Summary
Burada, antibiyotiğe dirençli bakterilerin sudan izolasyonu ve tanımlanması ve antibiyotik direnç genlerinin (ARG'ler) moleküler karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kültür temelli ve kültüre dayalı olmayan (metagenomik analiz) tekniklerin kullanımı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan'dan tatlı sularda bulunan farklı ARG'lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi sağlar.
Abstract
Tatlı su kütleleri ile ilişkili mikrobiyota yoluyla antibiyotik direncinin (AR) gelişimi ve yayılması önemli bir küresel sağlık sorunudur. Bu çalışmada, tatlı su örnekleri, hem geleneksel kültür temelli teknikler hem de yüksek verimli kültürden bağımsız metagenomik bir yaklaşım kullanılarak toplam bakteri çeşitliliği ve AR genleri (ARG'ler) açısından toplandı ve analiz edildi. Bu yazıda, tatlı su örneklerinden elde edilen toplam ve antibiyotiğe dirençli kültürlenebilir bakterilerin sayımı ve kültürlenebilir izolatlarda fenotipik ve genotipik direncin belirlenmesi için sistematik bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, tatlı su örneğinden ekstrakte edilen toplam metagenomik DNA'nın tüm metagenomik analizinin, kültürlenemeyen bakteriler de dahil olmak üzere genel bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve su kütlesindeki toplam farklı ARG (rezistans)" havuzunun tanımlanması için kullanıldığını bildiriyoruz. Bu ayrıntılı protokolleri takiben, 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL aralığında yüksek antibiyotiğe dirençli bakteri yükü gözlemledik. Çoğu izolat, sefotaksim, ampisilin, levofloksasin, kloramfenikol, seftriakson, gentamisin, neomisin, trimetoprim ve siprofloksasin dahil olmak üzere çoklu test edilen antibiyotiklere dirençliydi ve çoklu antibiyotik direnci (MAR) indeksleri ≥0.2 idi ve izolatlarda yüksek direnç seviyelerini gösterdi. 16S rRNA dizilimi, Klebsiella pneumoniae gibi potansiyel insan patojenlerini ve Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. ve Aeromonas spp. gibi fırsatçı bakterileri tanımladı. İzolatların moleküler karakterizasyonu, blaTEM, blaCTX-M (β-laktamlar), aadA, aac (6')-Ib (aminoglikozitler) ve dfr1 (trimetoprimler) gibi çeşitli ARG'lerin varlığını gösterdi ve bu da tüm metagenomik DNA analizi ile doğrulandı. Metagenomik DNA'da antibiyotik efflux pompaları -mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamaz-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, kloramfenikol asetiltransferaz geni catB10 ve rifampisin direnç geni rphB- için kodlayan diğer ARG'lerin yüksek prevalansı da tespit edilmiştir. Bu çalışmada tartışılan protokollerin yardımıyla, çeşitli AR fenotipik ve genotipik özelliklere sahip su kaynaklı MAR bakterilerinin varlığını doğruladık. Bu nedenle, tüm metagenomik DNA analizi, bir su kütlesinin genel AR durumunu belirlemek için geleneksel kültür tabanlı tekniklere tamamlayıcı bir teknik olarak kullanılabilir.
Introduction
Antimikrobiyal direnç (AMR) en acil küresel sorunlardan biri olarak tanımlanmıştır. AMR'nin hızlı evrimi ve dünya çapında yayılması, bununla ilişkili sağlık maliyetleri açısından insan sağlığına ve küresel ekonomiye yönelik en büyük tehditlerden biridir1. Antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı AR'de artışa neden olmuştur. Bu, COVID-19 pandemisi tarafından vurgulanmıştır; bu süre zarfında, birçok durumda, etkilenen hastalarda AMR nedeniyle ilişkili ikincil enfeksiyonların tedavisi büyük ölçüde tehlikeye girmiştir2. Antibiyotiklerin insanlar tarafından doğrudan kullanımı/yanlış kullanımının yanı sıra, tarım ve hayvancılıkta antibiyotiklerin aşırı kullanımı ve yanlış kullanımı ve su kütleleri de dahil olmak üzere çevreye uygunsuz şekilde deşarj edilmesi büyük bir endişe kaynağıdır3. Bakterilerde yeni direnç özelliklerinin ve çoklu ilaç direncinin artması, AR'nin gelişmesine ve yayılmasına yol açan faktörlerin daha iyi anlaşılması ihtiyacını acilen vurgulamaktadır. Plazmidler gibi mobil genetik elementler üzerinde sıklıkla çoklu AR genleri (ARG'ler) taşıyan çoklu antibiyotiğe dirençli bakteriler, bu direnç genlerini potansiyel insan patojenleri de dahil olmak üzere dirençli olmayan mikroorganizmalara aktarabilir ve böylece son çare antibiyotiklerle bile tedavi edilemeyen süper böceklerin ortaya çıkmasına neden olabilir4. Bu çoklu antibiyotiğe dirençli bakteriler, eğer su ekosistemlerinde mevcutsa, balık, yengeç ve yumuşakçalar gibi kontamine su bazlı gıdaların tüketimi yoluyla doğrudan insan bağırsağına girebilir. Önceki çalışmalar, AR bakterilerinin doğal olarak oluşan su sistemlerinde yayılmasının, içme suyu da dahil olmak üzere diğer su kaynaklarına da ulaşabileceğini ve böylece insan besin zincirine girebileceğini göstermiştir 5,6,7.
Bu çalışmanın amacı, toplam bakteri çeşitliliği ve Mumbai, Hindistan'daki bir su kütlesinde bulunan farklı ARG'lerin toplam havuzu hakkında tam bilgi edinmek için kültür tabanlı ve kültür tabanlı olmayan (tüm metagenomik analiz) tekniklerin bir kombinasyonunu kullanarak kapsamlı bir protokol sağlamaktır. Geleneksel olarak, su kütlelerindeki bakteri çeşitliliğini incelemek için kültür temelli teknikler kullanılmıştır. Kültürlenebilir mikroorganizmalar, herhangi bir niş içindeki toplam mikrobiyotanın sadece küçük bir yüzdesini oluşturduğundan, bakteri çeşitliliğinin genel durumunu ve herhangi bir numunede yaygın olan çeşitli dirençli özellikleri daha iyi anlamak için, çeşitli kültür bazlı ve kültürden bağımsız teknikler birlikte kullanılmalıdır. Böyle sağlam ve güvenilir bir kültürden bağımsız teknik, tüm metagenomik DNA analizidir. Bu yüksek verimli yöntem, bakteri çeşitliliği veya çeşitliARG'lerin fonksiyonel ek açıklamaları 8,9 ile ilgili çeşitli çalışmalarda başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik, metagenomu (bir numunedeki toplam genetik materyal) çeşitli analizler için başlangıç materyali olarak kullanır ve bu nedenle kültürden bağımsızdır. Bu çalışmadaki protokoller, su örneklerinde toplam bakteri çeşitliliği ve çeşitli ARG'ler (rezistom) hakkında bilgi edinmek için tüm metagenomik DNA analizi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Numune toplama ve işleme
- Örnek toplama
- Su numunesinin uygun hacmini steril numune kaplarında toplayın ve kabın 3/4'ünden fazlasının doldurulmamasını sağlayın.
- Numuneleri toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede aseptik koşullar altında laboratuvara taşıyın ve hemen işleyin.
- Numune işleme
- Herhangi bir partikül maddeyi çıkarmak için su numunesini steril bir müslin bezden aseptik olarak filtreleyin.
- Daha fazla analiz için filtrelenmiş suyun uygun seri seyreltmelerini gerçekleştirin.
2. Toplam bakteri yükünün tahmini ve antibiyotiğe dirençli bakteri sayısı
- Toplam bakteri yükünün belirlenmesi
- 18.12 g R2A Agar, Modifiye toz 1.000 mL çift damıtılmış suda askıya alın ve karışımı ısıtarak çözün. Çözünmüş karışımı 121 °C'de, 20 dakika boyunca 15 psi'de otoklav yapın. Otoklavlanmış karışımın uygun miktarını steril Petri plakalarına dökerek R2A Agar, Modifiye plakalar hazırlayın (örneğin; 90 mm steril Petri plakasına yaklaşık 20 mL otoklavlanmış steril ortam ekleyin).
- Filtrelenmiş su numunesinin uygun seyreltilerinin 100 μL'sini R2A Agar, Orta katılaştıktan sonra modifiye plaka üzerine eşit olarak yayın. Denemeyi yinelenen olarak gerçekleştirin.
- Yukarıdaki tüm plakaları 48 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin (izolasyon için kullanılan ortama bağlı olarak sıcaklığı ve inkübasyon süresini değiştirin).
- Toplam bakteri yükünü, denklem (1) kullanarak mililitre başına koloni oluşturan birimler (CFU / mL) cinsinden ifade edin:
(1)
- AR bakteri sayısının belirlenmesi
- 2.1.1-2.1.4 adımlarını izleyin. Bununla birlikte, R2A Agar yerine, Modifiye plakalar, R2A Agar, Sefotaksim (3 μg / mL), siprofloksasin (0.5 μg / mL), eritromisin (20 μg / mL), kanamisin (15 μg / mL) ve vankomisin (3 μg / mL) olmak üzere beş farklı antibiyotikle ayrı ayrı desteklenen Modifiye plakalar kullanın.
- Adım 2.2.1'de belirtildiği gibi nihai antibiyotik konsantrasyonunu elde etmek için antibiyotikleri ayrı ayrı 20 mL steril erimiş R2A Agar, Modifiye (erimiş R2A Agar'ın sıcaklığı ile, ≤40 ° C'de modifiye edilmiş) içeren tüplere ekleyin.
- Karıştırmak için girdap yapın ve agar katılaşmadan önce steril Petri plakalarına dökün. Denemeyi yinelenen olarak gerçekleştirin.
- Yukarıdaki tüm plakaları 48 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin (farklı bir ortam kullanıyorsanız, sıcaklık ve kuluçka süresi değişebilir).
- Kalite kontrolü ve antibiyotiklerin etkinliğini kontrol etmek için, Escherichia coli ATCC 25922 ve Staphylococcus aureus ATCC 29213 suşlarının 100 μL bakteriyel süspansiyonlarını, ilgili antibiyotik içeren R2A Agar, Modifiye plakalara yayın (aşılama için kullanılan taze kültürün yoğunluğunun OD = 600 nm'de 0.5 olduğundan emin olun).
- Antibiyotiğe dirençli bakteri sayısını, adım 2.1.4'te açıklandığı gibi CFU / mL cinsinden belirleyin.
- İzolatların gliserol stokları
- Morfolojik olarak farklı AR kolonilerini seçin.
- İlgili antibiyotiği içeren 2 mL'lik steril Luria-Bertani suyunda tek bir izole koloni askıya alın (örneğin, sefotaksim içeren bir plakadan bir koloni seçilmişse, koloniyi 2.3.1 adımından itibaren kendi konsantrasyonunda cefoim taksi içeren steril Luria-Bertani suyunda aşılayın).
- OD600 0,5'e ulaşana kadar aşılanmış tüpleri 80 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin.
- Aseptik koşullar altında 2.3.3 adımından 250 μL steril% 100 gliserol içine 250 μL kültür süspansiyonunu karıştırarak izolatların gliserol stoklarını hazırlayın.
- Gliserol stoklarını daha fazla analize kadar -80 ° C'de saklayın.
NOT: Kültürlerin gliserol stoklarından yeniden canlanması için, gliserol stoklarını 4 ° C'de çözün. Bu stoğun bir ilmekini, ilgili antibiyotiği içeren 2 mL steril Luria-Bertani suyuna aşılayın ve büyümesine izin verin.
(1)3. 16S rRNA gen dizilimi ile kültürlenebilir bakterilerin tanımlanması
- PCR için izolatlardan DNA şablonunun hazırlanması
NOT: Ham DNA'nın bakterilerden izolasyonu için PCR için DNA şablonunun hazırlanması için açıklanan protokol Carlson ve ark.10 tarafından verilmiştir.- Steril bir kürdan kullanarak, bir Petri plakasında büyüyen izolatın tek, izole edilmiş, saf bir kolonisini alın. Bakteri kolonisini steril bir mikrosantrifüj tüpünde 100 μL steril çift damıtılmış suda askıya alın ve 10 dakika kaynatın.
- Enkazı peletlemek için süspansiyonu 2 dakika boyunca 10.000 × g'de santrifüj yapın ve süpernatantı ham DNA şablonu olarak kullanılmak üzere taze steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 16S rRNA geninin V3 bölgesinin hedeflenen PCR amplifikasyonu ve dizilimi
- Tablo 1'de belirtildiği gibi, PCR amplifikasyonu için bir PCR tüpünde reaksiyon karışımının 40 μL'sini hazırlayın.
NOT: DNA preparatı, kontaminasyon olasılığını en aza indirirken bir buz bloğu üzerinde yapılmalıdır (reaktifleri tutarken eldiven giyin ve çalışma yüzeyini% 70 etanol ile iyice temizleyin). - Tüpü termal bloğa yerleştirin ve PCR termal çevrimcisinde uygun programı çalıştırın. Standartlaştırılmış PCR döngü koşulları ve 16S rRNA genlerinin V3 bölgelerinin amplifikasyonu için primer bilgiler için Tablo 2'ye bakınız.
- Amplikonları çözmek ve görselleştirmek için agaroz jel elektroforezi (AGE) uygulayın. Yükseltilmiş PCR ürününün 10 μL'sini ve 2 μL 6x jel yükleme tamponunu (Tablo 3) karıştırın ve bu karışımı, agaroz jelinin 100 mL'sinde 0.5 μL ethidyum bromür (EtBr) içeren 100 mL 1x TAE tamponunun 100 mL'sinde 1.5 g agaroz tozu [Tablo 3] içinde 1.5 g agaroz tozu [Tablo 3] içinde kuyucuklara yükleyin.
DİKKAT: EtBr güçlü bir kanserojendir. EtBr ve EtBr içeren jeller kullanılırken eldivenler her zaman giyilmelidir. - Amplikonların büyüklüğünün tahmini için DNA merdiveni ekleyin.
- Jelin elektroforezini 80-100 V'ta bir TAE tank tamponunda gerçekleştirin.
- İzleme boyası jelin 3 / 4'ünü çalıştırdığında, elektroforezi durdurun ve amplikon bantlarını bir UV transilluminator altında görselleştirin.
- İzolatı tanımlamak için 16S rRNA gen dizilimi için PCR ürününü (amplicon) kullanın.
- Amplikonu denklem (2) kullanarak spektrofotometrik analize tabi tutarak ölçün.
(2) - DNA'nın saflığını kontrol etmek için A260/A280 oranını hesaplayın.
NOT: İdeal olarak, bu sayı 1,5'in üzerinde ve tercihen 1,8 ile 2,0 arasında olmalıdır. - İzolatları tanımlamak için, uygun bir hizalama arama aracı kullanarak dizi veritabanlarıyla elde edilen dizileri karşılaştırın.
- Tablo 1'de belirtildiği gibi, PCR amplifikasyonu için bir PCR tüpünde reaksiyon karışımının 40 μL'sini hazırlayın.
(2)4. Antibiyotik duyarlılık testi kullanılarak izolatlarda antibiyotik direncinin saptanması
NOT: Bu protokol, disk difüzyonu ile antibiyotik duyarlılık testi (AST) yöntemini açıklamaktadır. Aşağıdaki antibiyotik diskler kullanıldı: sefotaksim (5 μg), ampisilin (10 μg), levofloksasin (5 μg), kloramfenikol (30 μg), tigesiklin (15 μg), seftriakson (30 μg), imipenem (10 μg), gentamisin (10 μg), neomisin (10 μg), trimetoprim (5 μg) ve siprofloksasin (5 μg).
- AST için inokulumun hazırlanması
- Luria-Bertani suyu (herhangi bir antibiyotik olmadan) gibi steril seçici olmayan bir ortamın 2 mL'sinde steril bir döngü kullanarak tek, izole edilmiş, saflaştırılmış bir AR kolonisini aseptik olarak aşılayın ve gece boyunca 80 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir gecede yetiştirilen kültürün 100-150 μL'sini (yaklaşık olarak, OD 600 = 1.8-2.0) 2 mL'lik taze seçici olmayan Luria-Bertani et suyu ortamında alarak yeniden askıya alın ve 2-4 saat boyunca inkübe edin (OD600 0.4-0.5'e ulaşana kadar).
- Bu taze yetiştirilmiş kültür süspansiyonunu, steril% 0.85 tuzlu su çözeltisi kullanarak, kültürün yoğunluğu kabaca 1-2 × 108 hücre / mL'ye karşılık gelen 0.5 McFarland standardına (yaklaşık olarak OD600 = 0.1) eşit olacak şekilde seyreltin.
- Eşit hücre dağılımı için bakteri süspansiyonunu nazikçe karıştırın.
- Yukarıdaki süspansiyonu seyreltmeden sonraki 15 dakika içinde kullanın.
- Agar plakalarının aşılanması
- 1.000 mL çift damıtılmış suda 38 g MHA'yı karıştırarak AST'yi gerçekleştirmek için Mueller-Hinton Agar (MHA) plakaları hazırlayın ve karışımı ısıtarak çözün. Çözünmüş karışımı 121 °C'de, 15 dakika boyunca 15 psi'de otoklav yapın.
- Plakalardaki MHA derinliğinin 4 mm (plaka başına 25 mL ortam) olduğundan emin olun.
- Aynı zamanda, antibiyotik disklerini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına ısıtın.
NOT: Antibiyotik diskler, diskler üzerinde daha sonra inhibisyon bölgesini (ZOI) etkileyebilecek olası yoğuşma tehlikesini azaltmak için diskler başlangıçta 4 ° C'de ve daha sonra oda sıcaklığında çözülerek kademeli olarak çözülmelidir. - Aseptik koşullar altında, steril bir pamuklu çubuğu adım 4.1'de hazırlanan inokuluma batırın ve plakaların aşırı aşılanmasını önlemek için fazla süspansiyonu çıkarın.
- Kültürü, MHA plakasının tepesinden başlayarak ve kenardan kenara ileri geri giderek plakalara eşit olarak yayın. Ovalarken plakayı 60° döndürün.
- Antibiyotik disklerin uygulanması
- Alevle sterilize edilmiş forsepslerin yardımıyla, antibiyotik diskleri aseptik olarak aşılanmış MHA plakalarına aktarın ve agar ile tam seviye teması sağlamak için disklere hafifçe bastırın.
NOT: Bu prosedür, kültürün plakalara aşılanmasından sonraki 15 dakika içinde yapılmalıdır. - İnhibisyon bölgelerinin üst üste binmesini önlemek için organizmayı, kullanılan antibiyotiği ve plakanın boyutunu dikkate alarak agar plakasına uygun sayıda antibiyotik disk yerleştirin.
NOT: 90 mm'lik dairesel bir plaka üzerine dört ila beş disk yerleştirilebilir.
- Alevle sterilize edilmiş forsepslerin yardımıyla, antibiyotik diskleri aseptik olarak aşılanmış MHA plakalarına aktarın ve agar ile tam seviye teması sağlamak için disklere hafifçe bastırın.
- Plakaların inkübasyonu
- Antibiyotik disklerin uygulanmasından sonraki 15 dakika içinde, plakaları ters çevirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Sonuçların yorumlanması
- ZOI çapını milimetre (mm) cinsinden ölçün ve EUCAST11 tarafından verilen kesme noktası değerlerine göre yorumlayın. Aşağıda verilen iki örneğe bakın.
- Enterobakteraller için bir siprofloksasin antibiyotik diski (5 μg) için bölge çapı kesme noktası (mm) S ≥ 25 ve R < 22'dir, yani ZOI 25 mm'≥ hassas (S) olarak kabul edilirken, ZOI 22 mm'< dirençli (R) olduğu anlamına gelir. ZOI çapı 22 ila 25 arasında düşerse, izolat ara (I) olarak kabul edilir.
- Staphylococcus spp. için bir kloramfenikol antibiyotik diski (30 μg) için bölge çapı kesme noktası (mm) S ≥ 18 ve R < 18'dir, yani ZOI 18 mm'≥ hassas olarak kabul edilirken, ZOI 18 mm'< dirençlidir.
- İzolatın dirençli olduğu antibiyotik sayısının izolatın maruz kaldığı toplam antibiyotik sayısına oranını bularak çoklu antibiyotik direnci (MAR) indeksini belirleyin.
NOT: Kalite kontrol için, E. coli ATCC 25922 ve S. Aureus ATCC 29213, adım 4'te olduğu gibi protokolü izleyen referans gerinimler olarak kullanılır.
- ZOI çapını milimetre (mm) cinsinden ölçün ve EUCAST11 tarafından verilen kesme noktası değerlerine göre yorumlayın. Aşağıda verilen iki örneğe bakın.
5. İzolatlardaki antibiyotik direnç genlerinin PCR tabanlı tespiti
- İzolatlardaki ARG'lerin tanımlanması için standart bir PCR protokolü kullanın. Adım 3.1'de verilen protokolü kullanarak DNA şablonunu hazırlayın.
NOT: Bu çalışmada kullanılan PCR döngü koşulları 10 dakika boyunca 94 ° C, ardından 30 s için 94 ° C'lik 35 döngü, uygun sıcaklıkta 30 s tavlama (her astar seti için standartlaştırıldığı gibi), 40 s için 72 ° C'de uzatma ve 5 dakika boyunca 72 ° C'de son bir uzatma idi. Reaksiyon karışımı Tablo 4'te açıklanmıştır. ARG'lerin, astarların ve tavlama sıcaklıklarının listesi Tablo 5'te verilmiştir. - Amplikonların saflığını çözümlemek, görselleştirmek ve kontrol etmek için 3.2.3-3.2.10 adımlarını izleyin.
6. Toplam bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve metagenomdaki ARG'lerin tespiti için tüm metagenomik DNA analizi
- Su örneğinden toplam DNA'nın (metagenom) ekstraksiyonu
- Metagenomik DNA'yı filtrelenmiş su örneklerinden çıkarın.
NOT: Mevcut çalışmada, metagenomik DNA (toplam DNA), üreticinin protokolünü takiben referans alınan DNA izolasyon kiti kullanılarak filtrelenmiş su örneklerinden ekstrakte edilmiştir ( bkz. - Ekstrakte edilen metagenomik DNA'nın 3 μL'sini % 0.8'lik bir agaroz jeline yükleyerek DNA'nın kalitesini kontrol edin ve jeli yaklaşık 30 dakika boyunca 80-110 V'ta çalıştırın.
- Tek bir sağlam bandın varlığını kontrol edin.
- DNA konsantrasyonunu bir florometre kullanarak kontrol edin.
- Metagenomik DNA'yı filtrelenmiş su örneklerinden çıkarın.
- Bakteriyel çeşitliliğin belirlenmesi ve tüm metagenomik DNA dizilimi kullanılarak ARG'lerin tespiti
- Kütüphane hazırlama ve PCR amplifikasyonu:
- Referans verilen DNA kütüphanesi hazırlık kitini kullanarak bir çift uçlu dizileme kütüphanesi hazırlayın ( bkz.
- DNA'yı 200 ng DNA alarak ve mekanik olarak daha küçük parçalara ayırarak adaptör ligasyonu için hazırlayın, ardından 3' uçlarına bir "A" eklendiği sürekli bir son onarım adımı izleyin.
- Dizileme için kullanılan platforma bağlı olarak, DNA parçalarının her iki ucuna da spesifik adaptörler bağlayın.
NOT: Çift barkodlu kütüphaneleri sıralama için bir akış hücresine bağlamak için çok önemli diziler bu bağdaştırıcılarda bulunur. Bu, adaptör bağlı parçaların PCR amplifikasyonuna ve standart sıralama astarlarının bağlanmasına izin verir. - Kaliteyi ve miktarı kontrol etmek için, üreticinin talimatlarına göre yüksek hassasiyetli bir DNA çipi kullanarak güçlendirilmiş kütüphaneyi analiz edin.
- Küme oluşturma ve sıralama:
- Yükseltilmiş kitaplığı, küme oluşturma ve sonraki sıralama için uygun sıralama platformuna yükleyin.
NOT: Kütüphane molekülleri, çift uçlu akış hücresi üzerindeki tamamlayıcı adaptör oligolarına bağlanır. Sıralama sırasında, ileri iplikçikler, ters ipliğin yeniden sentezinden sonra seçici olarak bölünür. Bu kopyalanan ters iplikçik daha sonra parçanın karşı ucundan sıralanır.
- Yükseltilmiş kitaplığı, küme oluşturma ve sonraki sıralama için uygun sıralama platformuna yükleyin.
- Biyoinformatik analiz:
- Uygun platformu kullanarak yüksek kaliteli verilerden iskeleler oluşturun.
- Bu iskeleleri, ARG'lerin taksonomik sınıflandırması ve tanımlanması için biyoinformatik analize tabi tutun.
NOT: Toplam bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve metagenomdaki ARG'lerin tespiti için tüm metagenomik DNA analizinin iş akışı Şekil 1'de verilmiştir. Makalede açıklanan metodolojinin tamamının bir akış şeması Şekil 2'de verilmiştir.
- Kütüphane hazırlama ve PCR amplifikasyonu:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toplam bakteri yükü ve antibiyotiğe dirençli (AR) bakteri sayısı
Toplam bakteri yükünün sayımı, su örneklerinin 10−4 ila 10−6 kat seyreltilmesinin R2A Agar, Modifiye ortam üzerine yayılmasıyla gerçekleştirildi. AR bakteri sayısının sayımı için, antibiyotik içeren ortam plakalarına 10−3 ila 10−6 kat seyreltme yayıldı (Şekil 3). Toplam ve AR bakteri sayıları CFU / mL olarak hesaplandı ve tüm kaplama deneyleri çift olarak gerçekleştirildi. Yukarıdaki protokolleri takiben, bu çalışma toplam bakteri sayısının 3.0 × 109 CFU / mL olduğunu göstermiştir. AR bakteri yükünün 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU/mL aralığında yüksek olduğu bulundu (Tablo 6).
16S rRNAgen dizilimi ile kültürlenebilir bakterilerin tanımlanması
Her izolattan elde edilen ham DNA, 16S rRNA genine özgü PCR'yi gerçekleştirmek için bir şablon olarak kullanıldı. Sıralanan toplam 15 AR izolatında, 10'u Enterobacteriaceae familyasına aitti ve çoğu Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae'dir. Comamonadaceae familyasına ait Comamonas spp., Micrococcus spp. ve Arthrobacter spp. gibi nadir fırsatçı bakteriler. Su örneğinden Micrococcaceae familyasına ait ve Aeromonadaceae familyasına ait Aeromonas spp. de tespit edilmiştir (Tablo 7).
Antibiyotik duyarlılık testi kullanılarak kültürlenebilir bakterilerde antibiyotik direncinin saptanması
Yukarıda tanımlanan izolatların antibiyotik direnç profili, disk difüzyon yöntemi kullanılarak AST yapılarak oluşturulmuştur (Şekil 4). Test edilen 15 izolattan 8'i, yüksek derecede direnç gösteren ≥0.2'lik bir MAR indeksine sahipti. Dahası, izolatların birçoğu ko-direnç profilleri (aynı antibiyotik setine direnç) gösterdi. Bununla birlikte, Comamonas spp. ve Arthrobacter spp. gibi izolatlar, test edilen antibiyotiklerin hiçbirine direnç göstermemiştir (Tablo 8).
Kültürlenebilir bakterilerde antibiyotik direnç genlerinin tespiti ve tanımlanması
PCR kullanılarak ARG'lerin varlığı için toplam 10 AR izolatı tarandı. Kültürlenebilir izolatlarda en yaygın ARG, β-laktamaz için blaTEM kodlaması ve bunu aminoglikozit direnç geni aadA izledi. Diğer güçlendirilmiş ARG'ler blaCTX-M, dfr1 ve aac (6')-Ib idi ve sırasıyla β-laktamlara, trimetoprimlere ve aminoglikozitlere direnç kazandırdı. ARG'lerin amplifikasyonunun temsili sonuçları Şekil 5'te gösterilmiştir. Tanımlanan izolatların çoğu için, fenotipik direnç (AST), PCR tabanlı genotipik AR profillemesi ile moleküler düzeyde doğrulandı.
Metagenomik DNA'daki toplam bakteri çeşitliliğinin tanımlanması
Tüm olası bakterilerin (hem kültürlenebilir hem de kültürlenemez) varlığını kontrol etmek ve göreceli bolluklarını tanımlamak için, toplam bakteri çeşitliliği için metagenomik bir DNA analizi yapılmıştır. Yüksek verimli yeni nesil dizileme (HT-NGS) yaklaşımı kullanılarak, toplam dizi okumalarının ~% 96,94'ü elde edildi ve bu da yüksek kapsama alanı sağladı. Okumaları filumdan cins seviyesine kadar farklı taksonomik gruplara ayırmak için taksonomik ek açıklama yapılmıştır (Şekil 6 ve Şekil 7). Metagenomda toplam 50 filum tanımlanabilir, bu da su örneğindeki yüksek bakteri çeşitliliğini gösterir. Proteobakteriler, Alfaproteobakteriler, Betaproteobakteriler ve Gamaproteobakteri sınıflarından oluşan en baskın filumdu. Düzen düzeyinde, Burkholderiales, Betaproteobacteria sınıfına ait en yaygın düzendi. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium ve Comamonas, su örneğinde bulunan bol cinslerden bazılarıydı.
Metagenomik DNA'dan ARG'lerin tespiti
Su örneğinin metagenomundaki toplam ARG havuzunu anlamak için, tüm metagenomik dizileme gerçekleştirildi ve ardından uygun biyoinformatik araçlar kullanılarak ARG'lerin tanımlanması yapıldı. Metagenomik yaklaşım, numunede hem kültürlenebilir hem de kültürlenemeyen mikroorganizmalarda bulunan ARG'lerin tespit edilmesini sağlar. β-laktamlara direnç kazandıran çeşitli genler (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); aminogylcosides (aac (6')-34); kinolonlar (qnrS6, qnrVC5); antibiyotik efflux pompaları-direnç-nodulasyon-hücre bölünmesi (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), ATP-bağlayıcı kaset (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) ve majör kolaylaştırıcı süper ailesi (MFS) (abaQ); trimetoprim dirençli dihidrofolat redüktaz (dfrD, dfrA20); rifampin fosfotransferaz (rphB); ve metagenomda kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) (catB10) saptandı. Kültürlenebilir izolatlarda (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) PCR ile tespit edilen ARG'ler de tüm metagenomik dizileme ile tespit edildi ve böylece su örneğindeki varlıkları doğrulandı. Tüm metagenomik DNA analizi kullanılarak metagenomda tanımlanan ARG'lerin temsili sonuçları Tablo 9'da verilmiştir.
Şekil 1: Tüm metagenomik DNA analizi için iş akışı. Toplam bakteri çeşitliliğinin tanımlanması ve metagenomdan ARG'lerin tespiti için kademeli iş akışı sunulmaktadır. Genel adımlar metagenomik DNA hazırlama, amplifikasyon ve tanımlamayı içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tüm metodolojinin akış şeması. Bu çalışmada kullanılan metodolojinin kademeli iş akışı. Hem kültür bazlı hem de kültür bazlı olmayan tekniklerin bir kombinasyonu, bakteri çeşitliliği ve su örneğinde bulunan ARG'lerin kimliği hakkında tam bilgi edinmek için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Antibiyotik içeren R2A Agar, Modifiye plakalar üzerindeki izole kolonilerin temsili görüntüleri. Sefotaksim (3 μg / mL) üzerine kaplanmış su örnekleri - R2A Agar, Modifiye plakalar. Numune seri olarak seyreltildi ve kopya-A1, A2: 10−4 olarak kaplandı; B1, B2: 10−5; C1, C2: 10−6. Uygun kuluçka döneminden sonra, izole koloniler B1, B2, C1 ve C2 plakalarında görülebildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Disk difüzyon yöntemi ile antibiyotik duyarlılık testi. Bir Escherichia coli izolatı için disk difüzyon yöntemi ile AST'nin temsili görüntüleri. AST, yinelenen A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. ZOI'lerin çapları milimetre (mm) cinsinden ölçüldü. İzolatın kullanılan antibiyotiğe dirençli veya duyarlı olup olmadığını yorumlamak için, ZOI en son EUCAST tablolarıyla karşılaştırıldı. Kısaltmalar: AST = antibiyotik duyarlılık testi; CTX = sefotaksim; IPM = imipenem; C = kloramfenikol; CIP = siprofloksasin; LE = levofloksasin; TGC = tigecycline; AMP = ampisilin; GEN = gentamisin; TR = trimetoprim; N = neomisin; K = kanamisin; TO = seftriakson; ZOI = inhibisyon bölgesi; EUCAST = Avrupa Antibiyotik Duyarlılık Testi Komitesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kültürlenebilir bakterilerden antibiyotik dirençli genlerin PCR amplifikasyonu. PCR sonrası agaroz jel elektroforezi, izolatlarda ARG'lerin varlığını kontrol etmek için güçlendirilmiş bantların görselleştirilmesi için gerçekleştirildi. Jel üzerinde ayrılmış PCR amplicon bantları görülebilir. Bireysel PCR amplikonlarının boyutu uygun bir DNA belirteci ile karşılaştırılır. Şerit L1: 100 bp DNA merdiveni; Şeritler 1-5: 1: dfr1 (425 bp); Şerit 2: blaTEM (310 bp); Şerit 3: blaCTX-M (500 bp); Şerit 4: aac(6')-Ib ( 395 bp); Şerit 5: aadA (624 bp). Kısaltma: ARGs = antibiyotiğe dirençli genler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Filum ve sınıf seviyeleri için taksonomik sınıflandırma. (A) Su örneğindeki bakteriyel metagenomun filum düzeyinde taksonomik bolluk dağılımını gösteren çubuk grafik. Metagenomik analiz ile toplam 50 bakteriyel filum tanımlandı. Bakterilerin ilk 12 baskın filumu gösterilmiştir. (B) Su örneğindeki bakteriyel metagenomun sınıf düzeyinde taksonomik bolluk dağılımını gösteren çubuk grafik. Metagenomik analiz ile toplam 50 bakteri sınıfı tanımlanmıştır. İlk 15 baskın bakteri sınıfı gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Düzen ve cins seviyeleri için taksonomik sınıflandırma. (A) Su örneğindeki bakteriyel metagenomun sıra-seviye taksonomik bolluk dağılımını gösteren çubuk grafik. Metagenomik analiz ile toplam 50 bakteri sırası tanımlandı. Bakterilerin ilk 14 baskın sırası şekilde gösterilmiştir. (B) Su örneğindeki bakteriyel metagenomun cins düzeyinde taksonomik bolluk dağılımını gösteren çubuk grafik. Metagenomik analiz ile toplam 50 bakteri cinsi tanımlanmıştır. Gösterilen bakterilerin ilk 15 baskın cinsi şekilde gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| PCR reaktifleri | Ses seviyesi (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 20 |
| İleri astar (10 piko köstebek) | 1.5 |
| Ters astar (10 piko köstebek) | 1.5 |
| Ham DNA şablonu | 1.5 |
| Steril moleküler biyoloji suyu | 15.5 |
| Toplam hacim | 40 |
Tablo 1: PCR mastermix bileşenleri. Çeşitli PCR reaktiflerinin reaksiyon karışımı bileşimi.
| Yön | Astar Dizisi 5' – 3' | PCR koşulları | Döngü sayısı |
| İletmek | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 10 dk için 94 °C | 1 |
| 30 s için 94 °C'de denatürasyon | 35 | ||
| 30 s için 50 °C'de tavlama | |||
| 40 s için 72 °C'de uzatma | |||
| Ters | CTACCGGGGTATCTAATCC | 5 dakika boyunca 72 °C'de son uzatma | 1 |
Tablo 2: 16S rRNA geninin amplifikasyonu için PCR döngüsü koşulları. 16S rRNA gen amplifikasyonu için gerekli PCR döngüsü koşulları gösterilmiştir. Adımlar arasında ilk denatürasyon adımı, ardından 35 döngü denatürasyon, tavlama ve uzatma ve son bir uzatma adımı bulunur.
| 6x yükleme jeli | |
| Içeriği | Miktar |
| Bromofenol mavisi | 25 mg |
| %85 Gliserol | 7,06 mL |
| Milli-Q su | 2,94 milyon L |
| Toplam hacim | 10 mL |
| 50x Tris-asetat-EDTA (TAE) stok tampon bileşimi | |
| Içeriği | Miktar |
| Tris tabanı | 700 mL çift damıtılmış suda 242 g |
| Buzul Asetik Asit (GAA) | 57,1 milyon L |
| 0,5 M (EDTA) pH 8,0 | 100 mL |
| PH'ı 8,5'e ayarlayın ve çift damıtılmış su ile hacmi 1000 mL'ye kadar ayarlayın | |
| 1x TAE için: 20 mL 50x TAE tamponu + 980 mL çift damıtılmış su | |
Tablo 3: 6x jel yükleme tamponunun ve 50x Tris-asetat-EDTA stok tamponunun bileşimi. 6x jel yükleme tamponu, agaroz jel elektroforezi üzerinde çalıştırılacak numune ile karıştırılır. İzleme boyası olarak bromofenol mavisi içerir. Gliserol, kuyucuklara doğru yükleme için yüklenen numunenin yoğunluğunu arttırır. 50xTAE stok tamponunun hazırlanması için gerekli çeşitli reaktiflerin bileşimi de gösterilmiştir. TAE tamponu, AGE için kullanılan en yaygın tamponlardan biridir ve pH'ı 8.5'te tutar ve AGE sırasında güçlendirilmiş DNA'nın göçünü sağlar. Kısaltmalar: TAE = Tris-asetat-EDTA; AGE = agaroz jel elektroforezi.
| PCR reaktifleri | Ses seviyesi (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 5 |
| İleri astar (10 piko köstebek) | 0.5 |
| Ters astar (10 piko köstebek) | 0.5 |
| Ham DNA şablonu | 1.5 |
| Steril moleküler biyoloji sınıfı su | 2.5 |
| Toplam hacim | 10 |
Tablo 4: ARG'lerin tanımlanması için PCR mastermix bileşimi. PCR deneyini gerçekleştirmek için gerekli olan çeşitli PCR reaktiflerinin reaksiyon karışımı bileşimi.
| Sr. Hayır. | Hedef gen | Direnç | Astar | Astar dizisi (5'-3') | Amplikon boyutu (bp) | Tavlama sıcaklığı (°C) | Başvuru | ||||
| 1 | cesaret A | Trimetoprim | İletmek | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz ve ark., 19 | ||||
| Ters | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β – laktamlar | İletmek | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | Gebreyes, Thakur20 | ||||
| Ters | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – laktamlar | İletmek | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | Li ve ark. 21 | ||||
| Ters | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | Aminoglikozitler | İletmek | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers ve ark. 22 | ||||
| Ters | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | aad A | Aminoglikozitler | İletmek | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | Ciesielczuk 23 | ||||
| Ters | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
Tablo 5: Kültürlenebilir bakterilerde ARG'lerin PCR'si için primerler. Bu çalışmada kullanılan farklı ARG'ler, ilgili primer dizileri ile birlikte gösterilmiştir. Amplicon'un beklenen boyutu baz çiftleri halinde verilir. Her astar setinin tavlama sıcaklığından da bahsedilir.
| Antibiyotik | Antibiyotik konsantrasyonu (μg/mL) | CFU/mL |
| - | - | 3,0 x 109 |
| cesaret | 3 | 4,5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3,2 x 108 |
| K | 15 | 9,6 x 105 |
| E | 20 | 1,6 x 108 |
| VA | 3 | 1,2 x 109 |
Tablo 6: Toplam ve antibiyotiğe dirençli bakteri sayımları. Antibiyotiğe dirençli bakterilerin su örneğinden ilk izolasyonu için beş antibiyotik kullanıldı. Toplam bakteri sayıları (antibiyotiksiz) ve AR bakteri sayımları, mililitre başına koloni oluşturan birimler (CFU / mL) cinsinden sunulmaktadır. Kısaltmalar: AR = antibiyotiğe dayanıklı; CFU = koloni oluşturan birimler; CTX = sefotaksim; CIP = siprofloksasin; K = kanamisin; E = eritromisin; VA = vankomisin.
| Kodu izole et | Mikroorganizma -lar | Aile |
| 1 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 2 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 3 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 4 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 5 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 6 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | Micrococcus spp. | Mikrokokaceae |
| 14 | Arthrobacter spp. | Mikrokokaceae |
| 15 | Aeromonas spp. | Aeromonadaceae |
Tablo 7: Antibiyotiğe dirençli izolatların 16S rRNA gen dizilimi ile tanımlanması. Her izolatta koloni PCR'si 16S rRNA genine özgü primerler kullanılarak yapıldı. Elde edilen amplikler daha sonra uygun biyoinformatik araçlar kullanılarak sıralandı ve tanımlandı.
| İzole No. | Ayırmak | cesaret | AMP | LE | C | TGC | TO | IPM | GEN | N | TR | CIP | MART | MAR endeksi | ||
| 1 | Escherichia coli | 13R | 0R | 0R | 28S | 23S | 11R | 39S | 20'LER | 18S | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia coli | 31S | 0R | 12R | 29S | 23S | 32S | 37S | 19S | 16S | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia coli | 14R | 0R | 14R | 14R | 21S | 10R | 34S | 17S | 11R | 24S | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia coli | 28S | 13R | 18R | 26S | 21S | 28S | 32S | 16R | 11R | 24S | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia coli | 11R | 0R | 12R | 26S | 21S | 10R | 31S | 17S | 16S | 22S | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia coli | 27S | 0R | 12R | 12R | 22S | 30'LAR | 32S | 19S | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28S | 0R | 17R | 27S | 22S | 30'LAR | 32S | 18S | 22S | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 11R | 26S | 24S | 22S | 30'LAR | 28S | 17S | 16S | 24S | 23S | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 13R | 25S | 24S | 22S | 28S | 29S | 18S | 17S | 24S | 25S | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33Saniye | 14S | 26S | 28S | 22S | 31S | 32S | 19S | 20'LER | 24S | 29S | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23S | - | - | 37S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27S | - | - | 42S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25S | 17R | 24S | 32S | 22S | 34S | 28S | 20'LER | - | 21S | 26S | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Arthrobacter spp. | 45S | 57S | 28S | 26S | 34S | 27S | 39S | 26S | - | 28S | 28S | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
Tablo 8: AST ile analiz edilen bakteriyel izolatların antibiyotik direnci fenotipi. İzolatlardaki fenotipik direnç disk difüzyon yöntemi kullanılarak analiz edildi. Sayılar ZOI'yi milimetre (mm) cinsinden gösterir. MAR indeksi için, sayılar bir izolatın dirençli olduğu toplam antibiyotik sayısını gösterir. Kısaltmalar: AST = antibiyotik duyarlılık testi; CTX = sefotaksim; AMP = ampisilin; LE = levofloksasin; C = kloramfenikol; TGC = tigecycline; TO = seftriakson; IPM = imipenem; GEN = gentamisin; N = neomisin; TR = trimetoprim; CIP = siprofloksasin; R = dayanıklı; S = hassas; MAR = çoklu antibiyotik direnci; ZOI = inhibisyon bölgesi.
| AMR GEN AİLESİ | GEN(ler) |
| SMB beta-laktamaz | KOBİ-1 |
| ampC tipi beta-laktamaz | ampC1 |
| VIM beta-laktamaz | VIM-20 Serisi |
| CcrA beta-laktamaz | ccrA |
| NmcA beta-laktamaz | nmcR |
| ARL Beta-laktamaz | ARL-1 |
| blaZ beta-laktamaz | blaZ |
| blaTEM beta-laktamaz | blaTEM* |
| blaCTX beta-laktamaz | blaCTX |
| AAC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| KARınca (3'') | aadA |
| kinolon direnç proteini (qnr) | qnrS6, qnrVC5 |
| direnç-nodulasyon-hücre bölünmesi (RND) antibiyotik efflux pompası | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| ATP bağlayıcı kaset (ABC) antibiyotik efflux pompa | oleC, macB, patA, bcrA |
| majör kolaylaştırıcı süper aile (MFS) antibiyotik efflux pompası | abaQ |
| trimetoprim dirençli dihidrofolat redüktaz dfr | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| rifampin fosfotransferaz | rphB |
| undekaprenil pirofosfat ile ilişkili proteinler | cesaret |
| metisilin dirençli PBP2 | mecD |
| vanJ membran proteini | vanJ |
| tetrasiklin dirençli ribozomal koruma proteini | tetT |
| kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) | kediB10 |
| Erm 23S ribozomal RNA metiltransferaz | erm(37) |
| glikopeptid direnç gen kümesi | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR fosfoetanolamin transferaz | mcr-9 |
| sülfonamide dayanıklı sul | sul3 |
| *Kültürlenebilir mikroorganizmalarda altı çizili genler de tespit edilmiştir | |
Tablo 9: Tüm metagenomik DNA analizi kullanılarak tanımlanan ARG'ler. Su örneğinin toplam metagenomu tüm metagenomik dizileme için kullanıldı ve elde edilen diziler uygun ARG veritabanı kullanılarak açıklandı. Metagenomik DNA'da tanımlanan bazı önemli ARG'lerin temsili sonuçları gösterilmiştir. Altı çizili genler kültürlenebilir mikroorganizmalarda da tespit edildi. Kısaltma: ARG = antibiyotiğe dirençli gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Örneklem toplama ve işleme önemli bir rol oynar ve çalışmanın sonuçlarını ve yorumlanmasını etkileyebilir. Bu nedenle, numunelerdeki değişkenliği dışlamak için, incelenen tatlı su kütlesinin birden fazla yerinde örnekleme yapmak önemlidir. Bu tür numuneleri işlerken uygun aseptik çevre koşullarının korunması, kontaminasyonu önleyebilir. Ayrıca, ekstrakte edilen nükleik asitlerin kalitesini ve miktarını etkileyebilecek bakteri bileşimindeki değişiklikleri önlemek için, transit koşulları, numune toplama noktasından sonraki işleme kadar minimum zaman atlaması ile 4 ° C'de tutulmalıdır. Birçok çalışma, numune toplama ve işleme arasındaki bu ara dönemin, dikkatli bir şekilde yapılmadığı takdirde analizin sonraki aşamalarında değişken sonuçlar verebileceğini vurgulamıştır12,13.
Kaplama için bir dizi seyreltme kullanmak, kolonilerin ne bir araya toplanmamasını ne de sayılamayacak kadar az koloni olmasını sağlar. Deneylerin çift olarak yapılması, pipetleme/taşıma hataları nedeniyle ortaya çıkabilecek CFU/mL'deki değişimleri hesaba katmak için gereklidir. Ayrıca, kullanılan antibiyotiklerin etkili bir şekilde çalıştığından ve yanlış pozitif sonuçların ortadan kaldırıldığından emin olmak için her deney için kontrol plakaları tutulur. Bu nedenle, kontrol plakaları görünür koloni büyümesine sahip olmamalıdır. Bu, kullanılan antibiyotiklerin etkinliğini gösterir.
AST sırasında, inokulum kültürü yoğunluğu ve agar plakasının kalınlığı, ZOI'nin çapını ve dolayısıyla sonuçların yorumlanmasını etkileyebilir. Bu nedenle, AST deneylerini gerçekleştirirken bu iki faktörün tek tip tutulmasına özen gösterilmelidir. En kritik husus, inokulumda bulunan bakteri hücrelerinin sayısıdır. Genel olarak, 1 × 10 8-2 × 108 CFU / mL hücre inokülum olarak kullanılır, bu da 0.5 McFarland standardı14'e eşittir. Sonuçlarda herhangi bir değişiklik olmaması için inokulumun bu konsantrasyonu sabit tutulmalıdır. Gerekli konsantrasyondan daha yüksek veya daha düşük herhangi bir konsantrasyon, steril salin yardımıyla seyreltilmeli ve 15 dakika içinde aşılama için hemen kullanılmalıdır. İnokulumu agar plakalarına yayarken, aşırı miktarda inokülümden kaçınmak için özen gösterilmelidir. Aşırı inokülum, MHA plakasına aşılamadan önce bakteriyel süspansiyon tüpünün yanlarındaki çubukla bastırılarak çıkarılabilir. Standart AST prosedüründen herhangi bir sapma, bu tür protokollerden elde edilen verileri önemli ölçüde etkileyebilir11,15. Önceki bir çalışma, ≥0.2'lik bir MAR indeks değerinin,izolatlar 16'da yüksek direnci gösterdiğini göstermiştir. AST'nin sonuçlarının yorumlanması ZOI'ye dayandığından, kültürün az aşılamasından veya aşırı aşılamasından kaçınılmalıdır.
PCR için, bileşenlerin bozulma olasılığını ve enzimin aktivitesini kaybetme olasılığını en aza indirmek için mastermix bir buz bloğu üzerinde hazırlanmalıdır. Reaksiyonu ayarlarken eldiven giymek dış kontaminasyon olasılığını en aza indirir17. AGE sırasındaki voltaj çok yüksek olmamalıdır, çünkü bu, yüklü numunelerin ısınma etkisine ve bozulmasına neden olabilir. AGE'nin optimum voltajda gerçekleştirilmesi, bantların iyi ayrılmasını ve herhangi bir sürükleme veya lekelenme etkisi olmadan keskin olmasını sağlar.
Son birkaç on yılda yapılan çalışmalar, farklı mikroorganizmaların tanımlanması için 16S rRNA gen amplikon diziliminin kullanıldığını göstermiştir. 16S rRNA gen dizilimi için, şablon DNA'nın ekstraksiyonu için yöntem seçimi, aşağı akış analizini etkileyebilecek önyargılara neden olabilir. Gram-pozitif bakteriler, nükleik asidin çıkarılmasını zorlaştırabilecek kalın bir peptidoglikan hücre duvarına sahiptir. Bu nedenle, ekstraksiyon yönteminin seçimi, tüm mikrobiyal DNA türlerini etkili bir şekilde yakalayacak şekilde olmalıdır. Ham şablon DNA'yı çıkarmak için geleneksel kaynatma yöntemi, hücrenin içeriğini çıkarmak için böyle etkili bir yöntemdir, böylece sonuçlardaki önyargıları azaltır.
Bu çalışmada, su kütlesinin tüm bakteri topluluğunu anlamak için, yüksek verimli yeni nesil dizileme (HT-NGS) tekniği kullanılmıştır. Tüm metagenomik DNA analizi, belirli bir numunenin tüm metagenomunun incelenmesine izin verir. Kültür bazlı teknikler esas olarak bir numunenin mikrobiyolojik kalitesini gösteren bakteriyel yükün aerobik bir sayımını verir. Ancak kültürlenebilir mikroorganizmalar toplam mikroorganizmaların sadece %1'ini oluşturmaktadır. Anaeroblar da dahil olmak üzere çeşitli türlerden oluşan kalan mikroflora, zayıf bir şekilde karakterize edilir ve genellikle göz ardı edilir. Bu mikroorganizmalar AR özellikleri taşıyabilir. Ayrıca, komensal mikroorganizmalar, çeşitli genetik değişim olayları yoluyla patojenlere bulaşabilen AR genlerinin bir rezervuarıdır18. Bu kommensallerin çoğu kültürlenemez ve HT-NGS'yi içeren metagenomik bir yaklaşımla incelenebilir ve herhangi bir numunede çeşitli mikrofloranın tanımlanması için daha geniş bir kapsama alanı sağlar. Metagenomik analiz kullanılarak, kültürlenebilir verileri tamamlayan bakteriyel taksonların ayrıntılı bir profili elde edildi. Dahası, bu tür tamamlayıcı yaklaşımlar, incelenen su kütlesinin genel AR durumu hakkında bir fikir verebilir.
Bu çalışmada, hem geleneksel kültür temelli hem de kültür temelli olmayan metagenomik tekniklerin bir kombinasyonunu kullanarak, toplam bakteri çeşitliliğini, farklı antibiyotiğe dirençli bakterileri ve toplam su kaynaklı ARG havuzunu tanımlayabildik. Bu çalışmada açıklanan metodoloji, diğer herhangi bir su kaynağındaki AR patojenlerinin tanımlanması için çoğaltılabilir ve özelleştirilebilir - kıyı suyu, doğal su ve insan yapımı içme suyu. Ayrıca, su kaynaklı hastane patojenlerinin bulaşmasını izlemek ve hastane ve klinik ortamlarında hastane ile ilişkili enfeksiyonları lavabolar, tuvaletler, küvetler ve nemlendiriciler gibi su kaynakları aracılığıyla izlemek için de kullanılabilir. Bu, AMR'nin gözetiminde ve su bazlı AMR sıcak noktalarının tanımlanmasında yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek çatışan çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Mumbai Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Bölümü-Üniversite Araştırma ve Bilimsel Mükemmellik Teşvik (DST-PURSE) Programından mali hibelerle desteklenmiştir. Devika Ghadigaonkar, program kapsamında Proje Üyesi olarak çalıştı. Bilim ve Teknoloji Bölümü-Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (DST-SERB) Proje no: CRG/2018/003624 kapsamında Kıdemli Araştırma Görevlisi Harshali Shinde tarafından sağlanan teknik yardım kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).
