Summary
Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos del agua y la caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (ARG). El uso de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico) proporciona información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en aguas dulces de Mumbai, India.
Abstract
El desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos (RA) a través de la microbiota asociada con cuerpos de agua dulce es un importante problema de salud mundial. En el presente estudio, se recolectaron muestras de agua dulce y se analizaron con respecto a la diversidad bacteriana total y los genes AR (ARG) utilizando técnicas convencionales basadas en cultivos y un enfoque metagenómico independiente del cultivo de alto rendimiento. Este artículo presenta un protocolo sistemático para la enumeración de las bacterias cultivables totales y resistentes a antibióticos a partir de muestras de agua dulce y la determinación de la resistencia fenotípica y genotípica en los aislados cultivables. Además, informamos el uso de un análisis metagenómico completo del ADN metagenómico total extraído de la muestra de agua dulce para la identificación de la diversidad bacteriana general, incluidas las bacterias no cultivables, y la identificación del grupo total de diferentes ARG (resistoma) en el cuerpo de agua. Siguiendo estos protocolos detallados, observamos una alta carga de bacterias resistentes a los antibióticos en el rango de 9.6 × 10 5-1.2 × 109 UFC/mL. La mayoría de los aislamientos fueron resistentes a los múltiples antibióticos probados, incluyendo cefotaxima, ampicilina, levofloxacina, cloranfenicol, ceftriaxona, gentamicina, neomicina, trimetoprima y ciprofloxacina, con índices de resistencia a antibióticos múltiples (MAR) de ≥0,2, lo que indica altos niveles de resistencia en los aislados. La secuenciación del ARNr 16S identificó patógenos humanos potenciales, como Klebsiella pneumoniae, y bacterias oportunistas, como Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. y Aeromonas spp. La caracterización molecular de los aislados mostró la presencia de varios ARGs, como blaTEM, blaCTX-M (β-lactámicos), aadA, aac (6')-Ib (aminoglucósidos) y dfr1 (trimetoprimas), lo que también fue confirmado por todo el análisis metagenómico de ADN. También se detectó una alta prevalencia de otros ARG que codifican para bombas de eflujo de antibióticos-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamasas-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa catB10 y el gen de resistencia a la rifampicina rphB-. Con la ayuda de los protocolos discutidos en este estudio, confirmamos la presencia de bacterias SAM transmitidas por el agua con diversos rasgos fenotípicos y genotípicos de AR. Por lo tanto, el análisis de ADN metagenómico completo se puede utilizar como una técnica complementaria a las técnicas convencionales basadas en cultivos para determinar el estado general de AR de un cuerpo de agua.
Introduction
La resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha identificado como uno de los problemas mundiales más acuciantes. La rápida evolución de la RAM y su propagación mundial son una de las mayores amenazas para la salud humana y la economía mundial en términos de los costos de salud asociados con ella1. El uso excesivo y el mal uso de antibióticos han llevado a un aumento en AR. Esto ha sido destacado por la pandemia de COVID-19, durante la cual el tratamiento de infecciones secundarias asociadas, en muchos casos, se vio enormemente comprometido debido a la RAM en los pacientes afectados2. Además del uso directo / mal uso de antibióticos por parte de los seres humanos, el uso excesivo y el mal uso de antibióticos en la agricultura y la ganadería y su descarga inadecuada en el medio ambiente, incluidas las masas de agua, son una preocupación importante3. El aumento de nuevos rasgos de resistencia y resistencia a múltiples fármacos en bacterias resalta urgentemente la necesidad de una mejor comprensión de los factores que conducen al desarrollo de AR y su diseminación. Múltiples bacterias resistentes a los antibióticos, que a menudo portan múltiples genes AR (ARG) en elementos genéticos móviles como los plásmidos, pueden transferir estos genes de resistencia a microorganismos no resistentes, incluidos los patógenos humanos potenciales, lo que lleva a la aparición de superbacterias que son intratables incluso con antibióticos de último recurso4. Estas múltiples bacterias resistentes a los antibióticos, si están presentes en los ecosistemas acuáticos, pueden ingresar directamente al intestino humano a través del consumo de alimentos contaminados a base de agua como peces, cangrejos y moluscos. Estudios previos han demostrado que la propagación de bacterias AR en sistemas de agua naturales también puede llegar a otros suministros de agua, incluida el agua potable, y, por lo tanto, puede ingresar a la cadena alimentaria humana 5,6,7.
El objetivo del presente estudio es proporcionar un protocolo integral utilizando una combinación de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico completo) para obtener información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en un cuerpo de agua en Mumbai, India. Convencionalmente, se han utilizado técnicas basadas en el cultivo para estudiar la diversidad bacteriana en cuerpos de agua. Como los microorganismos cultivables constituyen solo un pequeño porcentaje de la microbiota total en cualquier nicho, para tener una mejor comprensión del estado general de la diversidad bacteriana y los diversos rasgos resistentes que prevalecen en cualquier muestra, se deben utilizar varias técnicas basadas en el cultivo e independientes del cultivo en conjunto. Una de esas técnicas robustas y confiables independientes del cultivo es el análisis de ADN metagenómico completo. Este método de alto rendimiento ha sido utilizado con éxito en diversos estudios sobre diversidad bacteriana o anotaciones funcionales de varios ARG 8,9. Esta técnica utiliza el metagenoma (el material genético total en una muestra) como material de partida para varios análisis y, por lo tanto, es independiente del cultivo. Los protocolos del presente estudio se pueden utilizar para el análisis de ADN metagenómico completo para obtener información sobre la diversidad bacteriana total y varios ARG (resistoma) en muestras de agua.
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Protocol
1. Recogida y procesamiento de muestras
- Recogida de muestras
- Recoja el volumen apropiado de la muestra de agua en recipientes de muestras estériles, asegurándose de que no se llenen más de 3/4 del recipiente.
- Transportar las muestras al laboratorio en condiciones asépticas tan pronto como sea posible después de la recolección y procesarlas inmediatamente.
- Procesamiento de muestras
- Filtrar asépticamente la muestra de agua a través de un paño de muselina estéril para eliminar cualquier partícula.
- Llevar a cabo diluciones seriadas apropiadas del agua filtrada para su posterior análisis.
2. Estimación de la carga bacteriana total y del recuento de bacterias resistentes a los antibióticos
- Determinación de la carga bacteriana total
- Suspender 18,12 g de agar R2A, polvo modificado en 1.000 ml de agua doble destilada, y disolver la mezcla por calentamiento. Autoclave la mezcla disuelta a 121 °C, 15 psi durante 20 min. Prepare agar R2A, placas modificadas vertiendo la cantidad apropiada de la mezcla esterilizada en autoclave en placas de Petri estériles (por ejemplo, agregue aproximadamente 20 ml de medio estéril esterilizado en autoclave a una placa de Petri estéril de 90 mm).
- Distribuir uniformemente 100 μL de las diluciones apropiadas de la muestra de agua filtrada en el agar R2A, placa modificada una vez que el medio se solidifique. Realice el experimento por duplicado.
- Incubar todas las placas anteriores a 35-37 °C durante 48 h (variar la temperatura y el tiempo de incubación dependiendo del medio utilizado para el aislamiento).
- Expresar la carga bacteriana total en términos de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) utilizando la ecuación (1):
(1)
- Determinación del recuento bacteriano de AR
- Siga los pasos 2.1.1-2.1.4. Sin embargo, en lugar de agar R2A, las placas modificadas, use agar R2A, placas modificadas complementadas individualmente con cinco antibióticos diferentes, a saber, cefotaxima (3 μg / ml), ciprofloxacina (0.5 μg / ml), eritromicina (20 μg / ml), kanamicina (15 μg / ml) y vancomicina (3 μg / ml).
- Añadir los antibióticos por separado en tubos que contengan 20 ml de agar R2A fundido estéril, modificado (con la temperatura del agar R2A fundido, modificado a ≤40 °C) para alcanzar la concentración final de antibiótico como se menciona en el paso 2.2.1.
- Agite para mezclar uniformemente y vierta en placas de Petri estériles antes de que el agar se solidifique. Realice el experimento por duplicado.
- Incubar todas las placas anteriores a 35-37 °C durante 48 h (si se utiliza un medio diferente, la temperatura y el tiempo de incubación pueden variar).
- Para el control de calidad y la comprobación de la eficacia de los antibióticos, esparcir 100 μL de suspensiones bacterianas de las cepas de Agar R2A de Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 29213 en sus respectivas placas modificadas de Agar R2A que contienen antibióticos (asegúrese de que la densidad del cultivo fresco utilizado para la inoculación sea OD = 0,5 a 600 nm).
- Determinar el recuento bacteriano resistente a los antibióticos en términos de UFC/ml como se describe en el paso 2.1.4.
- Existencias de glicerol de las cepas aisladas
- Seleccionar colonias de AR morfológicamente distintas.
- Suspender una sola colonia aislada en 2 ml de caldo estéril de Luria-Bertani que contenga el antibiótico respectivo (por ejemplo, si se seleccionó una colonia de una placa que contiene cefotaxima, inocular la colonia del paso 2.3.1 en caldo estéril de Luria-Bertani que contenga cefotaxima en su concentración respectiva).
- Incubar los tubos inoculados a 37 °C a 80 rpm hasta que el OD600 alcance 0,5.
- Preparar las existencias de glicerol de los aislados mezclando 750 μL de la suspensión de cultivo del paso 2.3.3 en 250 μL de glicerol estéril al 100% en condiciones asépticas.
- Almacenar las existencias de glicerol a -80 °C hasta un análisis adicional.
NOTA: Para la reactivación de los cultivos de las reservas de glicerol, descongelar las reservas de glicerol a 4 °C. Inocular un bucle de este caldo en 2 ml de caldo estéril Luria-Bertani que contiene el antibiótico respectivo y dejar crecer.
(1)3. Identificación de bacterias cultivables mediante secuenciación del gen 16S rRNA
- Preparación de la plantilla de ADN a partir de los aislados para PCR
NOTA: El protocolo descrito para la preparación de la plantilla de ADN para PCR para el aislamiento de ADN crudo de la bacteria es dado por Carlson et al.10.- Usando un palillo de dientes estéril, tome una colonia única, aislada y pura del aislado que crece en una placa de Petri. Suspender la colonia bacteriana en 100 μL de agua estéril doble destilada en un tubo de microcentrífuga estéril y hervir durante 10 min.
- Centrifugar la suspensión a 10.000 × g durante 2 minutos para granular los residuos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril nuevo para su uso como plantilla de ADN crudo.
- Amplificación por PCR dirigida de la región V3 del gen 16S rRNA y secuenciación
- Preparar 40 μL de la mezcla de reacción en un tubo de PCR para la amplificación por PCR, como se menciona en la Tabla 1.
NOTA: La preparación de ADN debe llevarse a cabo en un bloque de hielo minimizando la posibilidad de contaminación (use guantes mientras manipula los reactivos y limpie la superficie de trabajo a fondo con etanol al 70%). - Coloque el tubo en el bloque térmico y ejecute el programa apropiado en el termociclador de PCR. Consulte la Tabla 2 para las condiciones estandarizadas de ciclo de PCR y la información del manual para la amplificación de las regiones V3 de los genes 16S rRNA.
- Para resolver los amplicones y la visualización, realice electroforesis en gel de agarosa (AGE). Mezclar 10 μL del producto de PCR amplificado y 2 μL de tampón de carga de gel 6x (Tabla 3), y cargar esta mezcla en pocillos en gel de agarosa al 1,5% (disolver 1,5 g de polvo de agarosa en 100 ml de 1x tampón TAE [Tabla 3]) que contiene 5 μL de bromuro de etidio (EtBr) a una concentración final de 0,5 μg/ml de EtBr en 100 ml del gel de agarosa.
PRECAUCIÓN: EtBr es un potente carcinógeno. Se deben usar guantes en todo momento mientras se manipula EtBr y geles que contengan EtBr. - Agregue una escalera de ADN para la estimación del tamaño de los amplicones.
- Realice la electroforesis del gel en un tampón de tanque TAE a 80-100 V.
- Una vez que el tinte de seguimiento ejecute 3/4 del gel, detenga la electroforesis y visualice las bandas de amplicón bajo un transiluminador UV.
- Utilice el producto de PCR (amplicón) para la secuenciación del gen 16S rRNA para identificar el aislado.
- Cuantificar el amplicón sometiéndolo a análisis espectrofotométrico usando la ecuación (2).
(2) - Para verificar la pureza del ADN, calcule la proporción de A260 / A280.
NOTA: Idealmente, este número debe estar por encima de 1.5 y, preferiblemente, entre 1.8 y 2.0. - Para identificar los aislamientos, compare las secuencias que se obtienen con las bases de datos de secuencias utilizando una herramienta de búsqueda de alineación adecuada.
- Preparar 40 μL de la mezcla de reacción en un tubo de PCR para la amplificación por PCR, como se menciona en la Tabla 1.
(2)4. Detección de resistencia a antibióticos en los aislados mediante pruebas de sensibilidad a antibióticos
NOTA: Este protocolo describe el método para la prueba de susceptibilidad a los antibióticos (AST) por difusión de disco. Se utilizaron los siguientes discos antibióticos: cefotaxima (5 μg), ampicilina (10 μg), levofloxacino (5 μg), cloranfenicol (30 μg), tigeciclina (15 μg), ceftriaxona (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicina (10 μg), neomicina (10 μg), trimetoprima (5 μg) y ciprofloxacino (5 μg).
- Preparación del inóculo para el AST
- Inocular asépticamente una colonia de RA única, aislada y purificada utilizando un asa estéril en 2 ml de un medio estéril no selectivo, como el caldo Luria-Bertani (sin ningún antibiótico), e incubar a 37 °C a 80 rpm durante la noche.
- Resuspender tomando 100-150 μL del cultivo cultivado durante la noche (aproximadamente, OD 600 = 1.8-2.0) en 2 ml de medio de caldo fresco no selectivo Luria-Bertani e incubar durante 2-4 h (hasta que el OD600 alcance 0.4-0.5).
- Diluir esta suspensión de cultivo recién cultivada utilizando solución salina estéril al 0,85% de tal manera que la densidad del cultivo sea igual a 0,5 McFarland estándar (aproximadamente, OD600 = 0,1), que corresponde aproximadamente a 1-2 × 108 células/ml.
- Mezcle suavemente la suspensión bacteriana para una distribución celular uniforme.
- Use la suspensión anterior dentro de los 15 minutos posteriores a la dilución.
- Inoculación de las placas de agar
- Prepare placas de agar Mueller-Hinton (MHA) para realizar el AST mezclando 38 g de MHA en 1,000 ml de agua doble destilada y disuelva la mezcla calentando. Autoclave la mezcla disuelta a 121 °C, 15 psi durante 15 min.
- Asegúrese de que la profundidad de MHA en las placas sea de 4 mm (25 ml de medio por placa).
- Simultáneamente, retire los discos antibióticos del congelador y caliéntelos a temperatura ambiente.
NOTA: Los discos antibióticos deben descongelarse gradualmente descongelándolos inicialmente a 4 °C y posteriormente a temperatura ambiente para reducir cualquier peligro potencial de condensación en los discos, que posteriormente puede afectar a la zona de inhibición (ZOI). - En condiciones asépticas, sumergir un hisopo de algodón estéril en el inóculo preparado en el paso 4.1 y eliminar el exceso de suspensión para evitar la sobreinoculación de las placas.
- Extienda el cultivo uniformemente en las placas, comenzando desde la parte superior de la placa MHA y yendo y viniendo de borde a borde. Gire la placa 60° mientras frota.
- Aplicación de los discos antibióticos
- Con la ayuda de fórceps esterilizados por llama, transfiera asépticamente los discos antibióticos a las placas MHA inoculadas y presione los discos suavemente para asegurar un contacto nivelado completo con el agar.
NOTA: Este procedimiento debe realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la inoculación del cultivo en las placas. - Coloque el número adecuado de discos antibióticos en la placa de agar teniendo en cuenta el organismo, el antibiótico utilizado y el tamaño de la placa para evitar la superposición de las zonas de inhibición.
NOTA: Se pueden acomodar de cuatro a cinco discos en una placa circular de 90 mm.
- Con la ayuda de fórceps esterilizados por llama, transfiera asépticamente los discos antibióticos a las placas MHA inoculadas y presione los discos suavemente para asegurar un contacto nivelado completo con el agar.
- Incubación de las placas
- Dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de los discos antibióticos, invertir las placas e incubar a 37 °C durante la noche.
- Interpretación de los resultados
- Mida el diámetro ZOI en milímetros (mm) e infórmelo de acuerdo con los valores de punto de ruptura dados por EUCAST11. Véanse los dos ejemplos que figuran a continuación.
- El punto de ruptura del diámetro de la zona (mm) para un disco antibiótico ciprofloxacino (5 μg) para Enterobacterales es S ≥ 25 y R < 22, lo que significa que se considera sensible (S) si ZOI ≥ 25 mm, mientras que es resistente (R) si ZOI < 22 mm. Si el diámetro de ZOI cae entre 22 y 25, el aislado se considera intermedio (I).
- El punto de ruptura del diámetro de la zona (mm) para un disco antibiótico cloranfenicol (30 μg) para Staphylococcus spp. es S ≥ 18 y R < 18, lo que significa que se considera sensible si ZOI ≥ 18 mm, mientras que es resistente si ZOI < 18 mm.
- Determine el índice de resistencia a antibióticos múltiples (SAM) encontrando la relación entre el número de antibióticos a los que el aislado es resistente y el número total de antibióticos a los que está expuesto el aislado.
NOTA: Para el control de calidad, E. coli ATCC 25922 y S. áureo ATCC 29213 se utilizan como cepas de referencia siguiendo el protocolo como en el paso 4.
- Mida el diámetro ZOI en milímetros (mm) e infórmelo de acuerdo con los valores de punto de ruptura dados por EUCAST11. Véanse los dos ejemplos que figuran a continuación.
5. Detección basada en PCR de genes de resistencia a antibióticos en los aislados
- Utilice un protocolo de PCR estándar para la identificación de ARG en los aislados. Prepare la plantilla de ADN utilizando el protocolo indicado en el paso 3.1.
NOTA: Las condiciones de ciclo de PCR utilizadas en este estudio fueron 94 °C durante 10 min, seguidas de 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, recocido durante 30 s a la temperatura apropiada (estandarizado para cada juego de cebadores), extensión a 72 °C durante 40 s y una extensión final a 72 °C durante 5 min. La mezcla de reacción se describe en la Tabla 4. La lista de ARG, cebadores y temperaturas de recocido se da en la Tabla 5. - Para resolver, visualizar y comprobar la pureza de los amplicones, siga los pasos 3.2.3-3.2.10.
6. Análisis de ADN metagenómico completo para la identificación de la diversidad bacteriana total y la detección de ARG en el metagenoma
- Extracción del ADN total (metagenoma) de la muestra de agua
- Extraer el ADN metagenómico de las muestras de agua filtrada.
NOTA: En el presente estudio, el ADN metagenómico (ADN total) se extrajo de las muestras de agua filtrada utilizando el kit de aislamiento de ADN referenciado siguiendo el protocolo del fabricante (ver la Tabla de materiales). - Verifique la calidad del ADN cargando 3 μL del ADN metagenómico extraído en un gel de agarosa al 0,8% y ejecute el gel a 80-110 V durante aproximadamente 30 minutos.
- Compruebe la presencia de una sola banda intacta.
- Verifique la concentración de ADN con un fluorómetro.
- Extraer el ADN metagenómico de las muestras de agua filtrada.
- Determinación de la diversidad bacteriana y detección de ARG mediante secuenciación de ADN metagenómico completo
- Preparación de bibliotecas y amplificación por PCR:
- Prepare una biblioteca de secuenciación de extremo emparejado utilizando el kit de preparación de la biblioteca de ADN al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales).
- Prepare el ADN para la ligadura del adaptador tomando 200 ng de ADN y cortándolo mecánicamente en fragmentos más pequeños, seguido de un paso continuo de reparación final en el que se agrega una "A" a los extremos 3'.
- Dependiendo de la plataforma utilizada para la secuenciación, ligar adaptadores específicos a ambos extremos de los fragmentos de ADN.
NOTA: Las secuencias cruciales para enlazar bibliotecas con doble código de barras a una celda de flujo para la secuenciación están presentes en estos adaptadores. Esto permite la amplificación por PCR de los fragmentos ligados por adaptador y la unión de los cebadores de secuenciación estándar. - Para verificar la calidad y la cantidad, analice la biblioteca amplificada utilizando un chip de ADN de alta sensibilidad según las instrucciones del fabricante.
- Generación y secuenciación de clústeres:
- Cargue la biblioteca amplificada en la plataforma de secuenciación adecuada para la generación de clústeres y la secuenciación posterior.
NOTA: Las moléculas de biblioteca se unen a los oligos adaptadores complementarios en la celda de flujo de extremo pareado. Durante la secuenciación, las hebras hacia adelante se escinden selectivamente después de la resíntesis de la cadena inversa. Esta hebra inversa copiada se secuencia desde el extremo opuesto del fragmento.
- Cargue la biblioteca amplificada en la plataforma de secuenciación adecuada para la generación de clústeres y la secuenciación posterior.
- Análisis bioinformático:
- Genere andamios a partir de los datos de alta calidad utilizando la plataforma adecuada.
- Someter estos andamios a análisis bioinformáticos para la clasificación taxonómica e identificación de los ARGs.
NOTA: El flujo de trabajo para todo el análisis de ADN metagenómico para la identificación de la diversidad bacteriana total y la detección de ARG en el metagenoma se da en la Figura 1. Un diagrama de flujo de la metodología completa descrita en el manuscrito se da en la Figura 2.
- Preparación de bibliotecas y amplificación por PCR:
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Representative Results
Carga bacteriana total y recuento de bacterias resistentes a los antibióticos (AR)
La enumeración de la carga bacteriana total se llevó a cabo mediante la difusión de diluciones de 10−4 a 10−6 veces de las muestras de agua en agar R2A, medio modificado. Para la enumeración del recuento de bacterias AR, se distribuyeron diluciones de 10-3 a 10-6 veces en placas de medios que contenían antibióticos (Figura 3). Los recuentos totales y de bacterias AR se calcularon como UFC/ml, y todos los experimentos de recubrimiento se realizaron por duplicado. Siguiendo los protocolos anteriores, el presente estudio mostró que el recuento total de bacterias es de 3,0 × 109 UFC/ml. La carga bacteriana de AR fue alta, en el rango de 9,6 × 10 5-1,2 × 109 UFC/ml (Tabla 6).
Identificación de bacterias cultivables mediante secuenciación del gen 16S rRNAgene
El ADN crudo de cada aislado se utilizó como plantilla para realizar la PCR específica del gen 16S rRNA. En el total de 15 aislados de AR secuenciados, 10 pertenecían a la familia Enterobacteriaceae, siendo la mayoría Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae. Bacterias oportunistas raras como Comamonas spp. perteneciente a la familia Comamonadaceae, Micrococcus spp. y Arthrobacter spp. pertenecientes a la familia Micrococcaceae, y Aeromonas spp. perteneciente a la familia Aeromonadaceae también fueron identificados a partir de la muestra de agua (Tabla 7).
Detección de resistencia a antibióticos en bacterias cultivables mediante pruebas de susceptibilidad a antibióticos
El perfil de resistencia a antibióticos de los aislados identificados anteriormente se generó mediante la realización de AST utilizando el método de difusión del disco (Figura 4). De los 15 aislamientos probados, 8 tenían un índice MAR de ≥0,2, lo que indica un alto grado de resistencia. Además, muchos de los aislados mostraron perfiles de co-resistencia (resistencia al mismo conjunto de antibióticos). Sin embargo, aislados como Comamonas spp. y Arthrobacter spp. no mostraron resistencia a ninguno de los antibióticos probados (Tabla 8).
Detección e identificación de genes de resistencia a antibióticos en las bacterias cultivables
Un total de 10 aislados de RA fueron examinados para detectar la presencia de ARG mediante PCR. El ARG más prevalente en los aislados cultivables fue blaTEM que codifica para β-lactamasa, seguido por el gen de resistencia a aminoglucósidos aadA. Otros ARG amplificados fueron blaCTX-M, dfr1 y aac(6')-Ib confiriendo resistencia a β-lactámicos, trimetoprima y aminoglucósidos, respectivamente. Los resultados representativos de la amplificación de los ARG se muestran en la Figura 5. Para la mayoría de los aislados identificados, la resistencia fenotípica (AST) se confirmó a nivel molecular mediante el perfil genotípico de AR basado en PCR.
Identificación de la diversidad bacteriana total en el ADN metagenómico
Para comprobar la presencia de todas las bacterias posibles (tanto cultivables como no cultivables) e identificar sus abundancias relativas, se realizó un análisis de ADN metagenómico para la diversidad bacteriana total. Utilizando el enfoque de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento (HT-NGS), se obtuvieron ~ 96.94% de las lecturas totales de la secuencia, lo que resultó en una alta cobertura. Se realizó una anotación taxonómica para clasificar las lecturas en diferentes grupos taxonómicos desde el filo hasta el nivel de género (Figura 6 y Figura 7). Un total de 50 filos pudieron ser identificados en el metagenoma, lo que indica la alta diversidad bacteriana en la muestra de agua. Proteobacteria fue el filo más dominante, que consiste en las clases Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria y Gammaproteobacteria. A nivel de orden, Burkholderiales fue el orden más prevalente, perteneciente a la clase Betaproteobacteria. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium y Comamonas fueron algunos de los abundantes géneros encontrados en la muestra de agua.
Detección de ARG a partir del ADN metagenómico
Para comprender el conjunto total de ARG en el metagenoma de la muestra de agua, se llevó a cabo una secuenciación metagenómica completa, seguida de la identificación de ARG utilizando herramientas bioinformáticas apropiadas. El enfoque metagenómico asegura que se detecten los ARG presentes en microorganismos cultivables y no cultivables en la muestra. Una variedad de genes que confieren resistencia a β-lactámicos (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); aminogylcosides (AAC(6')-34); quinolonas (qnrS6, qnrVC5); bombas de eflujo antibiótico-resistencia-nodulación-división celular (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), casete de unión a ATP (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) y superfamilia de facilitadores mayores (MFS) (abaQ); dihidrofolato reductasa resistente a trimetoprima (dfrD, dfrA20); rifampicina fosfotransferasa (rphB); y cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (catB10) se detectaron en el metagenoma. Los ARG detectados mediante PCR en los aislados cultivables (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) también se detectaron mediante secuenciación metagenómica completa, confirmando así su presencia en la muestra de agua. Los resultados representativos de los ARG identificados en el metagenoma utilizando el análisis de ADN metagenómico completo se dan en la Tabla 9.
Figura 1: Flujo de trabajo para el análisis de ADN metagenómico completo. Se presenta el flujo de trabajo paso a paso para la identificación de la diversidad bacteriana total y la detección de los ARG del metagenoma. Los pasos generales implican la preparación, amplificación e identificación del ADN metagenómico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de la metodología completa. El flujo de trabajo gradual de la metodología utilizada en el presente estudio. Se utiliza una combinación de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos para obtener información completa sobre la diversidad bacteriana y la identidad de los ARG presentes en la muestra de agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de colonias aisladas en agar R2A que contiene antibióticos, placas modificadas. Muestras de agua chapadas en agar R2A que contiene cefotaxima (3 μg/mL), placas modificadas. La muestra se diluyó en serie y se chapó en duplicado-A1, A2: 10−4; B1, B2: 10−5; C1, C2: 10−6. Después del período de incubación apropiado, las colonias aisladas fueron visibles en las placas B1, B2, C1 y C2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Prueba de susceptibilidad a antibióticos por el método de difusión del disco. Imágenes representativas de AST por el método de difusión discal para un aislado de Escherichia coli . AST se realizó en duplicado-A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. Los diámetros de los ZOI se midieron en milímetros (mm). Para interpretar si el aislado es resistente o susceptible al antibiótico utilizado, el ZOI se comparó con las últimas tablas EUCAST. Abreviaturas: AST = prueba de susceptibilidad a antibióticos; CTX = cefotaxima; MIP = imipenem; C = cloranfenicol; CIP = ciprofloxacino; LE = levofloxacino; TGC = tigeciclina; AMP = ampicilina; GEN = gentamicina; TR = trimetoprima; N = neomicina; K = kanamicina; CTR = ceftriaxona; ZOI = zona de inhibición; EUCAST = Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antibióticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Amplificación por PCR de genes de resistencia a antibióticos de bacterias cultivables. Se realizó electroforesis en gel de agarosa post PCR para la visualización de bandas amplificadas para verificar la presencia de ARG en los aislamientos. Se pueden ver bandas separadas de amplicones de PCR en el gel. El tamaño de los amplicones de PCR individuales se compara con un marcador de ADN apropiado. Carril L1: escalera de ADN de 100 pb; Carriles 1-5: 1: dfr1 (425 pb); Carril 2: blaTEM (310 pb); Carril 3: blaCTX-M (500 pb); Carril 4: aac(6')-Ib ( 395 pb); Carril 5: aadA (624 pb). Abreviatura: ARGs = genes de resistencia a los antibióticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Clasificación taxonómica para el filo y los niveles de clase . (A) Gráfico de barras que muestra la distribución de abundancia taxonómica a nivel de filo del metagenoma bacteriano en la muestra de agua. Un total de 50 filos bacterianos fueron identificados por el análisis metagenómico. Se muestran los primeros 12 filos dominantes de bacterias. (B) Gráfico de barras que muestra la distribución de abundancia taxonómica a nivel de clase del metagenoma bacteriano en la muestra de agua. Un total de 50 clases bacterianas fueron identificadas por el análisis metagenómico. Se muestran las primeras 15 clases dominantes de bacterias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Clasificación taxonómica para el orden y los niveles de género. (A) Gráfico de barras que muestra la distribución de abundancia taxonómica a nivel de orden del metagenoma bacteriano en la muestra de agua. Un total de 50 órdenes bacterianas fueron identificadas por el análisis metagenómico. Los primeros 14 órdenes dominantes de bacterias se muestran en la figura. (B) Gráfico de barras que muestra la distribución de abundancia taxonómica a nivel de género del metagenoma bacteriano en la muestra de agua. Un total de 50 géneros bacterianos fueron identificados por el análisis metagenómico. Los primeros 15 géneros dominantes de bacterias se muestran en la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivos de PCR | Volumen (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 20 |
| Cebador delantero (10 pico moles) | 1.5 |
| Cebador inverso (10 pico moles) | 1.5 |
| Plantilla de ADN crudo | 1.5 |
| Agua estéril de biología molecular | 15.5 |
| Volumen total | 40 |
Tabla 1: Componentes de la mezcla maestra de PCR. La composición de la mezcla de reacción de varios reactivos de PCR.
| Dirección | Secuencia de cebadores 5' – 3' | Condiciones de PCR | Nº de ciclos |
| Adelante | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C durante 10 min | 1 |
| Desnaturalización a 94 °C durante 30 s | 35 | ||
| Recocido a 50 °C durante 30 s | |||
| Extensión a 72 °C durante 40 s | |||
| Marcha atrás | CTACCGGGGTATCTAATCC | Extensión final a 72 °C durante 5 min | 1 |
Tabla 2: Condiciones del ciclo de PCR para la amplificación del gen 16S rRNA. Se muestran las condiciones del ciclo de PCR requeridas para la amplificación del gen 16S rRNA. Los pasos incluyen un paso inicial de desnaturalización, seguido de 35 ciclos de desnaturalización, recocido y extensión, y un paso final de extensión.
| 6x gel de carga | |
| Contenido | Cantidad |
| Azul de bromofenol | 25 mg |
| 85% Glicerol | 7,06 ml |
| Agua Milli-Q | 2,94 ml |
| Volumen total | 10 ml |
| 50x composición del regulador de existencias de Tris-acetato-EDTA (TAE) | |
| Contenido | Cantidad |
| Base Tris | 242 g en 700 ml de agua doble destilada |
| Ácido acético glacial (GAA) | 57.1 mL |
| 0,5 M (EDTA) pH 8,0 | 100 ml |
| Ajuste el pH a 8.5 y enrasar el volumen a 1000 ml con agua destilada doble | |
| Para 1x TAE: 20 ml de tampón TAE 50x + 980 ml de agua doble destilada | |
Tabla 3: Composición del tampón de carga de gel 6x y el tampón de cepas de Tris-acetato-EDTA 50x. El tampón de carga de gel 6x se mezcla con la muestra que se ejecutará en la electroforesis en gel de agarosa. Contiene azul de bromofenol como colorante de seguimiento. El glicerol aumenta la densidad de la muestra que se carga para una carga adecuada en los pozos. También se muestra la composición de los diversos reactivos necesarios para la preparación del colchón de existencias 50xTAE. El tampón TAE es uno de los tampones más comunes utilizados para AGE, y mantiene el pH en 8.5 y permite la migración de ADN amplificado durante AGE. Abreviaturas: TAE = Tris-acetato-EDTA; AGE = electroforesis en gel de agarosa.
| Reactivos de PCR | Volumen (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 5 |
| Cebador delantero (10 pico moles) | 0.5 |
| Cebador inverso (10 pico moles) | 0.5 |
| Plantilla de ADN crudo | 1.5 |
| Agua estéril de grado biológico molecular | 2.5 |
| Volumen total | 10 |
Tabla 4: Composición mastermix de PCR para la identificación de ARGs. La composición de la mezcla de reacción de varios reactivos de PCR necesarios para realizar el experimento de PCR.
| Sr. No. | Gen diana | Resistencia a | Cebador | Secuencia de cebador (5'-3') | Tamaño del amplicón (bp) | Temperatura de recocido (°C) | Referencias | ||||
| 1 | DFR Un | Trimetoprima | Adelante | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz et al., 19 | ||||
| Marcha atrás | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β – lactámicos | Adelante | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | Gebreyes, Thakur20 | ||||
| Marcha atrás | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – lactámicos | Adelante | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | Li et al. 21 | ||||
| Marcha atrás | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | Aminoglucósidos | Adelante | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers et al. 22 | ||||
| Marcha atrás | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | AAD Un | Aminoglucósidos | Adelante | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | Ciesielczuk 23 | ||||
| Marcha atrás | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
Tabla 5: Cebadores para la PCR de ARG en bacterias cultivables. Se muestran los diferentes ARG utilizados en el presente estudio junto con sus respectivas secuencias de cebadores. El tamaño esperado del amplicón se da en pares de bases. También se menciona la temperatura de recocido de cada juego de imprimación.
| Antibiótico | Concentración de antibiótico (μg/mL) | UFC/ml |
| - | - | 3,0 x 109 |
| CTX | 3 | 4,5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3,2 x 108 |
| K | 15 | 9,6 x 105 |
| E | 20 | 1,6 x 108 |
| VA | 3 | 1,2 x 109 |
Tabla 6: Recuentos totales de bacterias resistentes a los antibióticos. Se utilizaron cinco antibióticos para el aislamiento inicial de las bacterias resistentes a los antibióticos de la muestra de agua. Los recuentos totales de bacterias (sin antibióticos) y los recuentos de bacterias AR se presentan en términos de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml). Abreviaturas: AR = resistente a los antibióticos; UFC = unidades formadoras de colonias; CTX = cefotaxima; CIP = ciprofloxacino; K = kanamicina; E = eritromicina; VA = vancomicina.
| Aislar código | Microorganismos | Familia |
| 1 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 2 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 3 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 4 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 5 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 6 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | Micrococcus spp. | Micrococcáceas |
| 14 | Arthrobacter spp. | Micrococcáceas |
| 15 | Aeromonas spp. | Aeromonadaceae |
Tabla 7: Identificación de aislados resistentes a antibióticos mediante secuenciación del gen 16S rRNA. La PCR de colonias se realizó para cada aislado utilizando cebadores específicos del gen 16S rRNA. Los amplicones obtenidos fueron secuenciados e identificados utilizando herramientas bioinformáticas apropiadas.
| Aislar No. | Aislar | CTX | AMPERIO | LE | C | TGC | CTR | IPM | GEN | N | TR | CIP | ESTROPEAR | Índice MAR | ||
| 1 | Escherichia coli | 13R | 0R | 0R | 28S | 23S | 11R | 39S | AÑOS 20 | 18S | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia coli | 31S | 0R | 12R | 29S | 23S | 32S | 37S | 19S | 16S | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia coli | 14R | 0R | 14R | 14R | 21S | 10R | 34S | 17S | 11R | 24S | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia coli | 28S | 13R | 18R | 26S | 21S | 28S | 32S | 16R | 11R | 24S | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia coli | 11R | 0R | 12R | 26S | 21S | 10R | 31S | 17S | 16S | 22S | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia coli | 27S | 0R | 12R | 12R | 22S | AÑOS 30 | 32S | 19S | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28S | 0R | 17R | 27S | 22S | AÑOS 30 | 32S | 18S | 22S | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 11R | 26S | 24S | 22S | AÑOS 30 | 28S | 17S | 16S | 24S | 23S | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 13R | 25S | 24S | 22S | 28S | 29S | 18S | 17S | 24S | 25S | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33S | 14S | 26S | 28S | 22S | 31S | 32S | 19S | AÑOS 20 | 24S | 29S | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23S | - | - | 37S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27S | - | - | 42S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25S | 17R | 24S | 32S | 22S | 34S | 28S | AÑOS 20 | - | 21S | 26S | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Arthrobacter spp. | 45S | 57S | 28S | 26S | 34S | 27S | 39S | 26S | - | 28S | 28S | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
Tabla 8: Fenotipo de resistencia a antibióticos de los aislados bacterianos analizados por AST. La resistencia fenotípica en los aislados se analizó mediante el método de difusión del disco. Los números indican el ZOI en milímetros (mm). Para el índice MAR, los números indican el número total de antibióticos a los que un aislado es resistente. Abreviaturas: AST = prueba de susceptibilidad a antibióticos; CTX = cefotaxima; AMP = ampicilina; LE = levofloxacino; C = cloranfenicol; TGC = tigeciclina; CTR = ceftriaxona; MIP = imipenem; GEN = gentamicina; N = neomicina; TR = trimetoprima; CIP = ciprofloxacino; R = resistente; S = sensible; SAM = resistencia a antibióticos múltiples; ZOI = zona de inhibición.
| FAMILIA DE GENES AMR | GENA(S) |
| SMB beta-lactamasa | SMB-1 |
| betalactamasa tipo ampC | ampC1 |
| VIM beta-lactamasa | VIM-20 |
| CcrA beta-lactamasa | ccrA |
| NmcA beta-lactamasa | nmcR |
| ARL Beta-lactamasa | ARL-1 |
| blaZ beta-lactamasa | blaZ |
| blaTEM beta-lactamasa | blaTEM* |
| blaCTX beta-lactamasa | blaCTX |
| CAA(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| HORMIGA(3'') | aadA |
| Proteína de resistencia a quinolonas (QNR) | qnrS6, qnrVC5 |
| bomba de eflujo antibiótico de resistencia-nodulación-división celular (RND) | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| Bomba de eflujo antibiótico de cassette de unión a ATP (ABC) | oleC, macB, patA, bcrA |
| bomba de eflujo antibiótico de superfamilia facilitadora mayor (MFS) | abaQ |
| Dihidrofolato reductasa dFr resistente a la trimetoprima | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| rifampicina fosfotransferasa | rphB |
| Proteínas relacionadas con undecaprenyl pirofosfato | bcrC |
| PBP2 resistente a la meticilina | mecD |
| Proteína de membrana vanJ | vanJ |
| Proteína de protección ribosómica resistente a la tetraciclina | tetT |
| cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) | catB10 |
| Erm 23S ARN ribosómico metiltransferasa | erm(37) |
| Grupo de genes de resistencia a glicopéptidos | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR fosfoetanolamina transferasa | MCR-9 |
| Sul resistente a sulfonamidas | sul3 |
| *También se detectaron genes subrayados en los microorganismos cultivables | |
Tabla 9: ARG identificados mediante análisis de ADN metagenómico completo. El metagenoma total de la muestra de agua se utilizó para la secuenciación metagenómica completa, y las secuencias obtenidas se anotaron utilizando la base de datos ARG apropiada. Se muestran los resultados representativos de algunos de los ARG importantes identificados en el ADN metagenómico. Los genes subrayados también se detectaron en los microorganismos cultivables. Abreviatura: ARG = gen resistente a los antibióticos.
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Discussion
La recolección y el procesamiento de la muestra juegan un papel importante y pueden afectar los resultados y la interpretación del estudio. Por lo tanto, para descartar la variabilidad en las muestras, es importante llevar a cabo el muestreo en múltiples ubicaciones de la masa de agua dulce que se está estudiando. Mantener condiciones ambientales asépticas adecuadas al manipular dichas muestras puede prevenir la contaminación. Además, para evitar cambios en la composición bacteriana que puedan influir en la calidad y cantidad de los ácidos nucleicos extraídos, las condiciones de tránsito deben mantenerse a 4 °C, con un lapso de tiempo mínimo desde el punto de recogida de la muestra hasta el procesamiento posterior. Varios estudios han destacado que este período intermedio entre la recolección y el procesamiento de la muestra puede dar resultados variables durante etapas posteriores del análisis si no se hace con cuidado12,13.
El uso de una gama de diluciones para el recubrimiento asegura que las colonias no se agrupen ni haya muy pocas colonias para contar. Es necesario realizar los experimentos por duplicado para tener en cuenta las variaciones en UFC/ml que puedan surgir debido a errores de pipeteo / manipulación. Además, se mantienen placas de control para cada experimento para garantizar que los antibióticos utilizados funcionen de manera efectiva y que se eliminen los resultados falsos positivos. Por lo tanto, las placas de control no deben tener crecimiento visible de colonias. Esto indica la eficacia de los antibióticos utilizados.
Durante el AST, la densidad de cultivo del inóculo y el grosor de la placa de agar pueden influir en el diámetro del ZOI y, por lo tanto, en la interpretación de los resultados. Por lo tanto, se debe tener cuidado de mantener estos dos factores uniformes al realizar los experimentos AST. El aspecto más crítico es el número de células bacterianas presentes en el inóculo. Generalmente, 1 × 10 8-2 × 108 UFC/ml de células se utilizan como inóculo, que es igual al estándar de 0,5 McFarland14. Esta concentración del inóculo debe mantenerse constante para evitar cualquier variación en los resultados. Cualquier concentración superior o inferior a la concentración requerida debe diluirse con la ayuda de solución salina estéril y utilizarse inmediatamente para la inoculación en un plazo de 15 minutos. Al esparcir el inóculo en las placas de agar, se debe tener cuidado para evitar una cantidad excesiva de inóculo. El exceso de inóculo se puede eliminar presionando el hisopo en los lados del tubo de suspensión bacteriana antes de inocularlo en la placa MHA. Cualquier desviación del procedimiento estándar AST puede afectar significativamente los datos obtenidos de tales protocolos11,15. Un estudio previo mostró que un valor del índice MAR de ≥0,2 indica alta resistencia en los aislados16. Dado que la interpretación de los resultados de la AST se basa en el ZOI, debe evitarse la infrainoculación o la sobreinoculación del cultivo.
Para la PCR, la mezcla maestra debe prepararse en un bloque de hielo para minimizar la posibilidad de degradación de los ingredientes y la pérdida de actividad de la enzima. El uso de guantes durante la configuración de la reacción minimiza la posibilidad de contaminación externa17. El voltaje durante el AGE no debe ser demasiado alto, ya que esto puede provocar un efecto de calentamiento y degradación de las muestras cargadas. Realizar el AGE a un voltaje óptimo garantiza que las bandas estén bien separadas y sean nítidas sin efectos de arrastre o manchas.
Los estudios realizados en las últimas décadas han demostrado el uso de la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA para la identificación de diferentes microorganismos. Para la secuenciación del gen 16S rRNA, la elección del método para la extracción del ADN plantilla puede causar sesgos, lo que, a su vez, puede afectar el análisis posterior. Las bacterias grampositivas tienen una pared celular gruesa de peptidoglicano que puede dificultar la extracción del ácido nucleico. Por lo tanto, la elección del método de extracción debe ser tal que capture eficazmente todos los tipos de ADN microbiano. El método tradicional de ebullición para extraer el ADN de la plantilla cruda es uno de esos métodos eficientes para extraer el contenido de la célula, reduciendo así los sesgos en los resultados.
Para comprender la comunidad bacteriana completa del cuerpo de agua, se utilizó la técnica de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento (HT-NGS) en este estudio. El análisis de ADN metagenómico completo permite el estudio de todo el metagenoma de una muestra dada. Las técnicas basadas en el cultivo proporcionan principalmente un recuento aeróbico de la carga bacteriana, lo que indica la calidad microbiológica de una muestra. Sin embargo, los microorganismos cultivables constituyen sólo el 1% del total de microorganismos. La microflora restante, que comprende una amplia gama de especies, incluidos los anaerobios, está mal caracterizada y a menudo se ignora. Estos microorganismos pueden portar rasgos AR. Además, los microorganismos comensales son un reservorio de genes AR que pueden transmitirse a patógenos a través de diversos eventos de intercambio genético18. Muchos de estos comensales no son cultivables y pueden ser estudiados por un enfoque metagenómico que involucra HT-NGS, proporcionando una mayor cobertura para la identificación de microflora diversa en cualquier muestra. Mediante análisis metagenómico, se obtuvo un perfil detallado de los taxones bacterianos, que complementó los datos cultivables. Además, estos enfoques complementarios pueden proporcionar una idea del estado general de AR del cuerpo de agua en estudio.
En el presente estudio, utilizando una combinación de técnicas metagenómicas convencionales basadas en cultivos y no basadas en cultivos, pudimos identificar la diversidad bacteriana total, diferentes bacterias resistentes a los antibióticos y el conjunto total de ARG transmitidos por el agua. La metodología descrita en este estudio se puede replicar y personalizar para la identificación de patógenos AR en cualquier otra fuente de agua: agua costera, agua natural y agua potable artificial. También se puede utilizar para rastrear la transmisión de patógenos nosocomiales transmitidos por el agua y para monitorear infecciones asociadas al hospital en entornos hospitalarios y clínicos a través de fuentes de agua como lavabos, inodoros, bañeras y humidificadores. Esto ayudará en la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos y la identificación de puntos críticos de resistencia a los antimicrobianos basados en el agua.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses contradictorios que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente apoyado por subvenciones financieras del Departamento de Ciencia y Tecnología-Promoción de la Investigación Universitaria y el Esquema de Excelencia Científica (DST-PURSE) de la Universidad de Mumbai. Devika Ghadigaonkar trabajó como becaria de proyecto bajo el esquema. Se reconoce la ayuda técnica proporcionada por Harshali Shinde, investigador principal del Proyecto n.º de investigación del Departamento de Ciencia y Tecnología-Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (DST-SERB): CRG / 2018 / 003624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
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