Summary
Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.
Abstract
Chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen onherstelbare DNA-schade in kankercellen veroorzaken, wat leidt tot apoptose of vroegtijdige senescentie. In tegenstelling tot apoptotische celdood is senescentie een fundamenteel andere machinerie die de voortplanting van kankercellen beperkt. Tientallen jaren van wetenschappelijke studies hebben de complexe pathologische effecten van senescente kankercellen in tumoren en micro-omgevingen onthuld die kankercellen en stromale cellen moduleren. Nieuw bewijs suggereert dat senescentie een krachtige prognostische factor is tijdens de behandeling van kanker, en daarom is snelle en nauwkeurige detectie van senescente cellen in kankermonsters essentieel. Dit artikel presenteert een methode om therapie-geïnduceerde senescentie (TIS) in kankercellen te visualiseren en te detecteren. Diffuse grote B-cellymfoom (DLBCL) cellijnen werden behandeld met mafosfamide (MAF) of daunorubicine (DN) en onderzocht op de senescentiemarker, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal), de DNA-synthesemarker 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) en de DNA-schademarker gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometer beeldvorming kan helpen bij het genereren van hoge resolutie eencellige beelden in een korte periode van tijd om tegelijkertijd de drie markers in kankercellen te visualiseren en te kwantificeren.
Introduction
Een verscheidenheid aan stimuli kan cellulaire senescentie veroorzaken, waardoor cellen in een staat van stabiele celcyclusstilstand komen. Deze stimuli omvatten intrinsieke signaleringsveranderingen of extrinsieke spanningen. Intrinsieke signalen omvatten progressieve telomeerverkorting, veranderingen in de telomeerstructuur, epigenetische modificatie, proteostasestoornissen, mitochondriale disfunctie en activering van oncogenen. Extrinsieke stress omvat ontstekings- en/of weefselschadesignalen, straling of chemische behandeling en voedingsdeprivatie 1,2,3,4. Onder de verschillende soorten senescentie zijn de meest geziene en goed bestudeerde replicatieve senescentie, oncogen-geïnduceerde senescentie (OIS), door straling geïnduceerde senescentie en therapie-geïnduceerde senescentie (TIS). OIS is een acute cellulaire reactie op genotoxische schade veroorzaakt door replicerende stress gegenereerd door afwijkende oncogene activering en kan tot op zekere hoogte de pathologische progressie van een preneoplastische laesie naar een volledige tumor voorkomen. TIS treedt op wanneer tumorcellen worden belast door chemotherapeutische geneesmiddelen of ioniserende straling 5,6.
Senescentie wordt beschouwd als een tweesnijdend zwaard in de pathologie vanwege de zeer dynamische aard. Het werd aanvankelijk beschreven als een gunstig tumoronderdrukkend mechanisme om beschadigde cellen uit de circulerende pool van delende cellen te verwijderen, de normale functie van organen te beschermen en de tumorgroei te remmen 7,8,9. Opkomend bewijs suggereert echter een donkere kant van senescentie. Senescente cellen scheiden pro-inflammatoire cytokines af, bekend als senescentie-geassocieerd secretoir fenotype (SASP), wat leidt tot fibrose en slecht functionerende organen en tumorinitiatie en progressie bevordert10. Bovendien ondergaan senescente kankercellen epigenetische en genexpressie herprogrammering parallel met chromatineremodellering en activering van een aanhoudende DNA-schaderespons (DDR)11,12, waarbij nieuwe kankerstamceleigenschappen worden verworven3. Hoewel senescentie-capabele tumoren beter reageren op therapeutische interventie in vergelijking met senescentie-incapabeletumoren 13, kan de persistentie van senescente cellen leiden tot een slechte langetermijnprognose als ze niet effectief worden geïdentificeerd en geëlimineerd door senolytische geneesmiddelen5. Hoe dan ook, een betrouwbare methode om senescentie te beoordelen is van aanzienlijk klinisch belang, niet alleen voor de prognose van therapiebehandeling, maar ook voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën gericht op senescente cellen.
Ongeacht verschillende triggers vertonen senescente cellen enkele gemeenschappelijke kenmerken, waaronder vergrote, afgeplatte, multinucleaire morfologie met grote vacuolen, aanzienlijk uitgebreide kernen, vorming van H3K9me3-rijke senescentie-geassocieerde heterochromatine (SAHF) in de kern, aanhoudende accumulatie van DNA-schademarker γH2AX foci, geactiveerd p53-p21CIP1 en Rb-p16INK4a celcyclus regulerende mechanismen, stabiele G1-celcyclusstilstand, massale inductie van SASP en verhoogde senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit14. Aangezien geen enkele marker voldoende is om senescentie te definiëren, wordt enzymatische kleuring voor SA-β-gal-activiteit, die wordt beschouwd als de gouden standaard voor senescentiedetectie, meestal gecombineerd met immunohistochemische kleuring voor H3K9me3 en Ki67 om TIS15 te detecteren. Chemische chromogene sa-β-gal is echter moeilijk te kwantificeren. Hier combineerden we 5-dodecanoylaminofluoresceïne-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) fluorescentie-gebaseerde SA-β-gal (fSA-β-gal) detectie met immunofluorescente kleuring voor γH2AX en EdU-geïncorporeerd DNA om C12FDG + EdU-γH2AX + senescente cellen te identificeren met behulp van het geavanceerde imaging flowcytometersysteem, dat de snelheid, gevoeligheid en gedetailleerde eencellige beelden combineert met ruimtelijke informatie die niet kan worden geleverd door flowcytometrie en microscopie. Deze methode maakt het mogelijk om snel beelden met een hoge resolutie te genereren, waardoor fluorescerende signalen in cellen kunnen worden gepositioneerd en gekwantificeerd, terwijl de snelle analyse van meerdere monsters mogelijk is door standaardpijpleidingen te bouwen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DLBCL-cellijnen met mafosfamide- of daunorubicinebehandeling om cellulaire senescentie te induceren
OPMERKING: Het protocol werkt ook voor adherente kankercellen. Afhankelijk van de celgrootte, zaad 1-2 × 105 cellen in één put van een 6-well plaat en incubeer de plaat in een 5% CO2, 37 ° C incubator 's nachts voor de behandeling. De protocolstappen zijn hetzelfde als voor suspensiecellen, maar met twee uitzonderingen. Eerst moeten cellen na stap 3.4 van de plaat worden gestoffeerd. Ten tweede worden wasstappen uitgevoerd zonder centrifugatie vóór trypsinisatie.
- Tel DLBCL-cellen en zaad 1 × 106 cellen / ml in 4 ml medium per put in een 6-well kweekplaat. Kweek DLBCL-cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U/ml penicilline/streptomycine.
- Voeg MAF (5 μg/ml) of DN (20 ng/ml) toe aan de celcultuur en schommel de plaat voorzichtig om te mengen.
OPMERKING: MAF en DN zijn niet stabiel. Na het oplossen in DMSO moet de stamoplossing worden gealiquoteerd en bij -20 °C worden bewaard. Vries-/dooicycli moeten worden vermeden. - Incubeer de plaat in een incubator van 5% CO2, 37 °C gedurende 3 dagen.
- Verzamel na een incubatie van 3 dagen de DLBCL-cellen in steriele centrifugebuizen van 15 ml en draai gedurende 5 minuten bij 100 × g, 4 °C.
- Gooi het supernatant weg, resuspendeer de celpellets met 4 ml vers medium en voeg de suspensies terug toe aan de 6-wellsplaat.
- Kweek de celplaat in een 5% CO2, 37 °C incubator gedurende nog eens 2 dagen voordat u deze oogst voor analyse.
2. Bereid oplossingen voor vlekken (tabel 1)
3. Kleur DLBCL-cellen met verschillende senescentiemarkers
OPMERKING: Celmonsters gekleurd met individuele markers (d.w.z. pacific blue-EdU, C12FDG of Alexa Fluor 647-γH2AX) worden voorbereid om een compensatiematrix te genereren om de fluorescentie spillover tijdens de meting te corrigeren. Hoewel sterk aanbevolen, kan deze stap worden opgeschort wanneer er een weglatende overlap (compensatiecoëfficiëntwaarde ≤ 0,1) is van de emissiespectra tussen verschillende fluoroforen. Gebruikers moeten echter gestandaardiseerde compensatiestappen bepalen bij het gebruik van verschillende instrumenten en fluorescentiepanelen.
- Voeg 10 mM EdU-oplossing in een verhouding van 1:1.000 toe aan de DLBCL-celcultuur die wordt gegenereerd uit stap 1.6 (de uiteindelijke EdU-concentratie is 10 μM). Schud de plaat voorzichtig om te mengen en incubeer in een 5% CO2, 37 °C incubator gedurende 3 uur.
- Haal de plaat uit de incubator en voeg 100 mM chloroquine-oplossing toe aan een eindconcentratie van 75 μM (zie discussie). Schud de plaat voorzichtig om te mengen en incubeer in een incubator van 5% CO2, 37 °C gedurende 30 minuten.
- Haal de plaat uit de incubator en voeg 20 mM C12FDG-oplossing toe bij 1: 1.000 tot een uiteindelijke C12FDG-concentratie van 20 μM. Schommel de plaat voorzichtig om te mengen en te incuberen in een 5% CO2, 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Haal de plaat uit de incubator en voeg 100 mM 2-fenylethyl-β-D-thiogalactoside (PETG) oplossing toe op 1:50 om de fSA-β-gal kleuring te stoppen (uiteindelijke PETG-concentratie van 2 mM). Draai de plaat voorzichtig om te mengen.
- Breng de cellen over in steriele centrifugebuizen van 15 ml en draai gedurende 5 minuten bij 100 × g, 4 °C. Gooi het supernatant weg en was de cellen met 4 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Herhaal de PBS-wasstap. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellets in 500 μL 4% paraformaldehyde fixatieoplossing.
- Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, centrifugeer bij 250 × g, kamertemperatuur gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en was cellen met 4 ml PBS.
- Herhaal de PBS-wasstap. Gooi het supernatant weg, resuspenseer de celpellet in 200 μL saponinepermeabilisatiebuffer en breng de suspensie over naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, centrifugeer bij 250 × g, kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellets in 200 μL primaire antilichaamoplossing (1:500 γH2AX-antilichaam in antilichaamincubatieoplossing). Incubeer bij 4 °C 's nachts in het donker.
- Centrifugeer de buizen bij 250 × g, 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en was met 100 μL saponine wasoplossing.
- Herhaal de wasstap nog twee keer. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellets in 500 μL EdU-detectiecocktail.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker. Centrifugeer bij 250 × g, kamertemperatuur gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en was met 1 ml saponinewasoplossing.
- Herhaal de wasstap twee keer. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellets in 20-50 μL PBS. Ga verder met sectie 4 voor monstermeting.
4. Beeldvorming van senescentiemarkers met behulp van het imaging flow cytometer systeem
- Leeg de fles met afvalvloeistof. Controleer de niveaus van snelheidsparels, sterilisator, reiniger, debubbler, schede en spoelreagentia (gedeïoniseerd water) om voldoende vloeistoffen te garanderen voordat u het instrument inschakelt (zie de materiaaltabel).
- Schakel het instrument en de beeldbewerkingssoftware in (zie de software-interface in figuur 1A).
- Klik op de knop Opstarten om fluidics en systeemkalibratie te initialiseren.
OPMERKING: Deze procedure duurt ongeveer 45 minuten. - Stel de vergroting in op 40x, stel de fluidics-snelheid in op laag en schakel de lasers in die nodig zijn in het experiment. Schakel lasers van 405 nm, 488 nm en 642 nm in om respectievelijk EdU-pacific blue, C12FDG en Alexa Fluor 647-γH2AX (of Alexa Fluor 647-Ki67) te meten. Stel Ch6 in voor scatter channel en Ch1 en Ch9 voor brightfield.
- Begin met het monster waarvan wordt verwacht dat het de hoogste fluorescentie heeft om de intensiteit van de lasers in te stellen. Draai de monsterbuis voorzichtig om om te mengen. Open het deksel van de buis en plaats de monsterbuis op het dock. Klik op Laden om te starten.
- Open een scatter plot en selecteer de functies Area_M01 en Aspect Ratio_M01 voor respectievelijk de X- en Y-as. Stel een poort boven beeldverhouding van 0,5 in om doubletten en celaggregaten onder en aan de rechterkant en de snelheidsparelpopulatie aan de linkerkant uit te sluiten (figuur 1B).
- Open een histogramplot en selecteer de functie Verloop RMS_M01_Ch01 voor de X-as. Kies de singletpopulatie en stel de poort in om te selecteren op gefocuste cellen (figuur 1C).
OPMERKING: Het beeldvormingssysteem gebruikt automatisch snelheidsparels om de focus voor beeldvorming aan te passen. Het wordt echter aanbevolen om de juiste helft van de histogrampiek te selecteren voor de best gerichte populatie. - Open een histogramplot en selecteer Raw Max Pixel Intensities voor X-as voor elk kleurkanaal (Ch2, 7 en 11). Pas de laservermogens aan (d.w.z. 488 nm,405 nm en 642 nm lasers voor respectievelijk Ch2, 7 en 11), zodat elke fluorochroom een Raw Max Pixel-waarde tussen 100 en 4.000 heeft om oververzadiging te voorkomen.
OPMERKING: Voor dit experiment is de instelling van het laservermogen 50 mW, 200 mW en 50 mW voor lasers van respectievelijk 488 nm, 405 nm en 642 nm. - Kies de gerichte populatie die u wilt opnemen en klik op Verwerven om de DLBCL-monsters met consistente instellingen te meten. Wanneer u monsters wisselt voor meting, klikt u op Return om de monsterbuis te herstellen. Druk op Laden om het monster te verwijderen .
- Nadat alle monsters zijn gemeten, schakelt u het brightfield en de scatterlaser uit. Meet een kleurcontrolemonsters om een compensatiematrix te genereren.
- Klik op Afsluiten om het beeldverwerkingssysteem te sluiten.
- Analyseer de gegevens in de beeldanalysesoftware.
- Gebruik de Spot Wizard-tool van de beeldanalysesoftware om automatisch nucleaire γH2AX-foci in live-cell-afbeeldingen te tellen en te kwantificeren. Selecteer twee celpopulaties (een met een hoog en een met een laag aantal vlekken) om de spotwizard te trainen voor verdere automatische analyse van het aantal vlekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een compensatiematrix werd gegenereerd met behulp van beeldanalysesoftware door het laden van geregistreerde gegevens van eenkleurige controlemonsters. Zoals te zien is in aanvullende figuur S1, werd een niet-verwaarloosbare (coëfficiëntwaarde ≥ 0,1) lichtoverloop van EdU naar C12FDG gedetecteerd met een overspraakcoëfficiëntwaarde 0,248, terwijl de overspraak tussen andere kanalen niet significant was. Vier verschillende DLBCL-cellijnen werden behandeld met 5 μg / ml MAF of 20 ng / ml DN om cellulaire senescentie te induceren en geanalyseerd met behulp van conventionele SA-β-gal-kleuring of de imaging flow-cytometriemethode.
Meer dan 70% van de KARPAS422-, WSU-DLCL2- en OCI-LY1-cellen kwamen in senescentiestatus, aangegeven door positieve SA-β-gal, terwijl SU-DHL6 volledig bestand was tegen senescentie-inductie door MAF en DN (supplementale figuur S2A). Met name MAF en DN induceerden ook celdood in alle DLBCL-cellen, hoewel niet dramatisch (aanvullende figuur S2B). Met behulp van de imaging flow-cytometriemethode toonden eencellige beelden en op flowcytometrie gebaseerde kwantificering een verhoogde C12FDG + EdU-γH2AX + senescente populatie in KARPAS422, WSU-DLCL2 en OCI-LY1, maar niet in SU-DHL6-cellen (figuur 2A-D), wat consistent was met de conventionele SA-β-gal kleuringsresultaten. Het percentage van de C12FDG+EdU-γH2AX+ senescente populatie was echter significant lager dan de conventionele SA-β-gal kleuringsmethode (figuur 2 en aanvullende figuur S2).
Bovendien toonde imaging flow-cytometrie-analyse diverse senescentie-induceerbaarheid tussen verschillende DLBCL-cellijnen, die niet duidelijk werd onderscheiden door conventionele SA-β-gal-kleuring. Het percentage C12FDG+EdU-γH2AX+ senescente OCI-LY1 cellen (d.w.z. 43,2% en 31,9% met respectievelijk MAF en DN) was significant lager dan dat van KARPAS422 (respectievelijk 62,2% en 73,8% met MAF en DN) en WSU-DLCL2 (respectievelijk 60% en 58,1% met MAF en DN) (figuur 2). Belangrijk is dat op beeldvorming gebaseerde analyse significant hogere aantallen γH2AX-foci in KARPAS422, WSU-DLCL2 en OCI-LY1 liet zien, maar niet in SU-DHL6-cellen (figuur 3A, B).
Figuur 1: Besturingssoftware-interface en instrumentinstellingen. (A) Imaging flow-cytometer software-interface. Het deelvenster live-cell-afbeeldingen (linksboven) bevat live-cell-afbeeldingen van alle 12 afbeeldingskanalen en hulpmiddelen voor het aanpassen van afbeeldingen (bijvoorbeeld zoomen, celpopulatieselectie, kleurverandering, masker en aanpassing van afbeeldingseigenschappen). Het stroomcytometrie-analysegebied (linksonder) bevat een werkbalk voor flowcytometrie-analyse, zoals histogramplot, scatterplot, verschillende regio-gating, lay-out en populatiestatistieken. Het configuratiescherm (rechts) bevat menu's voor gegevensverzameling en -opslag, verlichtingsinstelling, vergroting, fluidics-snelheidsregeling, focus en centreren. (B) Selectie van eencellige populatie. (C) Selectie van gerichte celpopulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visualisatie en kwantificering van senescente cellen op eencellig niveau. Representatieve beelden (linkerpaneel) en flowcytometrieanalyse van C12FDG+EdU-γH2AX+ senescente cellen (rechterpaneel) van (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1, en (D) SU-DHL6 cellen behandeld met 5 μg/ml MAF of 20 ng/ml DN gedurende 5 dagen en gekleurd voor fSA-β-gal, EdU en γH2AX. Dmso-behandelde cellen werden gebruikt als controle. Afkortingen: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine; γH2AX = gefosforyleerde vorm van histon H2AX; DMSO = dimethylsulfoxide; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicine; fSA-β-gal = fluorescentie-gebaseerde senescentie-geassocieerde β-galactosidase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Op beeldvorming gebaseerde kwantificering van nucleaire γH2AX-foci in senescente cellen. (A) Representatieve beelden van γH2AX-foci in DLBCL-cellen (zie de tekst van figuur 2 voor behandelings- en kleuringsdetails). (B) Frequentie (links) en kwantificering (rechts) van γH2AX foci tellingen in DLBCL cellen. Afkortingen: γH2AX = gefosforyleerde vorm van histon H2AX; DMSO = dimethylsulfoxide; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Opmerkingen | |
| 10 mM EdU oplossing in DMSO | Bewaren bij -20 °C. | |
| 20 mM C12FDG oplossing in DMSO | Bewaren bij -20 °C. | |
| 100 mM chloroquine-oplossing in gedeïoniseerd water | Bewaren bij -20 °C. | |
| 100 mM PETG-oplossing in gedeïoniseerd water | Bewaren bij -20 °C. | |
| Fixatie-oplossing: 4% PFA (paraformaldehyde) in PBS | vers bereid; LET OP: PFA is schadelijk. Gebruik met de juiste voorzorgsmaatregelen. | |
| Permeabilisatiebuffer: 1% saponine (w/v), 3% BSA (w/v) in PBS, vers bereid. | vers bereid | |
| Antilichaam incubatie oplossing: 0,1% saponine (w/v), 3% BSA (w/v) in PBS | vers bereid | |
| Wasoplossing: 0,1% saponine (w/v), 0,5% BSA (w/v) in PBS | vers bereid | |
| EdU-detectiecocktail: Verdun CuSO4 (100 mM) bij 1:50, pacific blue azide-oplossing bij 1:200 en reactiebufferadditief (200 mg / ml) bij 1:100 in PBS | vers bereid | |
Tabel 1: Oplossingen voor vlekken.
Aanvullende figuur S1: Compensatiematrix van EdU-pacific blue, C12FDG-fluoresceïne en AF647-γH2AX. Afkortingen: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine; γH2AX = gefosforyleerde vorm van histon H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Therapie-geïnduceerde senescentie van DLBCL-cellijnen. (A) Conventionele SA-β-gal kleuring (linkerpaneel) en kwantificering (rechterpaneel) van aangegeven DLBCL-cellijnen behandeld met 5 μg/ ml MAF of 20 ng / ml DN. Schaalstaven = 50 μm. (B) Percentage celdood geanalyseerd door flowcytometrie (linkerpaneel) en kwantificering (rechterpaneel) van DLBCL-cellijnen zoals in A. Cellen werden gekleurd met spookkleurstof-pacific blauw bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Afkortingen: DMSO = dimethylsulfoxide; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicine; SA-β-gal = senescentie-geassocieerd β-galactosidase. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Representatieve beelden en flowcytometrie-analyse. (A) Representatieve beelden en flowcytometrieanalyse van C12FDG+EdU-Ki67+ senescente cellen (B) van KARPAS422- en WSU-DLCL2-cellen behandeld met MAF gedurende 5 dagen en gekleurd voor fSA-β-gal, EdU en Ki67. Dmso-behandelde cellen werden gebruikt als controle. Afkortingen: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine; DMSO = dimethylsulfoxide; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicine; fSA-β-gal = fluorescentie-gebaseerde senescentie-geassocieerde β-galactosidase. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode onderzocht het senescentie-enter vermogen van vier verschillende DLBCL-cellijnen bij chemotherapiebehandeling, met bright-field imaging en flowcytometrie-gebaseerde kwantificering. Op eencellig niveau hebben we met succes belangrijke C12FDG + EdU-Ki67 + senescente populaties gedetecteerd in behandelde KARPAS422- en WSU-DLCL2-cellen, en in mindere mate in OCI-LY1-cellen, terwijl de SU-DHL6-cellijn resistent was tegen de behandeling. Het verschil in senescentie-enter vermogen tussen cellijnen kan worden verklaard door hun verschillende genomische defecten 16,17. Ongepaste celkweekdichtheid of medicijnconcentratie kunnen echter ook de induceerbaarheid van senescentie beïnvloeden. Seriële verdunningen van celdichtheid en geneesmiddelconcentratie moeten zorgvuldig worden geselecteerd voor een uitgebreider onderzoek. Met name was deze methode gevoelig genoeg om de natuurlijk voorkomende senescente populatie in DLBCL-cellen nauwkeurig te detecteren zonder extra genotoxische stimulatie (C12FDG+ EdU-Ki67+ dmso-behandelde groep in figuur 3).
Het niveau van β-galactosidase-activiteit en het ritme van DNA-synthese variëren aanzienlijk tussen verschillende celtypen. De opgegeven incubatietijd (d.w.z. 3 uur voor EdU en 1 uur voor C12FDG) is over het algemeen voldoende om positieve en negatieve kleuring in vitro te onderscheiden. In speciale omstandigheden (bijv. langzaam groeiende cellen of cellen met extreem hoge β-galactosidase-activiteit) kan het echter nodig zijn om de EdU-etikettering te verlengen of C12FDG-kleuring te verkorten voor een betere discriminatie. Er wordt voorgesteld om een proefexperiment uit te voeren met een seriële incubatietijd om de experimentele omstandigheden te optimaliseren (bijvoorbeeld 30 minuten toename of 15 minuten afname voor respectievelijk EdU of C12FDG). Om de verschillen in fSA-β-gal tussen prolifererende cellen en hun senescente tegenhangers beter te onderscheiden, wordt pre-cubatie met chloroquine of bafilomycine A1 aanbevolen om de basale lysosomale activiteit te verlagen door lysosomale alkalinisatie te induceren18,19. Voor cellen met een relatief lage lysosomale activiteit kan de pre-incubatiestap worden weggelaten.
Intacte celmembraanstructuur is essentieel voor fSA-β-gal detectie. Bij deze methode gebruikten we EdU in plaats van BrdU (5-broom-2'-deoxyuridine) om DNA-synthese te meten. In vergelijking met BrdU-opname heeft EdU een relatief milde kleuringsconditie nodig, die de intacte membraanstructuur behoudt en co-kleuring met fSA-β-gal mogelijk maakt. Met name antilichaamgemedieerde detectie van intracellulaire of nucleaire eiwitten (bijv. γH2AX) die hier wordt beschreven, heeft ook permeabilisatie van het celmembraan nodig om antilichaamtoegang mogelijk te maken. Hier werd saponine ingeruild voor het sterke wasmiddel Triton X-100 om te voorkomen dat het fSA-β-galsignaal doofde.
Chemotherapeutische behandeling veroorzaakt niet alleen senescentie, maar ook celdood in DLBCL-cellen. Dode cellen kunnen een niet-verwaarloosbare impact hebben bij het kwantificeren van de senescentiepopulatie, omdat ze kunnen resulteren in valse positieven of vals-negatieven tijdens het kleuren. Hoewel het grootste deel van het celafval en kleine dode cellichamen worden uitgesloten tijdens meerdere was- en centrifugatiestappen, kan de resterende dode celpopulatie nog steeds een niet-verwaarloosbare invloed hebben. Er wordt voorgesteld om de medicijnconcentratie te optimaliseren om drastische celdood te voorkomen. Bovendien kan kleuring van de levensvatbaarheid van cellen (bijv. Spookkleurstof) worden gebruikt om het discrimineren van dode celpopulaties en het nauwkeuriger kwantificeren van de senescentiepopulatie te vergemakkelijken.
Het geavanceerde imaging flow cytometry systeem dat in deze methode wordt gebruikt, is een multi-channel imaging flow cytometer, die het mogelijk maakt om flow-cytometrie-gebaseerde metingen te kwantificeren en multi-color beelden van afzonderlijke cellen parallel te inspecteren. Het biedt een snelle, efficiënte en nauwkeurige kwantitatieve oplossing voor senescentiedetectie en genereert in de tussentijd afbeeldingen met een resolutie van één cel, meerdere kleuren met ruimtelijke informatie van meerdere markeringen. Er blijven echter enkele beperkingen bestaan. De beeldresolutie is bijvoorbeeld beperkt in vergelijking met de high-end microscoop, wat een uitgebreide analyse van subcellulaire lokalisatie belemmert bij het volgen van eiwitten in kleinere organellen anders dan de kern. In vergelijking met geavanceerde besturings- en analysesoftware van een standaard flowcytometer, is het minder handig en minder efficiënt om populatie-gatingstrategieën op te zetten of te wijzigen. Kwantificering en statistische analyse zijn ook ingewikkelder.
fSA-β-gal kleuring heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van conventionele SA-β-gal voor snelle kleuring en onbevooroordeelde kwantificering en heeft het potentieel voor de effectieve classificatie van senescente cellen. Deze techniek is met succes toegepast om te screenen op senescente cellen die opnieuw de celdelingscyclusingaan 3,18,19,20. In deze methode zijn we een stap verder gegaan om fSA-β-gal te combineren met EdU en γH2AX voor het nauwkeuriger en betrouwbaarder identificeren van senescente cellen. Met name, hoewel fSA-β-gal, EdU en γH2AX werden gekozen als senescentie-geassocieerde markers in deze methode, kunnen andere betrouwbare senescentiemarkers gemakkelijk worden aangepast om de drie markers te vervangen of toe te voegen. Vanwege de grote belangstelling voor senescentie in de academische wereld, zijn veel betrouwbare senescentie-geassocieerde markers geïdentificeerd, zoals verhoogde cytoplasmatische reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie, uitgescheiden SASP-factoren, gedownreguleerde Ki67, verlies van nucleair enveloppeiwit Lamin B1 en verhoogde heterochromatinemarker H3K9me321,22. Aanvullende figuur S3 toonde succesvolle detectie van C12FDG+EdU-Ki67- senescente populaties in TIS KARPAS422- en WSU-DLCL2-cellen.
Bovendien zijn er veel senescentieceloppervlakmarkers beschikbaar om met deze methode te worden getest, zoals ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 en uPAR. Detectie van celoppervlakmarkers vereist slechts een korte incubatietijd van antilichamen zonder celfixatie en permeabilisatie, wat de kleuringsprocedure verkort tot een workflow van 6 uur in combinatie met fSA-β-gal en EdU, of zelfs in een 2 uur-experiment in combinatie met alleen fSA-β-gal, en wat nog belangrijker is, het maakt live-cell imaging mogelijk. De aangepaste methode zou mogelijk kunnen dienen als een snelle, betrouwbare en haalbare aanpak in de kliniek om senescentiecellen in vivo te identificeren, niet alleen voor diagnostische en prognostische evaluatie, maar ook voor het ondersteunen van verdere senolytische interventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een beurs aan Yong Yu van de Johannes Kepler Universiteit Linz (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
