Dette manuskriptet beskriver etableringen av en smittsom modell av lungebetennelse hos mus og den respektive karakteriseringen av skadeoppløsning sammen med metoder for dyrking av bakterier og intratrakeal instillasjon. En ny tilnærming som bruker høydimensjonal flowcytometri for å evaluere immunlandskapet er også beskrevet.
Akutt respiratorisk distress syndrom (ARDS) forårsaker akutt lungeskade, preget av rask alveolær skade og alvorlig hypoksemi. Dette fører igjen til høy sykelighet og dødelighet. Foreløpig er det ingen prekliniske modeller som rekapitulerer kompleksiteten til human ARDS. Imidlertid kan infeksiøse modeller av lungebetennelse (PNA) replikere de viktigste patofysiologiske egenskapene til ARDS. Her beskriver vi en modell av PNA indusert av intratrakeal instillasjon av levende Streptococcus pneumoniae og Klebsiella pneumoniae i C57BL6-mus. For å evaluere og karakterisere modellen, etter å ha indusert skade, utførte vi seriemålinger av kroppsvekt og bronkoalveolær skylling (BAL) for å måle markører for lungeskade. I tillegg høstet vi lunger for celletall og differensialer, BAL-proteinkvantifisering, cytospinn, bakteriekolonidannende enhetstellinger og histologi. Til slutt ble høydimensjonal flowcytometri utført. Vi foreslår denne modellen som et verktøy for å forstå immunlandskapet under de tidlige og sene oppløsningsfasene av lungeskade.
Akutt respiratorisk distress syndrom (ARDS) er fortsatt et vanlig dødelig og invalidiserende syndrom som rammer omtrent 10 % av pasientene på intensivavdelingen (ICU) og opptil 23 % av individene under mekanisk ventilasjon, noe som fører til en sykehusdødelighet på 35 %-46 %1. Dessuten har den nylige COVID-19-pandemien på nytt understreket viktigheten av å studere ARDS. Covid-19-positive tilfeller har stått for en økning i ARDS-dødelighet, noe som fremhever begrensningen av farmakologiske terapier2.
Hos mennesker er ARDS preget av raskt innsettende hypoksemi (PaO2/FiO2 < 300) og bevis på ikke-hydrostatisk bilateralt lungeødem på grunn av overdreven alveolær-kapillær permeabilitet og alveolitt3. Selv om ARDS tradisjonelt har blitt beskrevet som et mønster av akutt lungeskade (ALI) sekundært til en rekke fornærmelser, er bakteriell og viral lungebetennelse (PNA) fortsatt blant de vanligste årsakene. Tre hovedpatofysiologiske stadier, nemlig de ekssudative, proliferative og fibrotiske stadiene, er beskrevet, mens de to viktigste kardinaltrekkene ved ARDS er dysregulert betennelse og alveolokapillærforstyrrelse4. Under disse prosessene produseres alveolær skade ved frigjøring av inflammatoriske cytokiner (f.eks. tumornekrosefaktor [TNF-α], interleukin [IL-1β, IL-6, IL-8, etc.]), en tilstrømning av nøytrofiler og inflammatoriske makrofager, og flom av proteinrik væske. Til syvende og sist fører disse hendelsene til ujevn og bilateral alveolær skade 5,6,7,8.
Selv om det er gjort betydelige fremskritt i forståelsen av tidlig lungeskade og betennelse, er mekanismene som ligger til grunn for oppløsning av PNA mindre kjent og bør være i fokus for fremtidige mekanistiske undersøkelser. Hovedmålet med denne metodeartikkelen er å gi etterforskere en skadeoppløsningsmodell for infeksiøs lungebetennelse som kan replikere de viktigste patofysiologiske egenskapene til ARDS. Vi foreslår at denne modellen vil bidra til å bedre forstå de biologiske mekanismene som ligger til grunn for oppløsning av lungebetennelse og reparasjon, og dermed tjene som en plattform for redningsterapi.
De viktigste fysiopatologiske stadiene som oppstår under ARDS kan replikeres i prekliniske dyremodeller av ALI, som bør inkludere et histologisk bevis på inflammatorisk respons, vevsskade, fysiologisk dysfunksjon, alveolitt og endring av den alveolære kapillærbarrieren9. En musemodell som induserer PNA og ALI er fordelaktig på grunn av dens høye reproduserbarhet, raske avl og tilgjengeligheten av flere verktøy for å utføre mekanistiske og molekylære studier. Det er ingen enkelt modell som fullt ut rekapitulerer alle funksjonene til menneskelig ARDS9.
Modeller av PNA hos mus tillater replikasjon av de viktigste patofysiologiske mekanismene produsert av infeksiøs ARDS hos mennesker, for eksempel raskt utbrudd, bevis på vevsskade i histologi, svekkelse av alveolo-kapillærbarrieren, bevis på inflammatorisk respons og fysiologisk dysfunksjon samtidig som den gir beskjeden dødelighet10 . Infeksiøse modeller kan induseres ved lokal eller systemisk levering av patogenet, med intranasal, intratrakeal og intravenøs administrasjon som de hyppigste administrasjonsveierne. Den intratrakeale ruten tillater direkte inokulering av smittestoffet i lungene, reduserer aerosolisering og optimaliserer leveringen11,12.
Metodikken for en preklinisk murin modell av PNA ved intratrakeal instillasjon av enten levende Streptococcus pneumoniae (Spn) eller Klebsiella pneumoniae (Kp) er beskrevet her. Disse modellene representerer et godt surrogat for ARDS produsert av bakteriell PNA, og har flere fordeler, inkludert: utbredte årsaker til human PNA-ARDS (samfunns- og sykehuservervet); høy reproduserbarhet; dødelighet og skade kan lett titreres (modellering av ulike grader av lungebetennelse) for å vise en robust inflammatorisk respons, noe som fører til alveolitt og alveoloculær dysfunksjon; evaluering av tidlige og sene faser av lungeskade og oppløsning; og evaluering av terapeutiske strategier på ulike stadier av PNA-ARDS.
Eksperimentelle musemodeller av PNA tilbyr en plattform for å evaluere de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for skade og oppløsning av ARDS. De patofysiologiske komponentene som kan evalueres inkluderer tidlige inflammatoriske veier, bakteriell clearance, dynamiske immunlandskapsendringer, oppløsning av betennelse, fibroproliferasjon og epitelial og vaskulær reparasjon16. Imidlertid må flere aspekter vurderes når man planlegger å replikere denne modellen av lungebetennelsesindusert lungeskade, inkludert alder, kjønn, musestamme, iboende vertsfaktorer (f.eks. immunkompromittert tilstand), det spesifikke patogenet og bakteriebelastningen som brukes, og erfaringen til personalet som utfører prosedyren.
PNA er blant de viktigste årsakene til ARDS. Vi valgte å bruke levende Spn og Kpn, som er utbredte årsaker til samfunns- og sykehuservervet PNA hos mennesker, henholdsvis17. Vi foreslår å optimalisere bakteriemodeller av PNA ved å titrere doser av levende bakterier for å oppnå ønsket dødelighets- og skadeløsningsprofil som passer best til etterforskerens hypotese. Vi har optimalisert en intratrakeal bakterieinokulering på 3 x 106 CFU for Spn og 200 CFU for Kpn hos mus, noe som forårsaket alveolær betennelse, forstyrrelse av alveolokapillærbarrieren og organdysfunksjon (figur 2). Imidlertid kan bakteriepartier fra forskjellige kilder eller til og med innenfor duplikatsløyfer vise forskjellige grader av betennelse og skade, selv når du bruker samme stamme og CFU.
Derfor, for å gjenskape resultatene presentert i dette manuskriptet, bør forskere starte med bakteriekonsentrasjonen beskrevet her; det kan imidlertid hende de må øke eller redusere dosen for å oppnå en lignende modellprofil. Derfor må hvert nytt parti med bakterier som brukes, optimaliseres for potensiell skadeløsningseffekt. Vi presenterer en robust modell av PNA med to forskjellige oppløsningsutfall, en selvoppløsende (Spn) og en annen en sakte/ikke-oppløsende (Kpn) som kan tjene som plattformer for etterforskere for å evaluere immunologiske mekanismer og teste terapeutiske intervensjoner, spesielt ved eller etter topp infeksjon (f.eks. 2 dager etter infeksjon).
Alder, kjønn, belastning og genetiske faktorer påvirker kinetikken til skadeoppløsningsmønstrene16. For eksempel gir sex akselerert oppløsning hos kvinner sammenlignet med menn18; Derfor fører en økning i bakteriell belastning til økt dødelighet og forsinket oppløsning hos menn sammenlignet med kvinner. Aldring er en annen faktor å vurdere når du titrerer CFU av bakterier som brukes. Aldrende mus viste 100 % dødelighet når vi brukte den spesifiserte Spn-dosen (ikke vist her). Unge mus brukes oftest i pneumokokk-PNA-modellene (fra 6 til 14 uker), mens aldrende mus (19-26 måneder gamle) viser en endret immunrespons og brukes til å undersøke aldringens rolle i PNA11 . Vi måtte redusere CFU ned til 300% for å oppnå overlevelse hos aldrende dyr (ikke vist her). Hannmus C57BL/6 (8-12 uker gamle) ble brukt i denne studien og ble fulgt i løpet av 6 til 10 dager etter infeksjon. Signifikante forskjeller i følsomhet kan også finnes mellom stammer; innavlede stammer som BALB/C og C57BL6/J har forskjellige responser på infeksjon11,19.
Direkte inokulering av bakterier intratrachealt tillater en mer presis levering av inokulumet (opptil 99 %) inn i lungene12, noe som representerer et alternativ for mindre virulente serotyper og reduserer aerosoliseringen av bakterier11. Det kan imidlertid hevdes at det er en invasiv prosedyre. Intubasjon kan være utfordrende, krever systemisk anestesi og kan føre til luftrørstraumer med påfølgende luftveisødem og stridor. Mus kan utvikle en vasovagal refleks som fører til apné, som det er nødvendig å ha en liten museventilator for å gi ekstra respiratorstøtte ved behov. Ekspertisen til kirurgen som utfører prosedyren er en kritisk komponent for å garantere vellykket intubasjon11. I vår studie trengte ingen mus å bli avlivet på grunn av riktig smertebehandling og ikke mer enn 20 % tap av kroppsvekt. Ingen tegn på smerte og nød som sløvhet, manglende evne til å nå vann eller mat, anstrengt pust eller redusert mental årvåkenhet ble sett. Alternative metoder for direkte bakteriell levering til lungene er orofaryngeal aspirasjon, selv om oppløsningen av lungeskade ser ut til å skje raskere, og noen bakterier kan ende i mage og mage-tarmkanal20.
Prekliniske modeller av PNA gjør det mulig for etterforskere å evaluere immunlandskapet. Bronkoalveolære og interstitielle kompartment kan vurderes for dynamiske endringer i immunceller16. Dessuten kan celler dyrkes og stimuleres ex vivo for å bestemme deres spesifikke produksjon av cytokiner og kjemokiner. Her fokuserer vi på å utforske immuncellelandskapet i lungen og BAL ved å bruke flerfarget flowcytometri. Enkeltcelle-RNA-sekvensering kan også utføres for å forstå de cellespesifikke transkriptomiske signaturene på forskjellige stadier av skadeoppløsning.
PNA-ARDS-modeller genererer systemiske effekter som kan oppdages tidlig ved å måle kroppsvekten i sykdomsforløpet10. Selv om vi ikke direkte måler systemiske effekter av ARDS, kan organdysfunksjon også vurderes ved blodmåling av kjemiprofiler, og ved å høste forskjellige vev som milt, nyre og lever for histologi. Systemiske effekter av pneumokokk PNA-ARDS er tidligere beskrevet av andre grupper som bruker samme bakteriestamme21.
Her beskrives en modell av eksperimentell PNA som ligner noen av de viktigste patofysiologiske funnene som ligger til grunn for human ARDS. Selv om det ikke finnes noen ideelle modeller som fullstendig rekapitulerer kompleksiteten og heterogeniteten til human ARDS9, er disse modellene relevante og reproduserbare for å studere mekanismene for lungeskade og reparasjon, og fungerer også som en plattform for identifisering av nye potensielle farmakologiske mål som fokuserer på å akselerere oppløsningen av lungebetennelse og fremme lungereparasjon.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av NIH-stipend R01 HL131812 og R01HL163881.
1-200 µL Round 0.5 mm Thick Gel-Loading Pipet Tips | Corning | 4853 | |
2 mL Cryogenic vials | Corning Incorporated | 431420 | 2 mL self standing, round bottom, red cap, polypropylene |
2 mL Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Fisherscientific | 05-402-24C | Shape: Round, Length (Metric): 38mm, Diameter (Metric) Outer: 10mm, Capacity (Metric): 2mL |
70 µm Cell Strainer | Falcon | 352350 | White, Sterile, Individually Packaged |
96-well Clear Round Bottom | Falcon | 353077 | TC-treated Cell Culture Microplate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile |
Acepromizine Maleate Injection, USP 500 mg/50 mL (10mg/mL) | Phoenix | NDC 57319-604-04 | EACH mL CONTAINS: acepromazine maleate 10 mg, sodium citrate 0.36%, Citric acid 0.075%, benzyl alcohol 1% and water for injection. |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | Quality Biological | 118-156-721 | 4 x 100mL |
Anti-mouse I-A/I-E | Biolegend | 107628 | APC/Cyanine7 anti-mouse I-A/I-E [M5/114.15.2]; Isotype: Rat IgG2b |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
BD Trypticase Soy Agar | BD-Biosciences | 90001-276 | 5% Sheep Blood Prepared Media Stacker Plates, BD Diagnostics |
Biotix Disposable Reagent Reservoirs | Biotix | 89511-194 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrih | A4503 | |
CD103 | Invitrogen | 509723 | Integrin alpha E) Armenian Hamster anti-Mouse, FITC, Clone: 2E7 |
CD11b | Invitrogen | RM2817 | PE-Texas Red, Clone: M1/70.15, Invitrogen |
CD11c | BD Biosciences | 565872 | Hamster anti-Mouse, APC-R700, Clone: N418, BD Horizon |
CD19 | Biolegend | 152410 | APC anti-mouse CD19 [1D3/CD19]; Isotype: Rat IgG2a, κ |
CD24 | BD Biosciences | 563450 | Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 711, Clone: M1/69 |
CD4 | BD Biosciences | 563790 | BUV395; Clone: GK1.5 |
CD45 | Biolegend | 103157 | Brilliant Violet 750 anti-mouse CD45 [30-F11]; Isotype: Rat IgG2b, κ; |
CD8a | BD Biosciences | 612759 | Rat anti-Murine, Brilliant Ultraviolet 737, Clone: 53-6.7 |
Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450017 | For TC20 Cell Counter |
Cell strainer 70 µL Nylon | Falcon | 198718 | REF 352350 |
Collagenase Type1 | Worthington Biochemical Corporation | LS004197 | |
Culti-Loop Streptococcus pneumoniae | Thermo Scientific | R4609015 | ATCC 4961 |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrih | DN25 | |
Disposable inoculation loops/needles | Fisherbrand | 22-363-603 | Color blue; Volume 1 µL |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-014-CV | |
Fc Block | BD Biosciences | 553142 | CD16/CD32 Rat anti-Mouse, Unlabeled, Clone: 2.4G2 |
Formalin solution | Sigma-Aldrih | HT501640 | Formalin solution, neutral buffered, 10% |
Gauze Sponges, Covidien | Curity | 2146- | |
gentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACS Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | SN: 4715 |
Hema 3 Manual Staining System and Stat Pack | Thermo Scientific | 23123869 | |
Isoflurane Liquid Inhalation | Henry Schein | 1182097 | |
IV CATHETER JELCO 20GX1.25" | Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc | 405611 | |
Ketamine HCl Injection | Henry Schein | 1049007 | Ketamine HCl Injection MDV 100mg/mL 10mL 10/Box |
Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan |
Loctite 409 | Electron Microscopy Sciences | 7257009 | |
Ly-6C | Biolegend | 128036 | Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C [HK1.4]; Isotype: Rat IgG2c |
Ly-6G | BD Biosciences | 740157 | Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 510, Clone: 1A8, BD Optibuild |
MiniVent Type 845 | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus | 4694 | D-79232 March (Germany) |
NK-1.1 | BD Biosciences | 553165 | Mouse anti-Mouse, PE, Clone: PK136, BD |
Phase Hemacytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | 1X without calcium and magnesium, |
Round Bottom | Sarstedt | 55.476.305 | |
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes | Falcon | 352235 | With Cell Strainer Snap Cap, 5mL |
SealRite 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | Free of detectable Rnase, DNase, DNA and pyrogens. |
Shandon EZ Single Cytofunnel | Epredia | A78710003 | |
Siglec-F | BD Biosciences | 562681 | Anti-Mouse, Brilliant Violet 421, Clone: E50-2440 |
Silk Black Braided 30"(75 cm) Sterile, nonabsorbable surgical suture U.S.P. | Ethicon | K-834 | 0 (3.5 metric) |
Stainless-Steel Slide Clip | Epredia | 59910052 | |
Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 1660045 | |
Syringe sterile, single use, 1 mL | BD-Biosciences | 309628 | |
TC20 Automatic Cell Counter | Bio-Rad | 508BR05740 | |
TipOne 200 ul yellow pipet tip refill | USA Scientific | 1111-0706 | |
TODD HEWITT BROTH | RPI | T47500 | |
TPX Sample Chamber | Epredia | A78710018 | |
TPX Single Sample Chamber, Caps and Filter Cards | Epredia | 5991022 | |
Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
U-100 Insulin Syringes | BD-Biosciences | 329461 | |
Wet-Proof Multi-Heat Electric Heat Pad | Cullus | Model PR7791AB | 120 volst AC; 45 watts; Listed 562B/E26869 |