Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til isolering og identifikation af antibiotikaresistente bakterier fra vand og molekylær karakterisering af deres antibiotikaresistensgener (ARG'er). Brugen af kulturbaserede og ikke-kulturbaserede (metagenomiske analyser) teknikker giver fuldstændig information om den samlede bakterielle mangfoldighed og den samlede pulje af forskellige ARG'er, der findes i ferskvand fra Mumbai, Indien.
Abstract
Udviklingen og spredningen af antibiotikaresistens (AR) gennem mikrobiota forbundet med ferskvandsområder er et stort globalt sundhedsproblem. I denne undersøgelse blev ferskvandsprøver indsamlet og analyseret med hensyn til den samlede bakterielle mangfoldighed og AR-gener (ARG'er) ved hjælp af både konventionelle kulturbaserede teknikker og en kulturuafhængig metagenomisk tilgang med høj kapacitet. Dette papir præsenterer en systematisk protokol til tælling af de samlede og antibiotikaresistente dyrkelige bakterier fra ferskvandsprøver og bestemmelse af fænotypisk og genotypisk resistens i de dyrkelige isolater. Desuden rapporterer vi brugen af hel metagenomisk analyse af det samlede metagenomiske DNA ekstraheret fra ferskvandsprøven til identifikation af den samlede bakterielle mangfoldighed, herunder ikke-dyrkelige bakterier, og identifikation af den samlede pulje af forskellige ARG'er (resistome) i vandlegemet. Efter disse detaljerede protokoller observerede vi en høj antibiotikaresistent bakteriebelastning i området 9,6 × 10 5-1,2 × 10 9 CFU / ml. De fleste isolater var resistente over for de mange testede antibiotika, herunder cefotaxim, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxon, gentamicin, neomycin, trimethoprim og ciprofloxacin, med multiple antibiotikaresistensindekser (MAR) på ≥0,2, hvilket indikerer høje resistensniveauer i isolaterne. 16S rRNA-sekventeringen identificerede potentielle humane patogener, såsom Klebsiella pneumoniae, og opportunistiske bakterier, såsom Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. og Aeromonas spp. Den molekylære karakterisering af isolaterne viste tilstedeværelsen af forskellige ARG'er, såsom blaTEM, blaCTX-M (β-lactamer), aadA, aac (6')-Ib (aminoglycosider) og dfr1 (trimethoprims), hvilket også blev bekræftet af hele metagenomisk DNA-analyse. En høj forekomst af andre ARG'er, der koder for antibiotikaudstrømningspumper-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamaser-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, chloramphenicolacetyltransferase-genet catB10 og rifampicinresistensgenet rphB-blev også påvist i det metagenomiske DNA. Ved hjælp af protokollerne diskuteret i denne undersøgelse bekræftede vi tilstedeværelsen af vandbårne MAR-bakterier med forskellige AR-fænotypiske og genotypiske træk. Således kan hel metagenomisk DNA-analyse bruges som en komplementær teknik til konventionelle kulturbaserede teknikker til at bestemme den samlede AR-status for et vandlegeme.
Introduction
Antimikrobiel resistens (AMR) er blevet identificeret som et af de mest presserende globale problemer. Den hurtige udvikling af antimikrobiel resistens og dens verdensomspændende udbredelse er en af de største trusler mod menneskers sundhed og den globale økonomi med hensyn til de sundhedsomkostninger, der er forbundet hermed1. Overforbrug og misbrug af antibiotika har ført til en stigning i AR. Dette er blevet fremhævet af COVID-19-pandemien, hvor behandlingen af tilknyttede sekundære infektioner i mange tilfælde blev enormt kompromitteret på grund af AMR hos de berørte patienter2. Ud over menneskers direkte brug/misbrug af antibiotika giver overforbrug og misbrug af antibiotika i landbrug og husdyrhold og deres uhensigtsmæssige udledning i miljøet, herunder vandområder, anledning til stor bekymring3. Stigningen i nye resistensegenskaber og multiresistens i bakterier understreger presserende behovet for en bedre forståelse af de faktorer, der fører til udviklingen af AR og dens udbredelse. Flere antibiotikaresistente bakterier, som ofte bærer flere AR-gener (ARG'er) på mobile genetiske elementer såsom plasmider, kan overføre disse resistensgener til ikke-resistente mikroorganismer, herunder potentielle humane patogener, hvilket fører til fremkomsten af superbugs, der ikke kan behandles med selv antibiotika i sidste udvej4. Disse flere antibiotikaresistente bakterier, hvis de findes i vandøkosystemer, kan direkte komme ind i den menneskelige tarm via forbruget af forurenede vandbaserede fødevarer som fisk, krabber og bløddyr. Tidligere undersøgelser har vist, at spredningen af AR-bakterier i naturligt forekommende vandsystemer også kan nå andre vandforsyninger, herunder drikkevand, og dermed kan komme ind i den menneskelige fødekæde 5,6,7.
Formålet med denne undersøgelse er at tilvejebringe en omfattende protokol ved hjælp af en kombination af kulturbaserede og ikke-kulturbaserede (hele metagenomiske analyser) teknikker til at opnå fuldstændig information om den samlede bakterielle mangfoldighed og den samlede pulje af forskellige ARG'er, der findes i et vandområde i Mumbai, Indien. Konventionelt er kulturbaserede teknikker blevet brugt til at studere bakteriel mangfoldighed i vandområder. Da dyrkelige mikroorganismer kun udgør en lille procentdel af den samlede mikrobiota i enhver niche, skal forskellige kulturbaserede og kulturuafhængige teknikker anvendes sammen for at få en bedre forståelse af den overordnede status for bakteriel mangfoldighed og de forskellige resistente træk, der er fremherskende i enhver prøve. En sådan robust og pålidelig kulturuafhængig teknik er hel metagenomisk DNA-analyse. Denne high-throughput metode er blevet anvendt med succes i forskellige undersøgelser af bakteriel mangfoldighed eller de funktionelle annoteringer af forskellige ARGs 8,9. Denne teknik bruger metagenomet (det samlede genetiske materiale i en prøve) som udgangsmateriale til forskellige analyser og er derfor dyrkningsuafhængig. Protokollerne i denne undersøgelse kan bruges til hel metagenomisk DNA-analyse for at få information om den samlede bakterielle mangfoldighed og forskellige ARG'er (resistomer) i vandprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Indsamling og behandling af prøver
- Prøveindsamling
- Vandprøven opsamles i sterile prøvebeholdere, idet det sikres, at højst 3/4 af beholderen er fyldt.
- Transporter prøverne til laboratoriet under aseptiske forhold så hurtigt som muligt efter indsamlingen og behandl dem straks.
- Behandling af prøver
- Vandprøven filtreres aseptisk gennem en steril musselinklud for at fjerne eventuelle partikler.
- Der udføres passende seriefortyndinger af det filtrerede vand til yderligere analyse.
2. Estimering af den samlede bakteriebelastning og antallet af antibiotikaresistente bakterier
- Bestemmelse af den samlede bakteriebelastning
- 18,12 g R2A agar, modificeret pulver suspenderes i 1.000 ml dobbeltdestilleret vand, og blandingen opløses ved opvarmning. Den opløste blanding autoklaveres ved 121 °C, 15 psi i 20 min. R2A agar fremstilles modificerede plader ved at hælde den passende mængde af den autoklaverede blanding i sterile petriplader (der tilsættes f.eks. ca. 20 ml autoklaveret sterilt medium til en 90 mm steril petriplade).
- 100 μL af de passende fortyndinger af den filtrerede vandprøve fordeles jævnt på R2A-agaren, modificeret plade, når substratet størkner. Udfør eksperimentet i to eksemplarer.
- Alle ovennævnte plader inkuberes ved 35-37 °C i 48 timer (temperaturen og inkubationstiden varierer afhængigt af det medie, der anvendes til isolering).
- Den samlede bakteriebelastning udtrykkes i form af kolonidannende enheder pr. milliliter (CFU/ml) ved hjælp af ligning (1):
(1)
- Bestemmelse af AR-bakterietallet
- Følg trin 2.1.1-2.1.4. I stedet for R2A Agar, modificerede plader, skal du dog bruge R2A Agar, modificerede plader suppleret individuelt med fem forskellige antibiotika, nemlig cefotaxim (3 μg / ml), ciprofloxacin (0,5 μg / ml), erythromycin (20 μg / ml), kanamycin (15 μg / ml) og vancomycin (3 μg / ml).
- Antibiotika tilsættes separat i reagensglas indeholdende 20 ml sterilt smeltet R2A-agar, modificeret (med temperaturen af den smeltede R2A-agar, modificeret ved ≤40 °C) for at opnå den endelige antibiotikakoncentration som nævnt i trin 2.2.1.
- Hvirvl for jævn blanding og hæld på sterile petriplader, før agaren størkner. Udfør eksperimentet i to eksemplarer.
- Alle ovennævnte plader inkuberes ved 35-37 °C i 48 timer (hvis der anvendes et andet medie, kan temperaturen og inkubationstiden variere).
- Til kvalitetskontrol og kontrol af antibiotikas effektivitet spredes 100 μL bakteriesuspensioner af stammerne Escherichia coli ATCC 25922 og Staphylococcus aureus ATCC 29213 på deres respektive antibiotikaholdige R2A agar, modificerede plader (sørg for, at densiteten af den friske kultur, der anvendes til podningen, er OD = 0,5 ved 600 nm).
- Det antibiotikaresistente bakterietal bestemmes i CFU/ml som beskrevet i trin 2.1.4.
- Glycerollagre af isolaterne
- Vælg morfologisk forskellige AR-kolonier.
- Suspender en enkelt isoleret koloni i 2 ml steril Luria-Bertani bouillon indeholdende det respektive antibiotikum (hvis en koloni f.eks. blev valgt fra en plade indeholdende cefotaxim, podes kolonien fra trin 2.3.1 i steril Luria-Bertani bouillon indeholdende cefotaxim i dens respektive koncentration).
- De podede rør inkuberes ved 37 °C ved 80 o/min, indtil OD600 når 0,5.
- Der fremstilles glycerollagre af isolaterne ved at blande 750 μl af dyrkningssuspensionen fra trin 2.3.3 i 250 μliter steril 100 % glycerol under aseptiske forhold.
- Glycerollagrene opbevares ved -80 °C indtil yderligere analyse.
BEMÆRK: For at genoplive kulturerne fra glycerollagrene optøs glycerollagrene ved 4 °C. Inokuler en løkkefuld af denne bestand i 2 ml steril Luria-Bertani bouillon indeholdende det respektive antibiotikum og lad det vokse.
(1)3. Identifikation af dyrkelige bakterier ved 16S rRNA-gensekventering
- Udarbejdelse af DNA-skabelon fra isolaterne til PCR
BEMÆRK: Den beskrevne protokol til fremstilling af DNA-skabelon til PCR til isolering af råt DNA fra bakterierne er givet af Carlson et al.10.- Brug et sterilt tandstikker til at tage en enkelt, isoleret, ren koloni af isolatet, der vokser på en petriplade. Bakteriekolonien suspenderes i 100 μL sterilt dobbeltdestilleret vand i et sterilt mikrocentrifugerør og koges i 10 min.
- Suspensionen centrifugeres ved 10.000 × g i 2 minutter for at pelletere resterne, og supernatanten overføres til et friskt, sterilt mikrocentrifugeglas til brug som rå DNA-skabelon.
- Målrettet PCR-amplifikation af V3-regionen af 16S rRNA-genet og sekventering
- Der fremstilles 40 μL af reaktionsblandingen i et PCR-rør til PCR-amplifikation som nævnt i tabel 1.
BEMÆRK: DNA-præparatet skal udføres på en isblok, samtidig med at risikoen for kontaminering minimeres (brug handsker, mens du håndterer reagenserne, og rengør arbejdsfladen grundigt med 70% ethanol). - Placer røret i den termiske blok, og kør det relevante program i PCR termisk cyklist. Se tabel 2 for de standardiserede PCR-cyklusbetingelser og primerinformationen for amplifikation af V3-regionerne i 16S rRNA-generne.
- For at løse amplicons og visualisering skal du udføre agarosegelelektroforese (AGE). Der blandes 10 μL af det amplificerede PCR-produkt og 2 μL 6x gelpåfyldningsbuffer (tabel 3), og denne blanding fyldes i hullerne med 1,5 % agarosegel (1,5 g agarosepulver opløses i 100 ml 1x TAE-buffer [tabel 3]) indeholdende 5 μL 10 mg/ml ethidiumbromid (EtBr) til en slutkoncentration på 0,5 μg/ml EtBr i 100 ml agarosegel.
FORSIGTIG: EtBr er et potent kræftfremkaldende stof. Handsker skal altid bæres under håndtering af EtBr og geler, der indeholder EtBr. - Tilføj DNA-stige til estimering af ampullernes størrelse.
- Udfør elektroforese af gelen i en TAE-tankbuffer ved 80-100 V.
- Når sporingsfarvestoffet kører 3/4 af gelen, skal du stoppe elektroforesen og visualisere amplikonbåndene under en UV-transilluminator.
- Brug PCR-produktet (amplicon) til 16S rRNA-gensekventering til at identificere isolatet.
- Kvantificer amplicon ved at udsætte den for spektrofotometrisk analyse ved hjælp af ligning (2).
(2) - For at kontrollere renheden af DNA'et beregnes forholdet mellem A260 og A280.
BEMÆRK: Ideelt set bør dette tal være over 1,5 og helst mellem 1,8 og 2,0. - For at identificere isolaterne skal du sammenligne de sekvenser, der opnås, med sekvensdatabaser ved hjælp af et passende justeringssøgeværktøj.
- Der fremstilles 40 μL af reaktionsblandingen i et PCR-rør til PCR-amplifikation som nævnt i tabel 1.
(2)4. Påvisning af antibiotikaresistens i isolaterne ved hjælp af antibiotikafølsomhedstest
BEMÆRK: Denne protokol beskriver metoden til test af antibiotikafølsomhed (AST) ved diskdiffusion. Følgende antibiotikaskiver blev anvendt: cefotaxim (5 μg), ampicillin (10 μg), levofloxacin (5 μg), chloramphenicol (30 μg), tigecyclin (15 μg), ceftriaxon (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicin (10 μg), neomycin (10 μg), trimethoprim (5 μg) og ciprofloxacin (5 μg).
- Forberedelse af podningen til AST
- Aseptisk podes en enkelt, isoleret, renset AR-koloni ved hjælp af en steril sløjfe i 2 ml af et sterilt ikke-selektivt medium, såsom Luria-Bertani bouillon (uden antibiotika), og inkuberes ved 37 °C ved 80 rpm natten over.
- Resuspender ved at tage 100-150 μL af den dyrkede kultur natten over (ca. OD 600 = 1,8-2,0) i 2 ml frisk ikke-selektiv Luria-Bertani bouillonmedium og inkuber i 2-4 timer (indtil OD600 når 0,4-0,5).
- Fortynd denne friskdyrkede kultursuspension ved hjælp af steril 0,85% saltopløsning, således at kulturens densitet er lig med 0,5 McFarland-standard (ca. OD600 = 0,1), hvilket stort set svarer til 1-2 × 108 celler / ml.
- Bland forsigtigt bakteriesuspensionen for en jævn cellefordeling.
- Brug ovenstående suspension inden for 15 minutter efter fortynding.
- Podning af agarpladerne
- Forbered Mueller-Hinton Agar (MHA) plader til udførelse af AST ved at blande 38 g MHA i 1.000 ml dobbeltdestilleret vand, og opløs blandingen ved opvarmning. Den opløste blanding autoklave ved 121 °C, 15 psi i 15 min.
- Sørg for, at dybden af MHA i pladerne er 4 mm (25 ml medium pr. plade).
- Fjern samtidig antibiotikaskiverne fra fryseren og varm dem op til stuetemperatur.
BEMÆRK: Antibiotikaskiverne skal gradvist optøs ved først at tø diskene op ved 4 °C og senere ved stuetemperatur for at reducere enhver potentiel fare for kondens på diskene, som efterfølgende kan påvirke hæmningszonen (ZOI). - Under aseptiske forhold dyppes en steril vatpind i podematerialet fremstillet i trin 4.1, og overskydende suspension fjernes for at undgå overpodning af pladerne.
- Spred kulturen jævnt på pladerne, startende fra toppen af MHA-pladen og gå frem og tilbage fra kant til kant. Drej pladen 60° under podning.
- Anvendelse af antibiotikaskiverne
- Ved hjælp af flammesteriliserede pincet overføres antibiotikaskiverne aseptisk til de podede MHA-plader, og tryk forsigtigt på skiverne for at sikre fuldstændig jævn kontakt med agaren.
BEMÆRK: Denne procedure skal udføres inden for 15 minutter efter podning af kulturen på pladerne. - Anbring det passende antal antibiotikaskiver på agarpladen under hensyntagen til organismen, det anvendte antibiotikum og pladens størrelse for at undgå overlapning af hæmningszonerne.
BEMÆRK: Fire til fem skiver kan rummes på en 90 mm cirkulær plade.
- Ved hjælp af flammesteriliserede pincet overføres antibiotikaskiverne aseptisk til de podede MHA-plader, og tryk forsigtigt på skiverne for at sikre fuldstændig jævn kontakt med agaren.
- Inkubation af pladerne
- Inden for 15 minutter efter påføring af antibiotikaskiverne vendes pladerne på hovedet, og de inkuberes ved 37 °C natten over.
- Fortolkning af resultaterne
- ZOI diameter måles i millimeter (mm), og der tolkes i henhold til brudpunktsværdierne fra EUCAST11. Se de to eksempler nedenfor.
- Zonediameterens brudpunkt (mm) for en ciprofloxacin antibiotikaskive (5 μg) for Enterobacterales er S ≥ 25 og R < 22, hvilket betyder, at den anses for at være følsom (S), hvis ZOI ≥ 25 mm, mens den er resistent (R), hvis ZOI < 22 mm. Hvis ZOI-diameteren falder mellem 22 og 25, anses isolatet for at være mellemliggende (I).
- Zonediameterens brudpunkt (mm) for en chloramphenicol antibiotikaskive (30 μg) for Staphylococcus spp. er S ≥ 18 og R < 18, hvilket betyder, at den anses for at være følsom, hvis ZOI ≥ 18 mm, mens den er resistent, hvis ZOI < 18 mm.
- Indekset for multipel antibiotikaresistens (MAR) bestemmes ved at finde forholdet mellem antallet af antibiotika, som isolatet er resistent over for, og det samlede antal antibiotika, som isolatet udsættes for.
BEMÆRK: Til kvalitetskontrol, E. coli ATCC 25922 og S. Aureus ATCC 29213 bruges som referencestammer efter protokollen som i trin 4.
- ZOI diameter måles i millimeter (mm), og der tolkes i henhold til brudpunktsværdierne fra EUCAST11. Se de to eksempler nedenfor.
5. PCR-baseret påvisning af antibiotikaresistensgener i isolaterne
- Brug en standard PCR-protokol til identifikation af ARG'er i isolaterne. Forbered DNA-skabelonen ved hjælp af protokollen i trin 3.1.
BEMÆRK: PCR-cykelbetingelserne, der blev anvendt i denne undersøgelse, var 94 °C i 10 minutter efterfulgt af 35 cyklusser med 94 °C i 30 sekunder, udglødning i 30 s ved den passende temperatur (som standardiseret for hvert primersæt), forlængelse ved 72 °C i 40 s og en endelig forlængelse ved 72 °C i 5 minutter. Reaktionsblandingen er beskrevet i tabel 4. Listen over ARG'er, primere og udglødningstemperaturer er angivet i tabel 5. - Følg trin 3.2.3-3.2.10 for at løse, visualisere og kontrollere ampullernes renhed.
6. Hele metagenomisk DNA-analyse til identifikation af den samlede bakteriediversitet og påvisning af ARG'er i metagenomet
- Ekstraktion af det samlede DNA (metagenom) fra vandprøven
- Udtræk det metagenomiske DNA fra de filtrerede vandprøver.
BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev det metagenomiske DNA (total DNA) ekstraheret fra de filtrerede vandprøver ved hjælp af det refererede DNA-isolationssæt efter producentens protokol (se materialetabellen). - Kontroller kvaliteten af DNA'et ved at lægge 3 μL af det ekstraherede metagenomiske DNA på en 0,8% agarosegel, og kør gelen ved 80-110 V i ca. 30 minutter.
- Kontroller, om der er et enkelt intakt bånd.
- Kontroller DNA-koncentrationen ved hjælp af et fluorometer.
- Udtræk det metagenomiske DNA fra de filtrerede vandprøver.
- Bestemmelse af bakteriel mangfoldighed og påvisning af ARG'er ved hjælp af hel metagenomisk DNA-sekventering
- Biblioteksforberedelse og PCR-forstærkning:
- Forbered et parret sekventeringsbibliotek ved hjælp af det refererede DNA-biblioteksforberedelsessæt (se materialetabellen).
- Gør DNA'et klar til adapterligering ved at tage 200 ng DNA og mekanisk skære det i mindre fragmenter efterfulgt af et kontinuerligt trin med slutreparation, hvor et "A" tilføjes til 3'-enderne.
- Afhængigt af den platform, der bruges til sekventering, ligeres specifikke adaptere til begge ender af DNA-fragmenterne.
BEMÆRK: Sekvenser, der er afgørende for binding af dobbeltstregkodede biblioteker til en flowcelle til sekventering, findes i disse adaptere. Dette muliggør PCR-forstærkning af de adapterligerede fragmenter og binding af standardsekventeringsprimere. - For at kontrollere kvaliteten og kvantiteten skal du analysere det forstærkede bibliotek ved hjælp af en højfølsom DNA-chip i henhold til producentens instruktioner.
- Klyngegenerering og sekventering:
- Indlæs det forstærkede bibliotek på den relevante sekventeringsplatform til klyngegenerering og efterfølgende sekventering.
BEMÆRK: Biblioteksmolekylerne binder til de komplementære adapteroligoer på den parrede flowcelle. Under sekventering spaltes de fremadrettede tråde selektivt efter resyntesen af den omvendte streng. Denne kopierede omvendte streng sekventeres derefter fra den modsatte ende af fragmentet.
- Indlæs det forstærkede bibliotek på den relevante sekventeringsplatform til klyngegenerering og efterfølgende sekventering.
- Bioinformatisk analyse:
- Generer stilladser fra data af høj kvalitet ved hjælp af den relevante platform.
- Underkaste disse stilladser bioinformatikanalyse til taksonomisk klassificering og identifikation af ARG'erne.
BEMÆRK: Arbejdsprocessen for hele metagenomisk DNA-analyse til identifikation af den samlede bakteriediversitet og påvisning af ARG'er i metagenomet er vist i figur 1. Figur 2 indeholder et ruteark over den komplette metode, der er beskrevet i manuskriptet.
- Biblioteksforberedelse og PCR-forstærkning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samlet bakteriebelastning og antibiotikaresistente (AR) bakterier tæller
Optællingen af den totale bakteriebelastning blev udført ved at sprede 10-4 til 10-6 gange fortyndinger af vandprøverne på R2A Agar, modificeret medium. Til tælling af AR-bakterietællingen blev 10-3 til 10-6 gange fortyndinger spredt på medieplader indeholdende antibiotika (figur 3). Det samlede antal og AR-bakterietællinger blev beregnet som CFU / ml, og alle pletteringseksperimenterne blev udført i to eksemplarer. Efter ovenstående protokoller viste denne undersøgelse, at det samlede bakterietal var 3,0 × 109 CFU / ml. AR-bakteriebelastningen viste sig at være høj i området 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU / ml (tabel 6).
Identifikation af dyrkelige bakterier ved 16S rRNAgen-sekventering
Råt DNA fra hvert isolat blev brugt som skabelon til at udføre 16S rRNA-genspecifik PCR. I de i alt 15 AR-isolater, der blev sekventeret, tilhørte 10 Enterobacteriaceae-familien, hvoraf de fleste var Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae. Sjældne opportunistiske bakterier såsom Comamonas spp. tilhørende familien Comamonadaceae, Micrococcus spp. og Arthrobacter spp. tilhørende familien Micrococcaceae og Aeromonas spp. tilhørende familien Aeromonadaceae blev også identificeret fra vandprøven (tabel 7).
Påvisning af antibiotikaresistens i de dyrkbare bakterier ved hjælp af antibiotikafølsomhedstest
Antibiotikaresistensprofilen for ovennævnte identificerede isolater blev genereret ved at udføre ASAT ved hjælp af diskodiffusionsmetoden (figur 4). Ud af de 15 testede isolater havde 8 et MAR-indeks på ≥0,2, hvilket indikerer en høj grad af resistens. Desuden viste mange af isolaterne co-resistensprofiler (resistens over for det samme sæt antibiotika). Isolater som Comamonas spp. og Arthrobacter spp. viste imidlertid ikke resistens over for nogen af de testede antibiotika (tabel 8).
Påvisning og identifikation af antibiotikaresistensgener i de dyrkbare bakterier
I alt 10 AR-isolater blev screenet for tilstedeværelse af ARG'er ved hjælp af PCR. Den mest udbredte ARG i de dyrkelige isolater var blaTEM, der koder for β-lactamase, efterfulgt af aminoglycosidresistensgenet aadA. Andre amplificerede ARG'er var blaCTX-M, dfr1 og aac (6') -Ib , der gav resistens over for henholdsvis β-lactamer, trimethoprim og aminoglycosider. De repræsentative resultater af forstærkningen af ARG'erne er vist i figur 5. For de fleste af de identificerede isolater blev fænotypisk resistens (ASAT) bekræftet på molekylært niveau via PCR-baseret genotypisk AR-profilering.
Identifikation af den samlede bakteriediversitet i det metagenomiske DNA
For at kontrollere tilstedeværelsen af alle mulige bakterier (både dyrkelige og ikke-dyrkelige) og for at identificere deres relative overflod blev der udført en metagenomisk DNA-analyse for den samlede bakteriediversitet. Ved hjælp af high-throughput next-generation sequencing (HT-NGS) tilgangen blev ~ 96.94% af de samlede sekvenslæsninger opnået, hvilket resulterede i høj dækning. Taksonomisk annotation blev udført for at klassificere læsningerne i forskellige taksonomiske grupper fra phylum til slægtsniveau (figur 6 og figur 7). I alt 50 phyla kunne identificeres i metagenomet, hvilket indikerer den høje bakterielle mangfoldighed i vandprøven. Proteobakterier var den mest dominerende phylum, bestående af klasserne alfaproteobakterier, betaproteobakterier og gammaproteobakterier. På ordreniveau var Burkholderiales den mest udbredte orden, der tilhørte Betaproteobacteria-klassen. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium og Comamonas var nogle af de rigelige slægter, der findes i vandprøven.
Påvisning af ARG'er fra det metagenomiske DNA
For at forstå den samlede pulje af ARG'er i vandprøvens metagenom blev der udført hel metagenomisk sekventering efterfulgt af identifikation af ARG'er ved hjælp af passende bioinformatikværktøjer. Den metagenomiske tilgang sikrer, at de ARG'er, der er til stede i både dyrkelige og ikke-dyrkelige mikroorganismer i prøven, detekteres. En række gener, der giver resistens over for β-lactamer (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); aminogylcosider (AAC(6')-34); quinoloner (qnrS6, qnrVC5); antibiotiske effluxpumper-resistens-nodulationscelledeling (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), ATP-bindende kassette (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) og større facilitatorsuperfamilie (MFS) (abaQ); trimethoprimresistent dihydrofolatreduktase (dfrD, dfrA20); rifampinphosphotransferase (rphB); og chloramphenicol acetyltransferase (CAT) (catB10) blev påvist i metagenomet. De ARG'er, der blev påvist via PCR i de dyrkbare isolater (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1), blev også påvist ved hel metagenomisk sekventering, hvilket bekræftede deres tilstedeværelse i vandprøven. De repræsentative resultater af de ARG'er, der er identificeret i metagenomet ved hjælp af helmetagenomisk DNA-analyse, er angivet i tabel 9.
Figur 1: Workflow for hele metagenomisk DNA-analyse. Den trinvise arbejdsgang til identifikation af den samlede bakterielle mangfoldighed og påvisning af ARG'erne fra metagenomet præsenteres. De overordnede trin involverer metagenomisk DNA-forberedelse, amplifikation og identifikation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Flowsheet for den komplette metode. Den trinvise arbejdsgang for den metode, der anvendes i denne undersøgelse. En kombination af både kulturbaserede og ikke-kulturbaserede teknikker bruges til at få fuldstændig information om bakteriediversiteten og identiteten af de ARG'er, der er til stede i vandprøven. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder af isolerede kolonier på antibiotikaholdig R2A-agar, modificerede plader. Vandprøver belagt med cefotaxim (3 μg/ml)-holdige R2A-agar, modificerede plader. Prøven blev serielt fortyndet og belagt i dobbelt-A1, A2: 10-4; B1, B2: 10-5; C1, C2: 10-6. Efter den passende inkubationsperiode var de isolerede kolonier synlige på B1-, B2-, C1- og C2-pladerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Antibiotikafølsomhedstest ved diskdiffusionsmetoden. Repræsentative billeder af ASAT ved diskdiffusionsmetoden for et Escherichia coli-isolat . AST blev udført i duplikat-A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. ZOI'ernes diametre blev målt i millimeter (mm). For at tolke, om isolatet er resistent eller modtageligt for det anvendte antibiotikum, blev ZOI sammenlignet med de seneste EUCAST-tabeller. Forkortelser: AST = antibiotikafølsomhedstest; CTX = cefotaxim; IPM = imipenem; C = chloramphenicol CIP = ciprofloxacin; LE = levofloxacin; TGC = tigecyclin; AMP = ampicillin; GEN = gentamicin; TR = trimethoprim; N = neomycin; K = kanamycin; CTR = ceftriaxon; ZOI = hæmningszone; EUCAST = Den Europæiske Komité for Undersøgelse for Antibiotikafølsomhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: PCR-amplifikation af antibiotikaresistensgener fra dyrkbare bakterier. Agarosegelelektroforese efter PCR blev udført til visualisering af amplificerede bånd for at kontrollere tilstedeværelsen af ARG'er i isolaterne. Separerede bånd af PCR-amplicons kan ses på gelen. Størrelsen af de enkelte PCR-amplicons sammenlignes med en passende DNA-markør. Bane L1: 100 bp DNA-stige; Baner 1-5: 1: dfr1 (425 bp); Bane 2: blaTEM (310 bp); Bane 3: blaCTX-M (500 bp); Bane 4: aac(6')-Ib ( 395 bp); Bane 5: aadA (624 bp). Forkortelse: ARGs = antibiotikaresistensgener. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Taksonomisk klassifikation for phylum- og klasseniveau . (A) Søjlediagram, der viser den taksonomiske tæthedsfordeling på phylum-niveau af bakteriemetagenomet i vandprøven. I alt 50 bakterielle phyla blev identificeret ved metagenomisk analyse. De første 12 dominerende phyla af bakterier er vist. (B) Søjlediagram, der viser den taksonomiske tæthedsfordeling på klasseniveau af det bakterielle metagenom i vandprøven. I alt 50 bakterieklasser blev identificeret ved den metagenomiske analyse. De første 15 dominerende klasser af bakterier er vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Taksonomisk klassifikation for ordens- og slægtsniveau . (A) Søjlediagram, der viser den taksonomiske tæthedsfordeling på ordensniveau af det bakterielle metagenom i vandprøven. I alt 50 bakterieordrer blev identificeret ved den metagenomiske analyse. De første 14 dominerende ordrer af bakterier er vist i figuren. (B) Søjlediagram, der viser den taksonomiske tæthedsfordeling på slægtsniveau af bakteriemetagenomet i vandprøven. I alt 50 bakterieslægter blev identificeret ved metagenomisk analyse. De første 15 dominerende slægter af bakterier er vist er vist i figuren. Klik her for at se en større version af denne figur.
| PCR-reagenser | Volumen (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 20 |
| Fremadgående primer (10 pico-mol) | 1.5 |
| Omvendt primer (10 pico-mol) | 1.5 |
| Rå DNA-skabelon | 1.5 |
| Sterilt molekylærbiologisk vand | 15.5 |
| Samlet volumen | 40 |
Tabel 1: PCR-mastermix-bestanddele. Reaktionsblandingens sammensætning af forskellige PCR-reagenser.
| Retning | Primer sekvens 5 '- 3' | PCR-betingelser | Antal cyklusser |
| Fremad | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C i 10 min | 1 |
| Denaturering ved 94 °C i 30 s | 35 | ||
| Udglødning ved 50 °C i 30 s | |||
| Forlænger ved 72 °C i 40 s | |||
| Omvendt | CTACCGGGGTATCTAATCC | Endelig forlængelse ved 72 °C i 5 min | 1 |
Tabel 2: PCR-cyklusbetingelser for amplifikation af 16S rRNA-genet. De PCR-cyklusbetingelser, der kræves til 16S rRNA-genamplifikation, vises. Trinene inkluderer et indledende denatureringstrin efterfulgt af 35 cyklusser med denaturering, udglødning og forlængelse og et sidste forlængelsestrin.
| 6x ilægning gel | |
| Indhold | Kvantitet |
| Bromophenol blå | 25 mg |
| 85% glycerol | 7,06 ml |
| Milli-Q vand | 2,94 ml |
| Samlet volumen | 10 ml |
| 50x Tris-acetat-EDTA (TAE) stambuffersammensætning | |
| Indhold | Kvantitet |
| Tris base | 242 g i 700 ml dobbeltdestilleret vand |
| Iseddike (GAA) | 57,1 ml |
| 0,5 M (EDTA) pH 8,0 | 100 ml |
| pH-værdien indstilles til 8,5, og der fyldes op til 1000 ml med dobbeltdestilleret vand | |
| For 1x TAE: 20 ml 50x TAE-buffer + 980 ml dobbeltdestilleret vand | |
Tabel 3: Sammensætning af 6x gelbelastningsbuffer og 50x Tris-acetat-EDTA-stambuffer. 6x gelbelastningsbufferen blandes med prøven, der skal køres på agarosegelelektroforese. Den indeholder bromphenolblåt som sporingsfarvestof. Glycerol øger densiteten af prøven, der lægges for korrekt belastning i brøndene. Sammensætningen af de forskellige reagenser, der kræves til fremstilling af 50xTAE-stambufferen, vises også. TAE-buffer er en af de mest almindelige buffere, der anvendes til AGE, og den opretholder pH-værdien på 8,5 og muliggør migration af amplificeret DNA under AGE. Forkortelser: TAE = Tris-acetat-EDTA; ALDER = agarosegelelektroforese.
| PCR-reagenser | Volumen (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 5 |
| Fremadgående primer (10 pico-mol) | 0.5 |
| Omvendt primer (10 pico-mol) | 0.5 |
| Rå DNA-skabelon | 1.5 |
| Sterilt vand af molekylærbiologisk kvalitet | 2.5 |
| Samlet volumen | 10 |
Tabel 4: PCR-mastermixsammensætning til identifikation af ARG'er. Reaktionsblandingens sammensætning af forskellige PCR-reagenser, der kræves til udførelse af PCR-eksperimentet.
| Sr. Nej. | Målgen | Modstand mod | Primer | Primer sekvens (5'-3') | Amplicon størrelse (bp) | Udglødningstemperatur (°C) | Referencer | ||||
| 1 | DFR En | Trimethoprim | Fremad | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz et al., 19 | ||||
| Omvendt | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β – lactamer | Fremad | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | Gebreyes, Thakur20 | ||||
| Omvendt | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – lactamer | Fremad | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | Li et al. 21 | ||||
| Omvendt | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | Aminoglycosider | Fremad | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers et al. 22 | ||||
| Omvendt | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | AAD En | Aminoglycosider | Fremad | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | Ciesielczuk 23 Annoncer | ||||
| Omvendt | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
Tabel 5: Primere til PCR af ARG'er i dyrkelige bakterier. De forskellige ARG'er, der anvendes i denne undersøgelse sammen med deres respektive primersekvenser, vises. Den forventede størrelse af amplicon er angivet i basepar. Udglødningstemperaturen for hvert primersæt nævnes også.
| Antibiotikum | Koncentration af antibiotika (μg/ml) | CFU/ml |
| - | - | 3,0 x 109 |
| CTX | 3 | 4,5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3,2 x 108 |
| K | 15 | 9,6 x 105 |
| E | 20 | 1,6 x 108 |
| VA | 3 | 1,2 x 109 |
Tabel 6: Samlet antal antibiotikaresistente bakterier. Fem antibiotika blev brugt til den indledende isolering af de antibiotikaresistente bakterier fra vandprøven. De samlede bakterietal (uden antibiotika) og AR-bakterietællingerne præsenteres i form af kolonidannende enheder pr. milliliter (CFU / ml). Forkortelser: AR = antibiotikaresistent; CFU = kolonidannende enheder; CTX = cefotaxim; CIP = ciprofloxacin; K = kanamycin; E = erythromycin; VA = vancomycin.
| Isoler kode | Mikroorganismer | Familie |
| 1 | Escherichia coli | Enterobakterier |
| 2 | Escherichia coli | Enterobakterier |
| 3 | Escherichia coli | Enterobakterier |
| 4 | Escherichia coli | Enterobakterier |
| 5 | Escherichia coli | Enterobakterier |
| 6 | Escherichia coli | Enterobakterier |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Enterobakterier |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Enterobakterier |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Enterobakterier |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Enterobakterier |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | Micrococcus spp. | Micrococcaceae |
| 14 | Arthrobacter spp. | Micrococcaceae |
| 15 | Aeromonas spp. | Aeromonadaceae |
Tabel 7: Identifikation af antibiotikaresistente isolater ved 16S rRNA-gensekventering. Colony PCR blev udført for hvert isolat ved anvendelse af 16S rRNA genspecifikke primere. De opnåede amplicons blev derefter sekventeret og identificeret ved hjælp af passende bioinformatikværktøjer.
| Isoler nr. | Isolere | CTX | AMP | LE | C | TGC | CTR | IPM | GEN | N | TR | CIP | MAR | MAR-indekset | ||
| 1 | Escherichia coli | 13R | 0R | 0R | 28S | 23S | 11R | 39S | 20'ERNE | 18S | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia coli | 31S | 0R | 12R | 29S | 23S | 32S | 37S | 19'ERNE | 16S | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia coli | 14R | 0R | 14R | 14R | 21S | 10R | 34S | 17S | 11R | 24S | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia coli | 28S | 13R | 18R | 26S | 21S | 28S | 32S | 16R | 11R | 24S | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia coli | 11R | 0R | 12R | 26S | 21S | 10R | 31S | 17S | 16S | 22S | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia coli | 27S | 0R | 12R | 12R | 22S | 30'ERNE | 32S | 19'ERNE | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28S | 0R | 17R | 27S | 22S | 30'ERNE | 32S | 18S | 22S | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 11R | 26S | 24S | 22S | 30'ERNE | 28S | 17S | 16S | 24S | 23S | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 13R | 25S | 24S | 22S | 28S | 29S | 18S | 17S | 24S | 25S | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33S | 14S | 26S | 28S | 22S | 31S | 32S | 19'ERNE | 20'ERNE | 24S | 29S | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23S | - | - | 37S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27S | - | - | 42S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25S | 17R | 24S | 32S | 22S | 34S | 28S | 20'ERNE | - | 21S | 26S | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Arthrobacter spp. | 45S | 57S | 28S | 26S | 34S | 27S | 39S | 26S | - | 28S | 28S | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
Tabel 8: Antibiotikaresistensfænotype af bakterieisolaterne analyseret af AST. Fænotypisk resistens i isolaterne blev analyseret ved hjælp af diskodiffusionsmetoden. Tallene angiver ZOI i millimeter (mm). For MAR-indekset angiver tallene det samlede antal antibiotika, som et isolat er resistent over for. Forkortelser: AST = antibiotikafølsomhedstest; CTX = cefotaxim; AMP = ampicillin; LE = levofloxacin; C = chloramphenicol TGC = tigecyclin; CTR = ceftriaxon; IPM = imipenem; GEN = gentamicin; N = neomycin; TR = trimethoprim; CIP = ciprofloxacin; R = resistent; S = følsom; MAR = multipel antibiotikaresistens; ZOI = hæmningszone.
| AMR GENE FAMILIE | GEN(ER) |
| SMB beta-lactamase | SMB-1 |
| ampC-type beta-lactamase | ampC1 |
| VIM beta-lactamase | VIM-20 |
| CcrA beta-lactamase | ccrA |
| NmcA beta-lactamase | nmcR |
| ARL Beta-lactamase | ARL-1 |
| blaZ beta-lactamase | blaZ |
| blaTEM beta-lactamase | blaTEM* |
| blaCTX beta-lactamase | blaCTX |
| AAC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| ANT(3'') | aadA |
| Quinolonresistensprotein (QNR) | qnrS6, qnrVC5 |
| resistens-nodulation-celledeling (RND) antibiotisk effluxpumpe | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| ATP-bindende kassette (ABC) antibiotisk effluxpumpe | oleC, macB, patA, bcrA |
| større facilitator superfamilie (MFS) antibiotisk effluxpumpe | abaQ |
| Trimethoprimresistent dihydrofolatreduktase DFR | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| rifampin phosphotransferase | rphB |
| Undecaprenylpyrophosphat-relaterede proteiner | bcrC |
| methicillinresistent PBP2 | mecD |
| vanJ membran protein | vanJ |
| tetracyklinresistent ribosomalt beskyttelsesprotein | tetT |
| chloramphenicol acetyltransferase (CAT) | catB10 |
| Erm 23S ribosomal RNA-methyltransferase | ØHM(37) |
| Glykopeptidresistens gen klynge | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR-phosphoethanolamintransferase | MCR-9 |
| Sulfonamidresistent sul | sul3 |
| *Understregede gener blev også påvist i de dyrkbare mikroorganismer | |
Tabel 9: ARG'er identificeret ved hjælp af hel metagenomisk DNA-analyse. Det samlede metagenom af vandprøven blev anvendt til hel metagenomisk sekventering, og de opnåede sekvenser blev kommenteret under anvendelse af den relevante ARG-database. De repræsentative resultater af nogle af de vigtige ARG'er, der er identificeret i det metagenomiske DNA, vises. De understregede gener blev også påvist i de dyrkbare mikroorganismer. Forkortelse: ARG = antibiotikaresistent gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prøveindsamling og -behandling spiller en væsentlig rolle og kan påvirke resultaterne og fortolkningen af undersøgelsen. For at udelukke variationen i prøverne er det derfor vigtigt at foretage prøveudtagning flere steder i det ferskvandsområde, der undersøges. Opretholdelse af korrekte aseptiske miljøforhold ved håndtering af sådanne prøver kan forhindre kontaminering. For at undgå ændringer i bakteriesammensætningen, som kan påvirke kvaliteten og mængden af ekstraherede nukleinsyrer, bør transitbetingelserne desuden holdes på 4 °C med minimal tidsforskydning fra prøveindsamlingsstedet til den efterfølgende forarbejdning. Flere undersøgelser har fremhævet, at denne mellemliggende periode mellem prøveindsamling og behandling kan give variable resultater i senere analysestadier, hvis den ikke udføres omhyggeligt12,13.
Brug af en række fortyndinger til plettering sikrer, at kolonier hverken klumper sig sammen eller er for få kolonier til at tælle. Det er nødvendigt at udføre eksperimenterne i to eksemplarer for at tage højde for variationer i CFU/ml, der kan opstå på grund af pipetterings-/håndteringsfejl. Desuden opretholdes kontrolplader for hvert forsøg for at sikre, at de anvendte antibiotika fungerer effektivt, og at falsk-positive resultater elimineres. Derfor bør kontrolpladerne ikke have nogen synlig kolonivækst. Dette indikerer effektiviteten af de anvendte antibiotika.
Under ASAT kan podekulturtætheden og agarpladens tykkelse påvirke ZOI's diameter og dermed fortolkningen af resultaterne. Det bør derfor sikres, at disse to faktorer er ensartede, når AST-forsøgene udføres. Det mest kritiske aspekt er antallet af bakterieceller, der er til stede i podningen. Generelt anvendes 1 × 10 8-2 × 108 CFU / ml celler som podning, hvilket er lig med 0,5 McFarland-standarden14. Denne koncentration af podestoffet skal holdes konstant for at undgå enhver variation i resultaterne. Enhver koncentration, der er højere eller lavere end den krævede koncentration, skal fortyndes ved hjælp af sterilt saltvand og anvendes straks til podning inden for 15 minutter. Mens du spreder inokulumet på agarpladerne, skal du sørge for at undgå en for stor mængde inokulum. Overskydende inokulum kan fjernes ved at trykke vatpinden på siderne af det bakterielle suspensionsrør, før det podes på MHA-pladen. Enhver afvigelse fra AST-standardproceduren kan i væsentlig grad påvirke de data, der opnås fra sådanne protokoller11,15. En tidligere undersøgelse viste, at en MAR-indeksværdi på ≥0,2 indikerer høj resistens i isolaterne16. Da fortolkningen af resultaterne af AST er baseret på ZOI, bør underpodning eller overpodning af kulturen undgås.
Til PCR skal masterblandingen fremstilles på en isblok for at minimere risikoen for nedbrydning af ingredienserne og tab af enzymets aktivitet. Brug af handsker under opsætning af reaktionen minimerer risikoen for ekstern kontaminering17. Spændingen under AGE bør ikke være for høj, da dette kan føre til en opvarmningseffekt og nedbrydning af de indlæste prøver. Udførelse af AGE ved en optimal spænding sikrer, at båndene er godt adskilt og er skarpe uden træk eller udtværingseffekter.
Undersøgelser udført i de sidste par årtier har vist brugen af 16S rRNA gen amplicon sekventering til identifikation af forskellige mikroorganismer. Ved 16S rRNA-gensekventering kan valget af metode til ekstraktion af skabelon-DNA'et forårsage bias, hvilket igen kan påvirke downstream-analysen. Grampositive bakterier har en tyk peptidoglycancellevæg, der kan gøre det vanskeligt at ekstrahere nukleinsyren. Derfor bør valget af ekstraktionsmetode være sådan, at det effektivt fanger alle typer mikrobielt DNA. Den traditionelle kogemetode til ekstraktion af rå skabelon-DNA er en sådan effektiv metode til at ekstrahere indholdet af cellen og dermed reducere forstyrrelser i resultaterne.
For at forstå det komplette bakterielle samfund i vandlegemet blev højgennemstrømningsteknikken til næste generations sekventering (HT-NGS) anvendt i denne undersøgelse. Hele metagenomisk DNA-analyse tillader undersøgelse af hele metagenomet af en given prøve. Kulturbaserede teknikker giver hovedsageligt en aerob tælling af bakteriebelastningen, hvilket indikerer den mikrobiologiske kvalitet af en prøve. Imidlertid udgør dyrkelige mikroorganismer kun 1% af de samlede mikroorganismer. Den resterende mikroflora, som omfatter en bred vifte af arter, herunder anaerober, er dårligt karakteriseret og ignoreres ofte. Disse mikroorganismer kan bære AR-træk. Desuden er kommensale mikroorganismer et reservoir af AR-gener, der kan overføres til patogener via forskellige genetiske udvekslingsbegivenheder18. Mange af disse kommensale er ikke-dyrkelige og kan studeres ved en metagenomisk tilgang, der involverer HT-NGS, hvilket giver større dækning for identifikation af forskelligartet mikroflora i enhver prøve. Ved hjælp af metagenomisk analyse blev der opnået en detaljeret profil af bakterietaxa, som supplerede de dyrkelige data. Desuden kan sådanne komplementære tilgange give en idé om den samlede AR-tilstand for det undersøgte vandområde.
I denne undersøgelse var vi ved hjælp af en kombination af både konventionelle kulturbaserede og ikke-kulturbaserede metagenomiske teknikker i stand til at identificere den samlede bakteriediversitet, forskellige antibiotikaresistente bakterier og den samlede pulje af vandbårne ARG'er. Metoden beskrevet i denne undersøgelse kan replikeres og tilpasses til identifikation af AR-patogener i enhver anden vandkilde - kystvand, naturligt vand og menneskeskabt drikkevand. Det kan også bruges til at spore overførslen af vandbårne nosokomielle patogener og til overvågning af hospitalsrelaterede infektioner i hospitals- og klinikindstillinger gennem vandkilder såsom dræn, toiletter, badekar og luftfugtere. Dette vil bidrage til overvågningen af antimikrobiel resistens og identifikationen af vandbaserede AMR-hotspots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af finansielle tilskud fra Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme ved University of Mumbai. Devika Ghadigaonkar arbejdede som Project Fellow under ordningen. Den tekniske hjælp fra Harshali Shinde, seniorforsker under Institut for Naturvidenskab og Teknologi-Science and Engineering Research Board (DST-SERB) Projekt nr.: CRG/2018/003624, anerkendes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).
