Целью этого протокола является предоставление подробных рекомендаций по надлежащей подготовке образцов для анализа липидов и метаболитов в небольших тканях, таких как мозг дрозофилы , с использованием масс-спектрометрии с помощью матрицы лазерной десорбции / ионизации (MALDI).
Липидное профилирование, или липидомика, является хорошо зарекомендовавшим себя методом, используемым для изучения всего содержания липидов в клетке или ткани. Информация, полученная от липидомики, ценна при изучении путей, участвующих в развитии, болезни и клеточном метаболизме. Многие инструменты и приборы помогли проектам липидомики, в первую очередь различные комбинации методов масс-спектрометрии и жидкостной хроматографии. Матричная лазерная десорбция / ионизация масс-спектрометрии (MALDI MSI) недавно стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы. Этот новый метод предоставляет уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах, которое ранее было недостижимо без использования чрезмерных модификаций. Выборочная подготовка подхода MALDI MSI имеет решающее значение и, следовательно, находится в центре внимания настоящего документа. В этой статье представлен быстрый липидный анализ большого количества мозгов дрозофилы , встроенных в соединение оптимальной температуры резания (OCT), чтобы обеспечить подробный протокол подготовки мелких тканей к анализу липидов или метаболитному и мелкомолекулярному анализу с помощью MALDI MSI.
Липиды участвуют в широком спектре биологических процессов и могут быть широко классифицированы на пять категорий на основе их структурного разнообразия: жирные кислоты, триацилглицерины (TAGs), фосфолипиды, липиды стеринов и сфинголипиды1. Фундаментальные функции липидов заключаются в обеспечении источников энергии для биологических процессов (т.е. TAGs) и образовании клеточных мембран (т.е. фосфолипидов и холестерина). Тем не менее, дополнительные роли липидов были отмечены в развитии и заболеваниях и были широко изучены в биомедицинской области. Например, отчеты показали, что жирные кислоты разной длины могут играть уникальную терапевтическую роль. Короткие цепи жирных кислот могут быть вовлечены в защитные механизмы против аутоиммунных заболеваний, цепи жирных кислот средней длины производят метаболиты, которые могут смягчать судороги, а длинные цепи жирных кислот генерируют метаболиты, которые могут быть использованы для лечения метаболических нарушений2. В нервной системе было показано, что холестерин и фосфолипиды, полученные из глии, жизненно важны для синаптогенеза 3,4. Другие типы липидов показали многообещающие результаты в медицинских применениях, включая сфинголипиды, используемые в системах доставки лекарств, и сахаролипиды, используемые для поддержки иммунной системы 5,6. Многочисленные роли и потенциальные терапевтические применения липидов в биомедицинской области сделали липидомику — изучение путей и взаимодействий клеточных липидов — критической и все более важной областью.
Липидомика использует аналитическую химию для изучения липидома в больших масштабах. Основные экспериментальные методы, используемые в липидомике, основаны на масс-спектрометрии (МС) в сочетании с различными методами хроматографии и ионной подвижности 7,8. Использование РС в этой области выгодно из-за его высокой специфичности и чувствительности, скорости приобретения и уникальных возможностей для (1) обнаружения липидов и липидных метаболитов, встречающихся даже на низких и переходных уровнях, (2) обнаружения сотен различных липидных соединений в одном эксперименте, (3) выявления ранее неизвестных липидов и (4) различения липидных изомеров. Среди разработок в области РС, включая десорбционную электрораспылительную ионизацию (DESI), MALDI и масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS), MALDI MSI стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы на основе MS, предоставляя уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах 9,10.
Типичный рабочий процесс липидомики состоит из пробоподготовки, сбора данных с использованием технологии масс-спектрометрии и анализа данных11. Изучение липидов и метаболитов в образцах привело к появлению методик по пониманию физиологических и патологических состояний обменных процессов в организмах. Хотя понимание биологических взаимодействий важно, чувствительность липидов и метаболитов затрудняет их изображение и идентификацию без красителей или других модификаций. Изменения в уровнях или распределении метаболитов могут привести к фенотипическим изменениям. Одним из инструментов, используемых для метаболомического профилирования, является MALDI MSI, метод визуализации in situ без меток, способный обнаруживать сотни молекул одновременно. Визуализация MALDI позволяет визуализировать метаболиты и липиды в образцах, сохраняя при этом их целостность и пространственное распределение. Предыдущая технология профилирования липидов включала использование радиоактивных химических веществ для индивидуального картирования липидов, в то время как визуализация MALDI отказывается от этого и позволяет одновременно обнаруживать ряд липидов.
Липидный обмен и гомеостаз играют важную роль в физиологии клеток, таких как поддержание и развитие нервной системы. Одним из существенных аспектов липидного обмена нервной системы является перемещение липидов между нейронами и глиальными клетками, которое опосредовано молекулярными липопротеинами-носителями, включая липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП)12. Липопротеины содержат аполипопротеины (Апо), такие как ApoB и ApoD, которые функционируют как структурные блоки липидного груза и как лиганды для липопротеиновых рецепторов. Перекрестные помехи липидов нейрон-глия включают в себя несколько игроков, таких как ApoD, ApoE и ApoJ, полученные из глии, и их нейронные рецепторы ЛПНП (LDLRs)13,14. У дрозофилы аполипофорин, член семейства ApoB, является основным носителем липидов гемолимфы15. Аполипофорин имеет два тесно связанных липофориновых рецептора (LpR), LpR1 и LpR2, которые являются гомологами LDLR15,16 млекопитающих. В предыдущих исследованиях было обнаружено, что астроцитарно-секретируемый липокалин Glial Lazarillo (GLaz), гомолог дрозофилы человеческого ApoD, и его нейрональный рецептор LpR1 совместно опосредуют липидный шаттлинг нейрон-глия, тем самым регулируя морфогенез дендрита17. Поэтому было высказано предположение, что потеря LpR1 вызовет снижение общего содержания липидов в мозге дрозофилы. MALDI MSI будет подходящим инструментом для профилирования липидного содержимого в небольших тканях мозга дрозофилы LpR1−/−, как показано в этом исследовании.
Несмотря на растущую популярность MALDI MSI, высокая стоимость и экспериментальная сложность прибора часто препятствуют его внедрению в отдельных лабораториях. Таким образом, большинство исследований MALDI MSI проводятся с использованием общих основных средств. Как и в случае с другими применениями MALDI MSI, тщательный процесс подготовки образцов для липидомики имеет решающее значение для достижения надежных результатов. Однако, поскольку подготовка образцовых слайдов обычно выполняется в отдельных исследовательских лабораториях, существует вероятность вариаций в приобретении MALDI MSI. Чтобы бороться с этим, эта статья направлена на предоставление подробного протокола для пробоподготовки небольших биологических образцов до измерения MALDI MSI с использованием анализа липидов большой группы взрослых мозгов дрозофилы в режиме положительных ионов в качестве примера11,17. Однако некоторые классы фосфолипидов и большинство мелких метаболитов благоприятно обнаруживаются с помощью визуализации MALDI в режиме отрицательных ионов, который был описан ранее11. Таким образом, с помощью этих двух примеров исследований мы надеемся предоставить подробные протоколы пробоподготовки различных комбинаций: отдельно стоящая большая ткань против встроенной мелкой ткани, оттаивание по сравнению с установкой с теплым скольжением и режим положительных ионов против режима отрицательных ионов.
Как было продемонстрировано в исследовании вариаций липидного состава в мозге дрозофилы мутантного и дикого типа, MALDI MSI может быть ценным методом визуализации без меток для анализа in situ молекулярных моделей распределения в органах мелких насекомых. Действительно, поскольку …
The authors have nothing to disclose.
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy и Mayan Hein поддерживаются Летней исследовательской программой CUNY (CSURP) Фонда Слоуна. Цзюнь Инь поддерживается программой внутренних исследований Проекта Национальных институтов здравоохранения No 1ZIANS003137. Поддержку этому проекту оказала премия PSC-CUNY Е Хе и Рината Абзалимова, совместно финансируемая Конгрессом профессиональных сотрудников и Городским университетом Нью-Йорка.
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |