fortsatt blant de vanligste årsakene. Tre hovedpatofysiologiske stadier, nemlig de ekssudative, proliferative og fibrotiske stadiene, er beskrevet, mens de to viktigste kardinaltrekkene ved ARDS er dysregulert betennelse og alveolokapillærforstyrrelse4. Under disse prosessene produseres alveolær skade ved frigjøring av inflammatoriske cytokiner (f.eks. tumornekrosefaktor [TNF-α], interleukin [IL-1β, IL-6, IL-8, etc.]), en tilstrømning av nøytrofiler og inflammatoriske makrofager, og flom av proteinrik væske. Til syvende og sist fører disse hendelsene til ujevn og bilateral alveolær skade 5,6,7,8.

Selv om det er gjort betydelige fremskritt i forståelsen av tidlig lungeskade og betennelse, er mekanismene som ligger til grunn for oppløsning av PNA mindre kjent og bør være i fokus for fremtidige mekanistiske undersøkelser. Hovedmålet med denne metodeartikkelen er å gi etterforskere en skadeoppløsningsmodell for infeksiøs lungebetennelse som kan replikere de viktigste patofysiologiske egenskapene til ARDS. Vi foreslår at denne modellen vil bidra til å bedre forstå de biologiske mekanismene som ligger til grunn for oppløsning av lungebetennelse og reparasjon, og dermed tjene som en plattform for redningsterapi.

De viktigste fysiopatologiske stadiene som oppstår under ARDS kan replikeres i prekliniske dyremodeller av ALI, som bør inkludere et histologisk bevis på inflammatorisk respons, vevsskade, fysiologisk dysfunksjon, alveolitt og endring av den alveolære kapillærbarrieren9. En musemodell som induserer PNA og ALI er fordelaktig på grunn av dens høye reproduserbarhet, raske avl og tilgjengeligheten av flere verktøy for å utføre mekanistiske og molekylære studier. Det er ingen enkelt modell som fullt ut rekapitulerer alle funksjonene til menneskelig ARDS9.

Modeller av PNA hos mus tillater replikasjon av de viktigste patofysiologiske mekanismene produsert av infeksiøs ARDS hos mennesker, for eksempel raskt utbrudd, bevis på vevsskade i histologi, svekkelse av alveolo-kapillærbarrieren, bevis på inflammatorisk respons og fysiologisk dysfunksjon samtidig som den gir beskjeden dødelighet10 . Infeksiøse modeller kan induseres ved lokal eller systemisk levering av patogenet, med intranasal, intratrakeal og intravenøs administrasjon som de hyppigste administrasjonsveierne. Den intratrakeale ruten tillater direkte inokulering av smittestoffet i lungene, reduserer aerosolisering og optimaliserer leveringen11,12.

Metodikken for en preklinisk murin modell av PNA ved intratrakeal instillasjon av enten levende Streptococcus pneumoniae (Spn) eller Klebsiella pneumoniae (Kp) er beskrevet her. Disse modellene representerer et godt surrogat for ARDS produsert av bakteriell PNA, og har flere fordeler, inkludert: utbredte årsaker til human PNA-ARDS (samfunns- og sykehuservervet); høy reproduserbarhet; dødelighet og skade kan lett titreres (modellering av ulike grader av lungebetennelse) for å vise en robust inflammatorisk respons, noe som fører til alveolitt og alveoloculær dysfunksjon; evaluering av tidlige og sene faser av lungeskade og oppløsning; og evaluering av terapeutiske strategier på ulike stadier av PNA-ARDS.

Protocol

Alle dyreprotokollene beskrevet i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) ved Johns Hopkins University, School of Medicine for dyreprotokollen MO21M160. I tillegg ble eksperimentene utført etter institusjonelle, statlige og føderale forskrifter for dyreforsøk. FORSIKTIG: Replikasjonen av alle protokollene beskrevet nedenfor må utføres i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2)-skap, i henhold til alle de institusjonelle BSL-2-retningslinjene under biosikkerhetsskapet. 1. Plettering av bakteriestammer fra kommersielle sløyfer MERK: Denne protokollen kan brukes til å dyrke bakterielagre for Spn (ATCC 49619) og Kpn (ATCC 43816), og starter med kultiløkkene hentet fra leverandøren (se materialtabellen for detaljer). Varm en 5% saueblodagarplate i 15 minutter ved 37 °C i en inkubator. En celleinkubator kan brukes til dette formålet. Under panseret, fjern kappen fra den bakterielle inokuleringssløyfen og spre den forsiktig, strøk inn i agarplaten, etter et sikksakkmønster. Gjenta dette trinnet med en egen plate som et duplikat. Opptil fem plater kan stripes med samme løkke. Inkuber platene over natten ved 37 °C for optimal bakterievekst. Passasje bakteriene daglig i 3 dager. Varm opp blodagarplatene i 15 minutter ved 37 °C, ta mellom 15 og 20 kolonier fra den første agarplaten ved hjelp av en engangsinokuleringssløyfe, og fordel dem i en ny, forvarmet agarplate. Merk platen på riktig måte. 2. Bakterievekst og lagring for fremtidig bruk Etter 3 dager, plukk opptil 30 kolonier fra blodagarplaten med en strekløkke, og legg den direkte i en 250 ml kolbe som inneholder Todd Hewitt-buljong (TH-buljong). Inkuber ved 37 °C, rist ved 250 o/min, med 5 % CO2 i ca. 4 timer. Ta alikvoter hvert 15 minutt for å måle OD620nm til den når 0.3, som tilsvarer omtrent 3 x 108 kolonidannende enheter (CFU) per ml. Alikvoter ut 1 ml av den nye bakteriestammen umiddelbart i 2 ml kryogene hetteglass. Hurtigfrys de ferske alikvoterte hetteglassene i flytende nitrogen i 5 minutter. Oppbevar alikvoter av bakterier i en -80 °C fryser (hetteglass kan brukes i opptil 6-8 måneder før de mister styrke). Etter 7 dager med frysing kan alikvotene brukes til dyrestudier. Bestem derfor den nye konsentrasjonen av bakteriene. 3. Bakterier tiner for intratrakeal instillasjon Varm en blodagarplate i 10 minutter ved 37 °C i en shaker. Ta et av de nye buljongglassene ut av fryseren og tin det ved forsiktig omrøring i et 37 °C vannbad i ca. 2 minutter. Unngå å berøre O-ringen eller hetten med det varme vannet. Plate på en blodagarplate for å telle bakteriekoloniene manuelt. Utfør en 1 x 10-6 fortynning, og plate 200 μL fra siste fortynning i en forvarmet blodagarplate. Gjør dette i duplikater. Inkuber platene over natten ved 37 °C for optimal vekst av bakteriene. Neste dag, bruk følgende formel for å bestemme den nye bakteriekonsentrasjonen: CFU/ml = (antall kolonier x fortynningsfaktor) / volum av lagerbelagt 4. Intratrakeal instillasjon av levende bakterier MERK: Denne protokollen er optimalisert for å innpode et volum på 50 μL intratrakealt. Bakterielagre kan lagres i opptil 6-9 måneder. For å sikre bakteriell CFU i hvert hetteglass, sørg for å plate den før hvert eksperiment, beregne bakteriestammen CFU som beskrevet ovenfor, og bruk TH-buljong for påfølgende fortynninger. FORSIKTIG: Utfør en overlevelsesprosedyre for gnagere under biosikkerhetsskapet ved hjelp av sterile kirurgiske instrumenter. Bedøve musen ved å injisere intraperitonealt 100 mg/kg ketamin og 2,5 mg/kg acetylpromazin. Gjenta for antall mus som injiseres om gangen.MERK: Mus kan eksponeres for isofluran for å lette håndtering av dyr. En erfaren behandler som er i stand til å injisere intraperitoneale anestetika uten å forårsake betydelig dyreplager, kan imidlertid unngå isofluraneksponering. Antall mus som skal injiseres avhenger av kirurgens ekspertise. Etter at alle musene er under passende anestesi, bekreft anestesi ved haleklype. Plasser den bedøvede musen på en ren og sterilisert overflate, heng dyret i fortennene og teip forsiktig forbenene (Figur 1A).NOTAT: For å sikre dyrenes velvære, sørg for hornhinnesmøring hos alle bedøvede dyr. Karboksymetylcellulose øyedråper kan brukes, påfør en dråpe per øye. Barber nakkeregionen og desinfiser området med klorheksidin og 70% alkohol. Bruk en kirurgisk saks til å lage et 1 cm overfladisk midtlinjesnitt i nakken for å visualisere luftrøret (figur 1B). Ett lite snitt bør være nok, men hvis du ser en overflod av fettvev, dissekerer du fettvevet forsiktig vertikalt for å visualisere luftrøret.NOTAT: Bruk sterile hansker og sterile instrumenter via teknikken med kun spisser. Risikoen for infeksjon er minimal hvis prosedyren utføres under sterile forhold. Bruk tang til å intubere hver mus. Trekk tungen forsiktig utover og før et 20 G angiokateter gjennom munnen, før kateteret inn i luftrøret. Påfør forsiktig trykk over luftrøret for å lette intubasjonen.MERK: Fordi luftrøret er foran musekroppen, bøy tuppen av kateteret litt, da dette vil bidra til å få vinkelen for å intubere musen. Nakkesnittet utføres hovedsakelig for visualiseringsformål; alternativt kan operatøren intubere luftrøret blindt. Etter intubasjon, koble musen til en åndedrettsvern for å bekrefte intubasjon. De vanlige ventilatorparametrene som brukes i denne prosedyren er 200 μL slagvolum og 200 slag per minutt. Skru ventilatorfrekvensen opp og/eller ned kort for rask og enkel bekreftelse. Etter å ha bekreftet intubasjon, koble musen fra åndedrettsvernet og innpodet forsiktig 50 μL av bakteriemidlet gjennom angiokateteret ved hjelp av en 200 μL pipettgelbelastningsspiss. For kontrollmus, injiser 50 μL steril TH-buljong. Etter å ha innpodet bakteriemidlet, koble musen til åndedrettsvernet igjen for å hjelpe til med å puste igjen. La musen stå på åndedrettsvernet i 30-60 s. Etter å ha injisert alle musene, overvåk pusten deres. Hvis det er et langsomt pustemønster, kobler du musene til åndedrettsvern igjen. Lukk snittet ved å legge en liten dråpe lim på huden. Samle hudfoldene og trykk forsiktig til limet tørker. Plasser musene på en varmepute for restitusjon og overvåk dem nøye til de gjenvinner tilstrekkelig bevissthet. Overfør musene tilbake i buret når de er helt restituert. For postoperativ smerte/distress behandling kan musene behandles med buprenorfin, med en dose på 0,05-0,1 mg/kg subkutant (SC).NOTAT: Dyr med vekttap større enn 20 % eller som opplever betydelig nød etter prosedyren, for eksempel sløvhet, manglende evne til å nå vann eller mat, anstrengt pust, nedsatt respons på ytre stimuli eller redusert mental årvåkenhet, bør avlives. 5. Bronkoalveolær skylling og lungehøsting Avlive musen ved å legge den i en lukket beholder som inneholder 5 % isofluran. Fortsett eksponeringen for isofluran i 1 minutt etter at musen har sluttet å puste. Utfør torakotomi for å bekrefte eutanasi.MERK: Bekreft eutanasi ved visuell og fysisk undersøkelse. Hjertet må ha sluttet å slå og musene pustet ikke. Slimhinner skal være hvite eller bleke. Legg musen i liggende stilling på et rent kirurgisk brett og heng den ved fortennene. Spray musehuden med 70 % etanol. Bruk kirurgisk saks til å lage et lite overfladisk midtlinjesnitt i nakken for å visualisere luftrøret til musen. Kannulater luftrøret med et 20 G kateter. Tilsett forsiktig 1 ml kalsiumfritt fosfatbufret saltvann (PBS) intratrachealt ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Tillat full lungeutvidelse, og aspirer deretter væsken med samme sprøyte. Gjenta dette trinnet i totalt 2 ml. Overfør BAL til en 2 ml alikvot. Utfør dette trinnet to ganger for et endelig volum på 2 ml. Ikke skyll lungene med mer enn 1 ml om gangen, på grunn av den høye risikoen for forstyrrelser i alveolær plass. Åpne brysthulen og avslør lungen, hjertet og luftrøret ved hjelp av saks og tang. Disseker membranen forsiktig og fjern brystkassen. Pass på at du ikke klemmer lungevevet. Transekter abdominal aorta for å tillate ekssanguinasjon. Perfuser lungevevet ved å lage et lite snitt på ca. 2 mm i høyre ventrikkel med saks og injiser 5 ml kald PBS ved hjelp av et 20 G kateter. PBS skal perfusere lungen. Hvis en adekvat perfusjon utføres, vil lungevevet bli hvitblekt og PBS vil forlate det intravaskulære rommet gjennom abdominal aorta. Trekk forsiktig ut lungene og disseker dem fra luftrøret for å utføre enten histologi eller videre prosessering til enkeltcellesuspensjon. Ved behandling for histologi, sett forsiktig inn et 20 G kateter for å blåse opp lungene opp til 25 cm H2O med formalinoppløsning (nøytral bufret 10%). Når lungene er innblåst, før du en 3.0 suturstreng som er omtrent 5 cm lang under luftrøret, og bind den fast to ganger for å sikre at formalinet forblir i lungevevet. Disseker lungen forsiktig fra resten av vevet og plasser den i et 15 ml konisk rør som inneholder 10 ml formalinoppløsning. 6. Bronkoalveolær skyllebehandling Sentrifuger BAL-en ved 500 x g ved 4 °C i 5 min. Fjern den cellefrie supernatanten i et separat rør og oppbevar ved -80 °C.MERK: Ytterligere analyse kan utføres i BAL-supernatanten, inkludert proteinkvantifisering (f.eks. BCA-analyse13) eller måling av spesifikke biomarkører eller cytokiner (ELISA-analyser og multiple analyser med plattformer som MSD og Luminex). Lys de røde blodcellene ved å tilsette 100 μL lyseringsbuffer i 1 min. Nøytraliser lyseringsreaksjonen ved å tilsette 1 ml PBS. Sentrivoluger BAL ved 500 x g ved 4 °C i 5 minutter og fjern supernatanten. Resuspender cellene i PBS (100-300 μL; basert på cellepelletstørrelse). Utfør en celletelling med 0,4 % trypanblå flekk ved manuell eller automatisert celletelling. Bruk den gjenværende pelleten til flowcytometrifarging og/eller kryokonservering (ved å gjensuspendere i kryokonserveringsløsning) i flytende nitrogen for videre testing. 7. Lungebehandling for enkeltcellesuspensjon Disseker lungen forsiktig fra resten av vevet og plasser den i et 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml kald PBS. Fjern lungen fra PBS og tørk den med et papirhåndkle. Forbered en fordøyelsescocktail ved å tilsette 1 mg DNase og 5 mg kollagenase i 1 ml Dulbeccos modifiserte Eagle’s medium (DMEM) med lav glukose. Overfør lungen til et C-rør som inneholder 1 ml fordøyelsescocktail. Overfør C-røret til vevsdissosiatoren og følg den standardiserte protokollen for behandling av lungevev14. Tilsett 10 ml kald PBS i C-røret og bland ordentlig. Filtrer enkeltcellesuspensjonen med en 70 μm cellesil på toppen av et 50 ml konisk rør. Utfør filtreringen to ganger. Sentrifuger suspensjonen ved 500 x g ved 4 °C i 5 min. Dekanter supernatanten forsiktig og tilsett 1 ml lyseringsbuffer i 1 minutt ved romtemperatur. Tilsett 10 ml kald PBS for å stoppe lyseringsreaksjonen og fjern supernatanten. Sentrifuger suspensjonen ved 500 x g ved 4 °C i 5 min. Dekanter supernatanten forsiktig og tilsett 10 ml kald PBS. Utfør en celletelling med trypan blå flekk ved manuell eller automatisert celletelling. Bruk en cellepellet for flowcytometrifarging og/eller kryokonservering i flytende nitrogen for videre testing.

Representative Results

Prosedyrene beskrevet ovenfor tillot modellering av de patofysiologiske mekanismene som ligger til grunn for bakteriell lungebetennelsesindusert lungeskade hos mus. For å begynne å modellere, ble C57BL/6 villtype (WT) mus hentet fra Jackson Laboratory og avlet på instituttets dyreanlegg. Hannmus av WT C57BL/6, 8 uker gamle, gjennomgikk intratrakeal inokulering av enten TH-buljong (kontroll), 3 x 106 CFU levende Spn eller 200 CFU levende Kpn. Etter infeksjonen ble musene overvåket i 6 og 10 dager for henholdsvis Spn og Kpn. Selv om de infiserte gruppene viste lavere kroppsvekt sammenlignet med den uinfiserte kontrollen, gjenvant Spn-gruppen kroppsvekten mot baseline, mens Kpn-infiserte mus viste langsom restitusjon etter 6 dager med infeksjon (figur 2A). I løpet av studiens varighet trengte ingen mus å gjennomgå eutanasi på grunn av kroppsvekt over 20 %, og det var ingen tegn på smerte og nød. Vi målte lungeskade over ulike intervaller. BAL-proteinkonsentrasjon og totalt celletall for både BAL og lunger var signifikant høyere i de infiserte gruppene (figur 2). Representative histologiske snitt som viser den inflammatoriske prosessen i begge modellene ble oppnådd på dag 2, 4 og 6 etter inokulering (figur 3), som viste tegn på vedvarende alveolær betennelse hos de Kpn-infiserte musene (figur 4), selv på dag 10. Kpn-infiserte mus fortsatte skaden innen dag 10 (figur 2 og figur 4), mens Spn-infiserte mus løste lungebetennelsen innen dag 6 (figur 2 og figur 3). Lunge enkeltcellesuspensjoner ble brukt til å diskriminere immunlandskapet ved høydimensjonal flowcytometri på dag 6 etter infeksjon i Spn-modellen , ved bruk av et 18-farget panel i fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Ved å bruke t-distribuert stokastisk naboinnbygging (t-SNE), kan generelle forskjeller i immuncellesammensetningen visualiseres, noe som er bemerkelsesverdig for et økt antall granulocytter (CD45+, CD11b+, CD24+, MHC-II-), interstitielle makrofager (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-), monocytter (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-, CD64-), B-celler (CD45+, CD19+) og T-celler (CD45+, CD3+), inkludert naturlige drepeceller (CD45+, CD3+, NK1.1+), som vist i figur 5. Portstrategier er vist i figur 6. Figur 1: Kirurgisk prosedyre for intratrakeal instillasjon av levende bakterier. (A) Plassering av musen i det sterile operasjonsområdet, hengende ved fortennene. (B) Eksponering for snittområde og luftrør. (C) Intubasjonsprosess som setter inn 20 G-kateteret. Figur laget med Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Profiler for akutt lungeskade (ALI) etter pneumonimodeller. (A) Kroppsvekt over tid i forhold til baseline, kontroll versus Kpn og Spn (n = 4, per gruppe). (B) BAL total proteinkvantifisering ved BCA-analyse (n = 4, per gruppe). (C) BAL totalt antall celler i kontroll (n = 3), Kpn (n = 4) og Spn (n = 3). (D) Lunge totalt antall celler i kontroll (n = 3), Kpn (n = 4) og Spn (n = 3). (E-G) BAL-celledifferensial ved manuell histologitelling av BAL-cytospinnet i kontroll (n = 3), Kpn (n = 4) og Spn (n = 3). Statistiske tester ble utført ved individuell t-test, og sammenlignet den uinfiserte kontrollen med de infiserte gruppene. *p < 0,05. Data vises ved hjelp av standardfeil (SE) for hvert plott. Y-aksen er dager etter infeksjon for alle paneler. Forkortelser: BAL = bronkoalveolær skylling; Spn = Streptococcus pneumoniae; Kpn = Klebsiella pneumoniae. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Lungehistopatologiske funn under Spn-infeksjon . Hematoxylin- og eosin (H&E)-farging av histologiske seksjoner av en representativ BAL og lungeseksjon etter intratrakeal infeksjon av Spn og på dag 2, 4 og 6. BAL-forstørrelse = 100x; lungeforstørrelse = 10x. Forkortelser: BAL = bronkoalveolær skylling; Spn = Streptococcus pneumoniae. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Lungehistopatologiske funn under Kpn-infeksjon . Hematoksylin og eosin (H&E) farging av histologiske seksjoner av en representativ BAL og lungeseksjon etter intratrakeal infeksjon av Kpn på dag 2, 4, 6 og 10. Bildene viser en høy effektforstørrelse (skalalinje = 50 μm). Forkortelser: BAL = bronkoalveolær skylling; Kpn = Klebsiella pneumoniae. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Immuncellelandskap ved flerfarget flowcytometri etter 6 dager med Spn-infeksjon . (A) T-distribuert stokastisk naboinnbygging (t-SNE) ble brukt for å visualisere immuncellepopulasjonene (CD45+) i lungen ved å sammenligne den uinfiserte kontrollgruppen versus infisertgruppen. (B) Oppsummering av immuncellefrekvensene av de totale CD45+-cellene i lungen. (C) Totalt celletall for hver enkelt populasjon. Statistiske sammenligninger ble gjort ved t-tester mellom kontrollgruppen og infiserte. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Data vises ved hjelp av standardfeil (SE) for hvert plott. Forkortelser: BAL = bronkoalveolær skylling; Spn = Streptococcus pneumoniae. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Gating-strategier for å identifisere immuncellesubpopulasjonen i lungene ved baseline og etter pneumoni. BAL- og lungecellesuspensjon gjennomgikk farging for flerfarget flowcytometri. Rusk ble først sperret ut ved hjelp av SSC-A og FSC-A, og enkeltcellene ble styrt av to strategier (SSC-W vs. SSC-H og FSC-W vs. FSC-H). Levende celler ble identifisert ved å bruke en levende/død diskriminator versus SSC-A. Påfølgende cellepopulasjoner ble identifisert med tidligere identifiserte markører 15. Forkortelse: BAL = bronkoalveolær skylling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Eksperimentelle musemodeller av PNA tilbyr en plattform for å evaluere de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for skade og oppløsning av ARDS. De patofysiologiske komponentene som kan evalueres inkluderer tidlige inflammatoriske veier, bakteriell clearance, dynamiske immunlandskapsendringer, oppløsning av betennelse, fibroproliferasjon og epitelial og vaskulær reparasjon16. Imidlertid må flere aspekter vurderes når man planlegger å replikere denne modellen av lungebetennelsesindusert lungeskade, inkludert alder, kjønn, musestamme, iboende vertsfaktorer (f.eks. immunkompromittert tilstand), det spesifikke patogenet og bakteriebelastningen som brukes, og erfaringen til personalet som utfører prosedyren.

PNA er blant de viktigste årsakene til ARDS. Vi valgte å bruke levende Spn og Kpn, som er utbredte årsaker til samfunns- og sykehuservervet PNA hos mennesker, henholdsvis17. Vi foreslår å optimalisere bakteriemodeller av PNA ved å titrere doser av levende bakterier for å oppnå ønsket dødelighets- og skadeløsningsprofil som passer best til etterforskerens hypotese. Vi har optimalisert en intratrakeal bakterieinokulering på 3 x 106 CFU for Spn og 200 CFU for Kpn hos mus, noe som forårsaket alveolær betennelse, forstyrrelse av alveolokapillærbarrieren og organdysfunksjon (figur 2). Imidlertid kan bakteriepartier fra forskjellige kilder eller til og med innenfor duplikatsløyfer vise forskjellige grader av betennelse og skade, selv når du bruker samme stamme og CFU.

Derfor, for å gjenskape resultatene presentert i dette manuskriptet, bør forskere starte med bakteriekonsentrasjonen beskrevet her; det kan imidlertid hende de må øke eller redusere dosen for å oppnå en lignende modellprofil. Derfor må hvert nytt parti med bakterier som brukes, optimaliseres for potensiell skadeløsningseffekt. Vi presenterer en robust modell av PNA med to forskjellige oppløsningsutfall, en selvoppløsende (Spn) og en annen en sakte/ikke-oppløsende (Kpn) som kan tjene som plattformer for etterforskere for å evaluere immunologiske mekanismer og teste terapeutiske intervensjoner, spesielt ved eller etter topp infeksjon (f.eks. 2 dager etter infeksjon).

Alder, kjønn, belastning og genetiske faktorer påvirker kinetikken til skadeoppløsningsmønstrene16. For eksempel gir sex akselerert oppløsning hos kvinner sammenlignet med menn18; Derfor fører en økning i bakteriell belastning til økt dødelighet og forsinket oppløsning hos menn sammenlignet med kvinner. Aldring er en annen faktor å vurdere når du titrerer CFU av bakterier som brukes. Aldrende mus viste 100 % dødelighet når vi brukte den spesifiserte Spn-dosen (ikke vist her). Unge mus brukes oftest i pneumokokk-PNA-modellene (fra 6 til 14 uker), mens aldrende mus (19-26 måneder gamle) viser en endret immunrespons og brukes til å undersøke aldringens rolle i PNA11 . Vi måtte redusere CFU ned til 300% for å oppnå overlevelse hos aldrende dyr (ikke vist her). Hannmus C57BL/6 (8-12 uker gamle) ble brukt i denne studien og ble fulgt i løpet av 6 til 10 dager etter infeksjon. Signifikante forskjeller i følsomhet kan også finnes mellom stammer; innavlede stammer som BALB/C og C57BL6/J har forskjellige responser på infeksjon11,19.

Direkte inokulering av bakterier intratrachealt tillater en mer presis levering av inokulumet (opptil 99 %) inn i lungene12, noe som representerer et alternativ for mindre virulente serotyper og reduserer aerosoliseringen av bakterier11. Det kan imidlertid hevdes at det er en invasiv prosedyre. Intubasjon kan være utfordrende, krever systemisk anestesi og kan føre til luftrørstraumer med påfølgende luftveisødem og stridor. Mus kan utvikle en vasovagal refleks som fører til apné, som det er nødvendig å ha en liten museventilator for å gi ekstra respiratorstøtte ved behov. Ekspertisen til kirurgen som utfører prosedyren er en kritisk komponent for å garantere vellykket intubasjon11. I vår studie trengte ingen mus å bli avlivet på grunn av riktig smertebehandling og ikke mer enn 20 % tap av kroppsvekt. Ingen tegn på smerte og nød som sløvhet, manglende evne til å nå vann eller mat, anstrengt pust eller redusert mental årvåkenhet ble sett. Alternative metoder for direkte bakteriell levering til lungene er orofaryngeal aspirasjon, selv om oppløsningen av lungeskade ser ut til å skje raskere, og noen bakterier kan ende i mage og mage-tarmkanal20.

Prekliniske modeller av PNA gjør det mulig for etterforskere å evaluere immunlandskapet. Bronkoalveolære og interstitielle kompartment kan vurderes for dynamiske endringer i immunceller16. Dessuten kan celler dyrkes og stimuleres ex vivo for å bestemme deres spesifikke produksjon av cytokiner og kjemokiner. Her fokuserer vi på å utforske immuncellelandskapet i lungen og BAL ved å bruke flerfarget flowcytometri. Enkeltcelle-RNA-sekvensering kan også utføres for å forstå de cellespesifikke transkriptomiske signaturene på forskjellige stadier av skadeoppløsning.

PNA-ARDS-modeller genererer systemiske effekter som kan oppdages tidlig ved å måle kroppsvekten i sykdomsforløpet10. Selv om vi ikke direkte måler systemiske effekter av ARDS, kan organdysfunksjon også vurderes ved blodmåling av kjemiprofiler, og ved å høste forskjellige vev som milt, nyre og lever for histologi. Systemiske effekter av pneumokokk PNA-ARDS er tidligere beskrevet av andre grupper som bruker samme bakteriestamme21.

Her beskrives en modell av eksperimentell PNA som ligner noen av de viktigste patofysiologiske funnene som ligger til grunn for human ARDS. Selv om det ikke finnes noen ideelle modeller som fullstendig rekapitulerer kompleksiteten og heterogeniteten til human ARDS9, er disse modellene relevante og reproduserbare for å studere mekanismene for lungeskade og reparasjon, og fungerer også som en plattform for identifisering av nye potensielle farmakologiske mål som fokuserer på å akselerere oppløsningen av lungebetennelse og fremme lungereparasjon.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av NIH-stipend R01 HL131812 og R01HL163881.

Materials

1-200 µL Round 0.5 mm Thick Gel-Loading Pipet Tips Corning 4853
2 mL Cryogenic vials Corning Incorporated 431420 2 mL self standing, round bottom, red cap, polypropylene
2 mL Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes Fisherscientific 05-402-24C Shape: Round, Length (Metric): 38mm, Diameter (Metric) Outer: 10mm, Capacity (Metric): 2mL
70 µm Cell Strainer Falcon 352350 White, Sterile, Individually Packaged
96-well Clear Round Bottom Falcon 353077  TC-treated Cell Culture Microplate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile
Acepromizine Maleate Injection, USP 500 mg/50 mL (10mg/mL) Phoenix NDC 57319-604-04 EACH mL CONTAINS: acepromazine maleate 10 mg, sodium citrate 0.36%, Citric acid 0.075%, benzyl alcohol 1% and water for injection.
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer Quality Biological 118-156-721 4 x 100mL
Anti-mouse I-A/I-E Biolegend 107628 APC/Cyanine7 anti-mouse I-A/I-E [M5/114.15.2]; Isotype: Rat IgG2b
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
BD Trypticase Soy Agar  BD-Biosciences 90001-276 5% Sheep Blood Prepared Media Stacker Plates, BD Diagnostics
Biotix Disposable Reagent Reservoirs Biotix 89511-194
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrih A4503
CD103 Invitrogen 509723 Integrin alpha E) Armenian Hamster anti-Mouse, FITC, Clone: 2E7
CD11b Invitrogen RM2817 PE-Texas Red, Clone: M1/70.15, Invitrogen
CD11c BD Biosciences 565872 Hamster anti-Mouse, APC-R700, Clone: N418, BD Horizon
CD19 Biolegend 152410 APC anti-mouse CD19 [1D3/CD19]; Isotype: Rat IgG2a, κ
CD24 BD Biosciences 563450 Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 711, Clone: M1/69
CD4 BD Biosciences 563790 BUV395; Clone: GK1.5
CD45 Biolegend 103157 Brilliant Violet 750 anti-mouse CD45 [30-F11]; Isotype: Rat IgG2b, κ;
CD8a BD Biosciences 612759 Rat anti-Murine, Brilliant Ultraviolet 737, Clone: 53-6.7
Cell Counting Slides  Bio-rad 1450017 For TC20 Cell Counter
Cell strainer 70 µL Nylon Falcon 198718 REF 352350
Collagenase Type1  Worthington Biochemical Corporation LS004197
Culti-Loop Streptococcus pneumoniae  Thermo Scientific R4609015 ATCC 4961
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrih DN25
Disposable inoculation loops/needles Fisherbrand 22-363-603 Color blue; Volume 1 µL
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning 10-014-CV
Fc Block BD Biosciences 553142 CD16/CD32 Rat anti-Mouse, Unlabeled, Clone: 2.4G2
Formalin solution Sigma-Aldrih HT501640 Formalin solution, neutral buffered, 10%
Gauze Sponges, Covidien Curity 2146-
gentleMACS C Tubes MACS Miltenyi Biotec 130-093-237
gentleMACS Dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235 SN: 4715
Hema 3 Manual Staining System and Stat Pack Thermo Scientific  23123869
Isoflurane Liquid Inhalation Henry Schein 1182097
IV CATHETER JELCO 20GX1.25" Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc 405611
Ketamine HCl Injection Henry Schein 1049007 Ketamine HCl Injection MDV 100mg/mL 10mL 10/Box
Klebsiella pneumoniae  ATCC 43816 subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan
Loctite 409 Electron Microscopy Sciences 7257009
Ly-6C Biolegend 128036 Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C [HK1.4]; Isotype: Rat IgG2c
Ly-6G BD Biosciences 740157 Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 510, Clone: 1A8, BD Optibuild
MiniVent Type 845 Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus 4694 D-79232 March (Germany)
NK-1.1 BD Biosciences 553165 Mouse anti-Mouse, PE, Clone: PK136, BD
Phase Hemacytometer Hausser Scientific 1475
Phosphate-Buffered Saline Corning 21-040-CV 1X without calcium and magnesium,
Round Bottom Sarstedt 55.476.305
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes  Falcon 352235 With Cell Strainer Snap Cap, 5mL
SealRite 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube USA Scientific 1615-5500 Free of detectable Rnase, DNase, DNA and pyrogens.
Shandon EZ Single Cytofunnel Epredia A78710003
Siglec-F BD Biosciences 562681 Anti-Mouse, Brilliant Violet 421, Clone: E50-2440
Silk Black Braided 30"(75 cm) Sterile, nonabsorbable surgical suture U.S.P. Ethicon K-834 0 (3.5 metric)
Stainless-Steel Slide Clip Epredia 59910052
Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 1660045
Syringe sterile, single use, 1 mL BD-Biosciences 309628
TC20 Automatic Cell Counter Bio-Rad 508BR05740
TipOne 200 ul yellow pipet tip refill USA Scientific 1111-0706
TODD HEWITT BROTH RPI T47500 
TPX Sample Chamber Epredia A78710018
TPX Single Sample Chamber, Caps and Filter Cards Epredia 5991022
Trypan Blue Bio-rad 1450022
U-100 Insulin Syringes BD-Biosciences 329461
Wet-Proof Multi-Heat Electric Heat Pad Cullus Model PR7791AB 120 volst AC; 45 watts; Listed 562B/E26869

References

  1. Bellani, G., et al. Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries. JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).
  2. Hariri, L., Hardin, C. C. Covid-19, angiogenesis, and ARDS endotypes. The New England Journal of Medicine. 383 (2), 182-183 (2020).
  3. Ferguson, N. D., et al. The Berlin definition of ARDS: an expanded rationale, justification, and supplementary material. Intensive Care Medicine. 38 (10), 1573-1582 (2012).
  4. Tomashefski Jr, J. F. Pulmonary pathology of the adult respiratory distress syndrome. Clinics in Chest Medicine. 11 (4), 593-619 (1990).
  5. Martin, T. R. Lung cytokines and ARDS: Roger S. Mitchell lecture. Chest. 116 (1 Suppl), 2S-8S (1999).
  6. Colletti, L. M., et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in the pathophysiologic alterations after hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat. The Journal of Clinical Investigation. 85 (6), 1936-1943 (1990).
  7. Donnelly, S. C., et al. The association between mortality rates and decreased concentrations of interleukin-10 and interleukin-1 receptor antagonist in the lung fluids of patients with the adult respiratory distress syndrome. Annals of Internal Medicine. 125 (3), 191-196 (1996).
  8. Miller, E. J., Cohen, A. B., Matthay, M. A. Increased interleukin-8 concentrations in the pulmonary edema fluid of patients with acute respiratory distress syndrome from sepsis. Critical Care Medicine. 24 (9), 1448-1454 (1996).
  9. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (5), 725-738 (2011).
  10. Kulkarni, H. S., et al. Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: an official American Thoracic Society Workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), e1-e14 (2022).
  11. Borsa, N., Pasquale, M. D., Restrepo, M. I. Animal models of pneumococcal pneumonia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4220 (2019).
  12. Rubins, J. B., et al. Dual function of pneumolysin in the early pathogenesis of murine pneumococcal pneumonia. The Journal of Clinical Investigation. 95 (1), 142-150 (1995).
  13. Thermo Scientific, . Pierce BCA Protein Assay Kit. , .
  14. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), e1266 (2009).
  15. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. an official American Thoracic Society Workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  16. Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. Mouse models of acute respiratory distress syndrome: a review of analytical approaches, pathologic features, and common measurements. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1074-1092 (2015).
  17. Torres, A., et al. Pneumonia. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 25 (2021).
  18. Xiong, Y., et al. Estradiol resolves pneumonia via ERβ in regulatory T cells. JCI Insight. 6 (3), e133251 (2021).
  19. D’Alessio, F. R., et al. Enhanced resolution of experimental ARDS through IL-4-mediated lung macrophage reprogramming. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (8), L733-L746 (2016).
  20. D’Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
  21. Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), L717-L736 (2019).

Play Video

Cite This Article
Villabona-Rueda, A., Wang, D., D’Alessio, F. R. Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia. J. Vis. Exp. (192), e63925, doi:10.3791/63925 (2023).

View Video