Summary

Подготовка образцов для быстрого анализа липидов в мозге дрозофилы с использованием матричной лазерной десорбции / ионизационной масс-спектрометрии

Published: July 14, 2022
doi:

Summary

Целью этого протокола является предоставление подробных рекомендаций по надлежащей подготовке образцов для анализа липидов и метаболитов в небольших тканях, таких как мозг дрозофилы , с использованием масс-спектрометрии с помощью матрицы лазерной десорбции / ионизации (MALDI).

Abstract

Липидное профилирование, или липидомика, является хорошо зарекомендовавшим себя методом, используемым для изучения всего содержания липидов в клетке или ткани. Информация, полученная от липидомики, ценна при изучении путей, участвующих в развитии, болезни и клеточном метаболизме. Многие инструменты и приборы помогли проектам липидомики, в первую очередь различные комбинации методов масс-спектрометрии и жидкостной хроматографии. Матричная лазерная десорбция / ионизация масс-спектрометрии (MALDI MSI) недавно стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы. Этот новый метод предоставляет уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах, которое ранее было недостижимо без использования чрезмерных модификаций. Выборочная подготовка подхода MALDI MSI имеет решающее значение и, следовательно, находится в центре внимания настоящего документа. В этой статье представлен быстрый липидный анализ большого количества мозгов дрозофилы , встроенных в соединение оптимальной температуры резания (OCT), чтобы обеспечить подробный протокол подготовки мелких тканей к анализу липидов или метаболитному и мелкомолекулярному анализу с помощью MALDI MSI.

Introduction

Липиды участвуют в широком спектре биологических процессов и могут быть широко классифицированы на пять категорий на основе их структурного разнообразия: жирные кислоты, триацилглицерины (TAGs), фосфолипиды, липиды стеринов и сфинголипиды1. Фундаментальные функции липидов заключаются в обеспечении источников энергии для биологических процессов (т.е. TAGs) и образовании клеточных мембран (т.е. фосфолипидов и холестерина). Тем не менее, дополнительные роли липидов были отмечены в развитии и заболеваниях и были широко изучены в биомедицинской области. Например, отчеты показали, что жирные кислоты разной длины могут играть уникальную терапевтическую роль. Короткие цепи жирных кислот могут быть вовлечены в защитные механизмы против аутоиммунных заболеваний, цепи жирных кислот средней длины производят метаболиты, которые могут смягчать судороги, а длинные цепи жирных кислот генерируют метаболиты, которые могут быть использованы для лечения метаболических нарушений2. В нервной системе было показано, что холестерин и фосфолипиды, полученные из глии, жизненно важны для синаптогенеза 3,4. Другие типы липидов показали многообещающие результаты в медицинских применениях, включая сфинголипиды, используемые в системах доставки лекарств, и сахаролипиды, используемые для поддержки иммунной системы 5,6. Многочисленные роли и потенциальные терапевтические применения липидов в биомедицинской области сделали липидомику — изучение путей и взаимодействий клеточных липидов — критической и все более важной областью.

Липидомика использует аналитическую химию для изучения липидома в больших масштабах. Основные экспериментальные методы, используемые в липидомике, основаны на масс-спектрометрии (МС) в сочетании с различными методами хроматографии и ионной подвижности 7,8. Использование РС в этой области выгодно из-за его высокой специфичности и чувствительности, скорости приобретения и уникальных возможностей для (1) обнаружения липидов и липидных метаболитов, встречающихся даже на низких и переходных уровнях, (2) обнаружения сотен различных липидных соединений в одном эксперименте, (3) выявления ранее неизвестных липидов и (4) различения липидных изомеров. Среди разработок в области РС, включая десорбционную электрораспылительную ионизацию (DESI), MALDI и масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS), MALDI MSI стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы на основе MS, предоставляя уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах 9,10.

Типичный рабочий процесс липидомики состоит из пробоподготовки, сбора данных с использованием технологии масс-спектрометрии и анализа данных11. Изучение липидов и метаболитов в образцах привело к появлению методик по пониманию физиологических и патологических состояний обменных процессов в организмах. Хотя понимание биологических взаимодействий важно, чувствительность липидов и метаболитов затрудняет их изображение и идентификацию без красителей или других модификаций. Изменения в уровнях или распределении метаболитов могут привести к фенотипическим изменениям. Одним из инструментов, используемых для метаболомического профилирования, является MALDI MSI, метод визуализации in situ без меток, способный обнаруживать сотни молекул одновременно. Визуализация MALDI позволяет визуализировать метаболиты и липиды в образцах, сохраняя при этом их целостность и пространственное распределение. Предыдущая технология профилирования липидов включала использование радиоактивных химических веществ для индивидуального картирования липидов, в то время как визуализация MALDI отказывается от этого и позволяет одновременно обнаруживать ряд липидов.

Липидный обмен и гомеостаз играют важную роль в физиологии клеток, таких как поддержание и развитие нервной системы. Одним из существенных аспектов липидного обмена нервной системы является перемещение липидов между нейронами и глиальными клетками, которое опосредовано молекулярными липопротеинами-носителями, включая липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП)12. Липопротеины содержат аполипопротеины (Апо), такие как ApoB и ApoD, которые функционируют как структурные блоки липидного груза и как лиганды для липопротеиновых рецепторов. Перекрестные помехи липидов нейрон-глия включают в себя несколько игроков, таких как ApoD, ApoE и ApoJ, полученные из глии, и их нейронные рецепторы ЛПНП (LDLRs)13,14. У дрозофилы аполипофорин, член семейства ApoB, является основным носителем липидов гемолимфы15. Аполипофорин имеет два тесно связанных липофориновых рецептора (LpR), LpR1 и LpR2, которые являются гомологами LDLR15,16 млекопитающих. В предыдущих исследованиях было обнаружено, что астроцитарно-секретируемый липокалин Glial Lazarillo (GLaz), гомолог дрозофилы человеческого ApoD, и его нейрональный рецептор LpR1 совместно опосредуют липидный шаттлинг нейрон-глия, тем самым регулируя морфогенез дендрита17. Поэтому было высказано предположение, что потеря LpR1 вызовет снижение общего содержания липидов в мозге дрозофилы. MALDI MSI будет подходящим инструментом для профилирования липидного содержимого в небольших тканях мозга дрозофилы LpR1−/−, как показано в этом исследовании.

Несмотря на растущую популярность MALDI MSI, высокая стоимость и экспериментальная сложность прибора часто препятствуют его внедрению в отдельных лабораториях. Таким образом, большинство исследований MALDI MSI проводятся с использованием общих основных средств. Как и в случае с другими применениями MALDI MSI, тщательный процесс подготовки образцов для липидомики имеет решающее значение для достижения надежных результатов. Однако, поскольку подготовка образцовых слайдов обычно выполняется в отдельных исследовательских лабораториях, существует вероятность вариаций в приобретении MALDI MSI. Чтобы бороться с этим, эта статья направлена на предоставление подробного протокола для пробоподготовки небольших биологических образцов до измерения MALDI MSI с использованием анализа липидов большой группы взрослых мозгов дрозофилы в режиме положительных ионов в качестве примера11,17. Однако некоторые классы фосфолипидов и большинство мелких метаболитов благоприятно обнаруживаются с помощью визуализации MALDI в режиме отрицательных ионов, который был описан ранее11. Таким образом, с помощью этих двух примеров исследований мы надеемся предоставить подробные протоколы пробоподготовки различных комбинаций: отдельно стоящая большая ткань против встроенной мелкой ткани, оттаивание по сравнению с установкой с теплым скольжением и режим положительных ионов против режима отрицательных ионов.

Protocol

1. Встраивание головки мухи ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура занимает ~45-60 мин. Подготовьте оптимальную стадию температурного компаунда резки (OCT compound) с плоской поверхностью.Добавьте OCT в пластиковый криомольд (15 мм x 15 мм x 5 мм) на половину глубины криомольда и ?…

Representative Results

Было высказано предположение, что потеря нейронального рецептора LpR1 астроцитарно-секретируемого липокалина Glial Lazarillo (GLaz), гомолога дрозофилы человеческого ApoD, способна вызвать снижение общего содержания липидов в мозге дрозофилы . Чтобы проверить это, MALDI MSI был использован д…

Discussion

Как было продемонстрировано в исследовании вариаций липидного состава в мозге дрозофилы мутантного и дикого типа, MALDI MSI может быть ценным методом визуализации без меток для анализа in situ молекулярных моделей распределения в органах мелких насекомых. Действительно, поскольку …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy и Mayan Hein поддерживаются Летней исследовательской программой CUNY (CSURP) Фонда Слоуна. Цзюнь Инь поддерживается программой внутренних исследований Проекта Национальных институтов здравоохранения No 1ZIANS003137. Поддержку этому проекту оказала премия PSC-CUNY Е Хе и Рината Абзалимова, совместно финансируемая Конгрессом профессиональных сотрудников и Городским университетом Нью-Йорка.

Materials

2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) Millipore Sigma Aldrich 85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 Fisher Scientific NC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE Fisher Scientific 50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS system Bruker Daltonics Inc MALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG Fisher Scientific NC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics AC219095000
Epson Perfection V600 Photo Scanner Amazon Perfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer Fisher Scientific HS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter Fisher Scientific 01-241-1
FlexImaging v3.0 Bruker Daltonics Inc Bruker MS imaging analysis software
HPLC Grade Methanol Fisher Scientific MMX04751
HPLC Grade Water Fisher Scientific W5-1
HTX M5 Sprayer HTX Technologies, LLC Automatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
MSC Ziploc Freezer Bag Fisher Scientific 50-111-3769
SCiLS Lab (2015b) SCiLS Lab Advanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat Fisher Thermo Scientific 95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator Fisher Scientific 08-642-7

References

  1. Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
  2. Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
  3. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  4. Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
  5. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
  6. Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
  7. Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
  8. Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
  9. Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
  10. Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
  11. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
  12. Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
  13. Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
  14. Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
  15. Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
  16. Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
  17. Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
  18. Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
  19. Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
  20. Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
  21. Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
  22. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
  23. Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
  24. Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
  25. Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
  26. Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
  27. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
  28. Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
  29. Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).

Play Video

Cite This Article
Chen, Y. X., Veerasammy, K., Yin, J., Choetso, T., Zhong, T., Choudhury, M. A., Weng, C., Xu, E., Hein, M. A., Abzalimov, R., He, Y. Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. J. Vis. Exp. (185), e63930, doi:10.3791/63930 (2022).

View Video