Summary
Nous présentons ici une méthode basée sur la cytométrie en flux pour la visualisation et la quantification de plusieurs marqueurs associés à la sénescence dans des cellules individuelles.
Abstract
Les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire des dommages irréparables à l’ADN dans les cellules cancéreuses, conduisant à l’apoptose ou à la sénescence prématurée. Contrairement à la mort cellulaire apoptotique, la sénescence est une machinerie fondamentalement différente qui restreint la propagation des cellules cancéreuses. Des décennies d’études scientifiques ont révélé les effets pathologiques complexes des cellules cancéreuses sénescentes dans les tumeurs et les microenvironnements qui modulent les cellules cancéreuses et les cellules stromales. De nouvelles preuves suggèrent que la sénescence est un facteur pronostique puissant pendant le traitement du cancer, et donc une détection rapide et précise des cellules sénescentes dans les échantillons de cancer est essentielle. Cet article présente une méthode pour visualiser et détecter la sénescence induite par le traitement (TIS) dans les cellules cancéreuses. Les lignées cellulaires diffuses de lymphome à grandes cellules B (LDGCB) ont été traitées avec du mafosfamide (MAF) ou de la daunorubicine (DN) et examinées pour le marqueur de sénescence, la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal), le marqueur de synthèse de l’ADN 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et le marqueur de dommages à l’ADN gamma-H2AX (γH2AX). L’imagerie par cytomètre en flux peut aider à générer des images unicellulaires à haute résolution en peu de temps pour visualiser et quantifier simultanément les trois marqueurs dans les cellules cancéreuses.
Introduction
Une variété de stimuli peut déclencher la sénescence cellulaire, amenant les cellules à entrer dans un état d’arrêt stable du cycle cellulaire. Ces stimuli comprennent des changements de signalisation intrinsèques ou des stress extrinsèques. Les signaux intrinsèques comprennent le raccourcissement progressif des télomères, les changements dans la structure des télomères, la modification épigénétique, les troubles de la protéostase, le dysfonctionnement mitochondrial et l’activation des oncogènes. Les stress extrinsèques comprennent les signaux de dommages inflammatoires et/ ou tissulaires, les traitements radiologiques ou chimiques et la privation nutritionnelle 1,2,3,4. Parmi les types distincts de sénescence, les plus fréquemment observés et les mieux étudiés sont la sénescence réplicative, la sénescence induite par l’oncogène (OIS), la sénescence radio-induite et la sénescence induite par la thérapie (TIS). L’OIS est une réponse cellulaire aiguë aux dommages génotoxiques causés par le stress réplicatif généré par l’activation aberrante de l’oncogène et peut dans une certaine mesure empêcher la progression pathologique d’une lésion prénéoplasique à une tumeur à part entière. TiS se produit lorsque les cellules tumorales sont stressées par des médicaments chimiothérapeutiques oudes rayonnements ionisants 5,6.
La sénescence est considérée comme une épée à double tranchant en pathologie en raison de sa nature très dynamique. Il a été initialement décrit comme un mécanisme bénéfique de suppression de tumeur pour éliminer les cellules endommagées du pool circulant de cellules en division, préservant le fonctionnement normal des organes et inhibant la croissance tumorale 7,8,9. Cependant, de nouvelles preuves ont suggéré un côté sombre de la sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent des cytokines pro-inflammatoires, connues sous le nom de phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP), conduisant à la fibrose et aux organes défectueux et favorisant l’initiation et la progression de la tumeur10. De plus, les cellules cancéreuses sénescentes subissent une reprogrammation épigénétique et d’expression génique parallèlement au remodelage de la chromatine et à l’activation d’une réponse soutenue aux dommages à l’ADN (DDR)11,12, acquérant de nouvelles propriétés de cellules souches cancéreuses 3. Bien que les tumeurs capables de sénescence répondent mieux à l’intervention thérapeutique que les tumeurs incapables de sénescence13, la persistance des cellules sénescentes peut entraîner un mauvais pronostic à long terme si elles ne sont pas efficacement identifiées et éliminées par les médicaments sénolytiques5. Quoi qu’il en soit, une méthode fiable pour évaluer la sénescence présente un intérêt clinique important, non seulement pour le pronostic du traitement thérapeutique, mais également pour le développement de nouvelles stratégies ciblant les cellules sénescentes.
Indépendamment des différents déclencheurs, les cellules sénescentes présentent certaines caractéristiques communes, notamment une morphologie élargie, aplatie et multinucléée avec de grandes vacuoles, des noyaux significativement dilatés, la formation d’hétérochromatine associée à la sénescence (SAHF) riche en H3K9me3 dans le noyau, l’accumulation persistante de foyers de marqueurs de dommages à l’ADN γH2AX, activé p53-p21CIP1 et Rb-p16INK4a les mécanismes de régulation du cycle cellulaire, l’arrêt stable du cycle cellulaire G1, l’induction massive de SASP et l’activité élevée de la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal)14. Étant donné qu’aucun marqueur unique n’est suffisant pour définir la sénescence, la coloration enzymatique pour l’activité SA-β-gal, qui est considérée comme l’étalon-or pour la détection de la sénescence, est généralement associée à une coloration immunohistochimique pour H3K9me3 et Ki67 pour détecter TIS15. Cependant, le SA-β-gal chimique à base de chromogène est difficile à quantifier. Ici, nous avons combiné la détection de SA-β-gal (fSA-β-gal) à base de fluorescence 5-dodécanoylaminofluorescéine-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) à base de fluorescence SA-β-gal) avec une coloration immunofluorescente pour l’ADN incorporé à γH2AX et EdU pour identifier les cellules sénescentesC12FDG + EdU-γH2AX + à l’aide du système de cytomètre en flux d’imagerie avancée, qui combine la vitesse, la sensibilité et les images unicellulaires détaillées avec des informations spatiales qui ne peuvent pas être fournies par la cytométrie en flux et la microscopie. Cette méthode permet la génération rapide d’images haute résolution permettant le positionnement et la quantification des signaux fluorescents dans les cellules, tout en autorisant l’analyse rapide de plusieurs échantillons en construisant des pipelines standard.
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Protocol
1. Lignées cellulaires du LDGCB avec traitement au mafosfamide ou à la daunorubicine pour induire la sénescence cellulaire
REMARQUE: Le protocole fonctionne également pour les cellules cancéreuses adhérentes. Selon la taille de la cellule, ensemencez 1 à 2 × 105 cellules dans un puits d’une plaque de 6 puits et incubez la plaque dans un incubateur à 5% de CO2, 37 ° C pendant la nuit avant le traitement. Les étapes du protocole sont les mêmes que pour les cellules de suspension, mais à deux exceptions près. Tout d’abord, les cellules doivent être trypsinisées sur la plaque après l’étape 3.4. Deuxièmement, les étapes de lavage sont effectuées sans centrifugation avant la trypsinisation.
- Compter les cellules du LDGCB et ensemencer 1 × 106 cellules/mL dans 4 mL de milieu par puits dans une plaque de culture de 6 puits. Cultiver des cellules du LDGCB dans un milieu RPMI-1640 complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 100 U / mL de pénicilline / streptomycine.
- Ajouter le MAF (5 μg/mL) ou le DN (20 ng/mL) dans la culture cellulaire et bercer doucement la plaque pour mélanger.
REMARQUE : MAF et DN ne sont pas stables. Après dissolution dans le DMSO, la solution mère doit être aliquotedée et stockée à -20 °C. Les cycles de gel/dégel doivent être évités. - Incuber la plaque dans un incubateur à 5% de CO2, 37 °C pendant 3 jours.
- Après une incubation de 3 jours, prélever les cellules DLBCL dans des tubes centrifuges stériles de 15 mL et les faire tourner à 100 × g, 4 °C pendant 5 min.
- Jetez le surnageant, remettez en suspension les granulés de cellule avec 4 mL de milieu frais et ajoutez les suspensions dans la plaque à 6 puits.
- Cultivez la plaque cellulaire dans un incubateur à 5 % de CO2, 37 °C pendant encore 2 jours avant de la récolter pour analyse.
2. Préparer les solutions pour la coloration (tableau 1)
3. Tacher les cellules DLBCL avec différents marqueurs de sénescence
REMARQUE: Les échantillons cellulaires colorés avec des marqueurs individuels (c.-à-d. bleu-EdU pacifique, C12FDG ou Alexa Fluor 647-γH2AX) sont préparés pour générer une matrice de compensation afin de corriger le débordement de fluorescence pendant la mesure. Bien que fortement suggérée, cette étape pourrait être suspendue lorsqu’il y a un chevauchement omis (valeur du coefficient de compensation ≤ 0,1) des spectres d’émission entre différents fluorophores. Cependant, les utilisateurs doivent déterminer des étapes de compensation normalisées lorsqu’ils utilisent différents instruments et panneaux fluorescents.
- Ajouter une solution d’EdU de 10 mM dans un rapport de 1:1 000 dans la culture cellulaire DLBCL générée à partir de l’étape 1.6 (la concentration finale d’EdU est de 10 μM). Bercez doucement la plaque pour mélanger et incuber dans un incubateur à 5% de CO2, 37 °C pendant 3 h.
- Sortez la plaque de l’incubateur et ajoutez une solution de chloroquine de 100 mM à une concentration finale de 75 μM (voir la discussion). Bercez doucement la plaque pour mélanger et incuber dans un incubateur à 5% de CO2, 37 °C pendant 30 min.
- Sortir la plaque de l’incubateur et ajouter 20 mM de solution de FDG enC12à 1:1 000 à une concentration finale deC12FDG de 20 μM. Secouez doucement la plaque pour mélanger et incuber dans un incubateur à 5 % de CO2, 37 °C pendant 1 h.
- Sortez la plaque de l’incubateur et ajoutez 100 mM de solution de 2-phényléthyl-β-D-thiogalactoside (PETG) à 1:50 pour arrêter la coloration fSA-β-gal (concentration finale de PETG de 2 mM). Faites pivoter doucement la plaque pour mélanger.
- Transférer les cellules dans des tubes centrifuges stériles de 15 mL et tourner à 100 × g, 4 °C pendant 5 min. Jetez le surnageant et lavez les cellules avec 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Répétez l’étape de lavage PBS. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 500 μL de solution de fixation de paraformaldéhyde à 4 %.
- Après 10 min d’incubation à température ambiante, centrifuger à 250 × g, température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et laver les cellules avec 4 mL de PBS.
- Répétez l’étape de lavage PBS. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de perméabilisation de la saponine et transférer la suspension dans un nouveau tube de 1,5 mL. Après 10 min d’incubation à température ambiante, centrifuger à 250 × g, température ambiante pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 200 μL de solution d’anticorps primaires (anticorps 1:500 γH2AX dans une solution d’incubation d’anticorps). Incuber à 4 °C pendant la nuit dans l’obscurité.
- Centrifuger les tubes à 250 × g, 4 °C pendant 5 min. Jeter le surnageant et laver avec 100 μL de solution de lavage à la saponine.
- Répétez l’étape de lavage deux fois de plus. Jetez le surnageant et remettez en suspension les pastilles cellulaires dans 500 μL de cocktail de détection EdU.
- Incuber à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité. Centrifuger à 250 × g, température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et laver avec 1 mL de solution de lavage à la saponine.
- Répétez l’étape de lavage deux fois. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 20 à 50 μL de PBS. Passez à la section 4 pour la mesure de l’échantillon.
4. Marqueurs de sénescence d’imagerie à l’aide du système de cytomètre en flux d’imagerie
- Videz le flacon de liquide résiduaire. Vérifiez les niveaux de perles de vitesse, de stérilisateur, de nettoyant, de débublant, de gaine et de réactifs de rinçage (eau désionisée) pour vous assurer qu’il y a suffisamment de liquides avant d’allumer l’instrument (voir le tableau des matériaux).
- Allumez l’instrument et le logiciel d’imagerie (voir l’interface du logiciel à la Figure 1A).
- Cliquez sur le bouton Démarrage pour initialiser la fluidique et l’étalonnage du système.
REMARQUE: Cette procédure prend environ 45 min. - Réglez le grossissement sur 40x, réglez la vitesse fluidique sur faible et allumez les lasers nécessaires à l’expérience. Activez les lasers 405 nm, 488 nm et 642 nm pour mesurer respectivement le bleu EdU-pacifique, le C12FDG et l’Alexa Fluor 647-γH2AX (ou Alexa Fluor 647-Ki67). Réglez Ch6 pour le canal de diffusion et Ch1 et Ch9 pour le champ lumineux.
- Commencez par l’échantillon qui devrait avoir la fluorescence la plus élevée pour mettre en place l’intensité des lasers. Retournez doucement le tube d’échantillon pour mélanger. Ouvrez le couvercle du tube et insérez le tube d’échantillonnage sur la station d’accueil. Cliquez sur Charger pour commencer.
- Ouvrez un nuage de points et sélectionnez les fonctions Area_M01 et Aspect Ratio_M01 pour les axes X et Y, respectivement. Définissez une porte au-dessus du rapport d’aspect de 0,5 pour exclure les doublets et les agrégats de cellules en dessous et sur le côté droit, ainsi que la population de billes de vitesse sur le côté gauche (Figure 1B).
- Ouvrez un histogramme et sélectionnez la fonction Dégradé RMS_M01_Ch01 pour l’axe X. Choisissez la population de singlets et définissez la porte pour sélectionner les cellules focalisées (Figure 1C).
REMARQUE: Le système d’imagerie utilisera automatiquement des perles de vitesse pour ajuster la mise au point pour l’imagerie. Cependant, il est recommandé de sélectionner la moitié droite du pic d’histogramme pour la population la mieux ciblée. - Ouvrez un histogramme et sélectionnez Intensités maximales de pixels brutes pour l’axe X pour chaque couche de couleur (Ch2, 7 et 11). Ajustez les puissances laser (c’est-à-dire les lasers 488 nm, 405 nm et 642 nm pour les lasers Ch2, 7 et 11, respectivement), de sorte que chaque fluorochrome ait une valeur Raw Max Pixel comprise entre 100 et 4 000 pour éviter une sursaturation.
REMARQUE: Pour cette expérience, le réglage de la puissance laser est de 50 mW, 200 mW et 50 mW pour les lasers 488 nm, 405 nm et 642 nm, respectivement. - Choisissez la population ciblée à enregistrer et cliquez sur Acquérir pour mesurer les échantillons DLBCL avec des paramètres cohérents. Lorsque vous changez d’échantillon pour la mesure, cliquez sur Retour pour récupérer le tube d’échantillon. Appuyez sur Charger pour ignorer l’exemple.
- Une fois tous les échantillons mesurés, éteignez le laser à champ lumineux et diffusez. Mesurez des échantillons de contrôle unicolores pour générer une matrice de compensation.
- Cliquez sur Arrêter pour fermer le système d’imagerie.
- Analysez les données dans le logiciel d’analyse d’images.
- Utilisez l’outil Spot Wizard du logiciel d’analyse d’images pour compter et quantifier automatiquement les foyers nucléaires γH2AX dans les images de cellules vivantes. Sélectionnez deux populations de cellules (une avec un nombre de points élevé et une avec un nombre de points faible) pour entraîner l’assistant de spot pour une analyse automatique du nombre de points.
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Representative Results
Une matrice de compensation a été générée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images en chargeant les données enregistrées d’échantillons de contrôle unicolores. Comme le montre la figure supplémentaire S1, un débordement de lumière non négligeable (valeur du coefficient ≥ 0,1) de l’EdU auC12FDG a été détecté avec une valeur de coefficient de diaphonie de 0,248, tandis que la diaphonie entre les autres canaux n’était pas significative. Quatre lignées cellulaires différentes de LDGCB ont été traitées avec 5 μg/mL maF ou 20 ng/mL DN pour induire la sénescence cellulaire et analysées à l’aide de la coloration SA-β-gal conventionnelle ou de la méthode d’imagerie par cytométrie en flux.
Plus de 70 % des cellules KARPAS422, WSU-DLCL2 et OCI-LY1 sont entrées dans un statut de sénescence, indiqué par un SA-β-gal positif, tandis que SU-DHL6 était entièrement résistant à l’induction de sénescence par MAF et DN (figure supplémentaire S2A). Notamment, le MAF et le DN ont également induit la mort cellulaire dans toutes les cellules du LDGCB, mais pas de manière spectaculaire (figure supplémentaire S2B). En utilisant la méthode d’imagerie par cytométrie en flux, les images unicellulaires et la quantification basée sur la cytométrie en flux ont montré une augmentation de la population sénescente C12FDG + EdU-γH2AX + dans KARPAS422, WSU-DLCL2 et OCI-LY1, mais pas dans les cellules SU-DHL6 (Figure 2A-D), ce qui était cohérent avec les résultats conventionnels de coloration SA-β-gal. Cependant, le pourcentage de la population sénescenteC12FDG+EdU-γH2AX+ était significativement inférieur à la méthode conventionnelle de coloration SA-β-gal (figure 2 et figure supplémentaire S2).
De plus, l’analyse par cytométrie en flux par imagerie a montré une inductibilité de sénescence diverse entre différentes lignées cellulaires de LDGCB, qui n’était pas clairement distinguée par la coloration SA-β-gal conventionnelle. Le pourcentage de cellules OCI-LY1 sénescentes C12FDG+EdU-γH2AX+ (c.-à-d. 43,2 % et 31,9 % avec MAF et DN, respectivement), était significativement inférieur à celui de KARPAS422 (62,2 % et 73,8 % avec MAF et DN, respectivement) et WSU-DLCL2 (60 % et 58,1 % avec MAF et DN, respectivement) (Figure 2). Il est important de noter que l’analyse basée sur l’imagerie a présenté un nombre significativement plus élevé de foyers γH2AX dans KARPAS422, WSU-DLCL2 et OCI-LY1, mais pas dans les cellules SU-DHL6 (Figure 3A, B).
Figure 1 : Interface du logiciel d’exploitation et configuration de l’instrument. (A) Interface logicielle du cytomètre en flux d’imagerie. Le panneau d’images de cellules actives (en haut à gauche) contient des images de cellules actives des 12 couches d’image et des outils de réglage d’image (par exemple, zoom, sélection de la population de cellules, changement de couleur, masque et ajustement des propriétés de l’image). La zone d’analyse de cytométrie en flux (en bas à gauche) contient une barre d’outils pour l’analyse de cytométrie en flux, telle qu’un histogramme, un nuage de points, diverses statistiques de région, de disposition et de population. Le panneau de commande (à droite) contient des menus pour l’acquisition et l’enregistrement des données, le réglage de l’éclairage, le grossissement, le contrôle de la vitesse fluidique, la mise au point et le centrage. (B) Sélection de la population unicellulaire. (C) Sélection de la population cellulaire ciblée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Visualisation et quantification des cellules sénescentes au niveau d’une seule cellule. Images représentatives (panneau de gauche) et analyse par cytométrie en flux de cellules sénescentesC12FDG+EdU-γH2AX+ (panneau de droite) de cellules (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1 et (D) SU-DHL6 traitées avec 5 μg/mL MAF ou 20 ng/mL DN pendant 5 jours et colorées pour fSA-β-gal, EdU et γH2AX. Des cellules traitées au DMSO ont été utilisées comme témoins. Abréviations :C12FDG = 5-dodécanoylaminofluorescéine-di-β-dgalactopyranoside; EdU = 5-éthyynyl-2′-désoxyuridine; γH2AX = forme phosphorylée de l’histone H2AX; DMSO = diméthylsulfoxyde; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicine; fSA-β-gal = β-galactosidase associée à la sénescence à base de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification par imagerie des foyers nucléaires γH2AX dans les cellules sénescentes. (A) Images représentatives des foyers γH2AX dans les cellules DLBCL (voir le texte de la Figure 2 pour les détails du traitement et de la coloration). (B) Fréquence (à gauche) et quantification (à droite) du nombre de foyers γH2AX dans les cellules du LDGCB. Abréviations : γH2AX = forme phosphorylée de l’histone H2AX ; DMSO = diméthylsulfoxyde; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution | Commentaires | |
| Solution EdU 10 mM dans DMSO | Conserver à -20 °C. | |
| Solution FDG 20 mM C12dans DMSO | Conserver à -20 °C. | |
| Solution de chloroquine de 100 mM dans de l’eau désionisée | Conserver à -20 °C. | |
| Solution petG de 100 mM dans de l’eau désionisée | Conserver à -20 °C. | |
| Solution de fixation : 4 % de PFA (paraformaldéhyde) dans le PBS | fraîchement préparé; ATTENTION : Le PFA est nocif. Utiliser avec les précautions appropriées. | |
| Tampon de perméabilisation : 1 % de saponine (p/v), 3 % de BSA (p/v) dans le PBS, fraîchement préparé. | fraîchement préparé | |
| Solution d’incubation d’anticorps : 0,1 % de saponine (p/v), 3 % de BSA (p/v) dans le PBS | fraîchement préparé | |
| Solution de lavage : 0,1 % de saponine (p/v), 0,5 % de BSA (p/v) dans le PBS | fraîchement préparé | |
| Cocktail de détection EdU : Diluer CuSO4 (100 mM) à 1:50, solution d’azoture bleu pacifique à 1:200 et additif tampon de réaction (200 mg/mL) à 1:100 dans PBS | fraîchement préparé | |
Tableau 1 : Solutions pour la coloration.
Figure supplémentaire S1 : Matrice de compensation du bleu EdU-pacifique, de la fluorescéineC12FDG et de l’AF647-γH2AX. Abréviations :C12FDG = 5-dodécanoylaminofluorescéine-di-β-dgalactopyranoside; EdU = 5-éthyynyl-2′-désoxyuridine; γH2AX = forme phosphorylée de l’histone H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Sénescence induite par le traitement des lignées cellulaires du LDGCB. (A) Coloration SA-β-gal conventionnelle (panneau de gauche) et quantification (panneau de droite) des lignées cellulaires de LDGCB indiquées traitées avec 5 μg/mL MAF ou 20 ng/mL DN. Barres d’échelle = 50 μm. (B) Pourcentage de mort cellulaire analysée par cytométrie en flux (panneau de gauche) et quantification (panneau de droite) de lignées cellulaires de DLBCL comme dans A. Les cellules ont été colorées avec du bleu pacifique à colorant fantôme à température ambiante pendant 15 minutes. Abréviations : DMSO = diméthylsulfoxyde; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicine; SA-β-gal = β-galactosidase associée à la sénescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Images représentatives et analyse de cytométrie en flux. (A) Images représentatives et analyse par cytométrie en flux de cellules sénescentes (B)C12FDG+EdU-Ki67+ de cellules KARPAS422 et WSU-DLCL2 traitées par MAF pendant 5 jours et colorées pour fSA-β-gal, EdU et Ki67. Des cellules traitées au DMSO ont été utilisées comme témoins. Abréviations :C12FDG = 5-dodécanoylaminofluorescéine-di-β-dgalactopyranoside; EdU = 5-éthyynyl-2′-désoxyuridine; DMSO = diméthylsulfoxyde; MAF = mafosfamide; DN = daunorubicine; fSA-β-gal = β-galactosidase associée à la sénescence à base de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Cette méthode a examiné la capacité d’entrée de sénescence de quatre lignées cellulaires différentes de LDGCB lors d’un traitement de chimiothérapie, avec une imagerie en champ lumineux et une quantification basée sur la cytométrie en flux. Au niveau unicellulaire, nous avons détecté avec succès d’importantes populations sénescentes C12FDG+EdU-Ki67+ dans les cellules KARPAS422 et WSU-DLCL2 traitées, et dans une moindre mesure dans les cellules OCI-LY1, tandis que la lignée cellulaire SU-DHL6 était résistante au traitement. La différence dans la capacité d’entrée de sénescence entre les lignées cellulaires peut être expliquée par leurs défauts génomiques distincts16,17. Cependant, une densité de culture cellulaire ou une concentration de médicament inappropriée peut également influencer l’inductibilité à la sénescence. Les dilutions en série de la densité cellulaire et de la concentration du médicament doivent être soigneusement sélectionnées pour un examen plus complet. Notamment, cette méthode était suffisamment sensible pour détecter avec précision la population sénescente naturelle dans les cellules du LDGCB sans stimulation génotoxique supplémentaire (groupe traité par DMSO enC12FDG + EdU-Ki67 + dans la figure 3).
Le niveau d’activité de la β-galactosidase et le rythme de synthèse de l’ADN varient considérablement entre les différents types de cellules. Le temps d’incubation indiqué (c.-à-d. 3 h pour l’EdU et 1 h pour le FDGC12) est généralement suffisant pour distinguer les colorations positives et négatives in vitro. Cependant, dans des circonstances particulières (par exemple, des cellules à croissance lente ou des cellules à β-galactosidase extrêmement élevée), il peut être nécessaire de prolonger le marquage EdU ou de raccourcir la coloration C12FDG pour une meilleure discrimination, respectivement. Il est suggéré d’effectuer une expérience pilote avec un temps d’incubation en série pour optimiser les conditions expérimentales (par exemple, augmentation de 30 minutes ou diminution de 15 minutes pour l’EdU ou le C12FDG, respectivement). Pour mieux distinguer les différences de fSA-β-gal entre les cellules proliférantes et leurs homologues sénescentes, la préincubation avec de la chloroquine ou de la bafilomycine A1 est recommandée pour abaisser l’activité lysosomale basale en induisant une alcalinisation lysosomale18,19. Pour les cellules ayant une activité lysosomale relativement faible, l’étape de préincubation peut être omise.
La structure intacte de la membrane cellulaire est essentielle pour la détection de l’β-gal. Dans cette méthode, nous avons utilisé EdU au lieu de BrdU (5-bromo-2'-désoxyuridine) pour mesurer la synthèse de l’ADN. Par rapport à l’incorporation de BrdU, l’EdU a besoin d’une condition de coloration relativement légère, ce qui préserve la structure intacte de la membrane et permet la co-coloration avec fSA-β-gal. Notamment, la détection médiée par les anticorps de protéines intracellulaires ou nucléaires (par exemple, γH2AX) décrite ici nécessite également une perméabilisation de la membrane cellulaire pour permettre l’entrée des anticorps. Ici, la saponine a été échangée contre le détergent puissant Triton X-100 pour éviter la trempe du signal fSA-β-gal.
Le traitement chimiothérapeutique déclenche non seulement la sénescence, mais aussi la mort cellulaire dans les cellules du LDGCB. Les cellules mortes peuvent avoir un impact non négligeable lors de la quantification de la population de sénescence, car elles peuvent entraîner des faux positifs ou des faux négatifs lors de la coloration. Bien que la plupart des débris cellulaires et des cadavres de petite taille soient exclus lors de multiples étapes de lavage et de centrifugation, la population restante de cellules mortes peut encore avoir une influence non négligeable. Il est suggéré d’optimiser la concentration de médicaments pour éviter la mort cellulaire drastique. De plus, la coloration de la viabilité cellulaire (p. ex., colorant fantôme) peut être utilisée pour faciliter la discrimination de la population de cellules mortes et la quantification plus rigoureuse de la population de sénescence.
Le système avancé de cytométrie en flux d’imagerie utilisé dans cette méthode est un cytomètre de flux d’imagerie multicanal, qui permet de quantifier les mesures basées sur la cytométrie en flux et d’inspecter des images multicolores de cellules individuelles en parallèle. Il fournit une solution quantitative rapide, efficace et précise pour la détection de sénescence et, en attendant, génère des images multicolores à résolution unicellulaire avec des informations spatiales de plusieurs marqueurs. Cependant, certaines limitations persistent. Par exemple, la résolution de l’image est limitée par rapport au microscope haut de gamme, ce qui empêche une analyse complète de la localisation subcellulaire lors du suivi des protéines situées dans des organites plus petits autres que le noyau. Comparé au logiciel sophistiqué d’exploitation et d’analyse d’un cytomètre en flux standard, il est moins pratique et moins efficace de mettre en place ou de modifier des stratégies de contrôle de la population. La quantification et l’analyse statistique sont également plus compliquées.
La coloration fSA-β-gal présente des avantages significatifs par rapport à la SA-β-gal conventionnelle pour une coloration rapide et une quantification impartiale et a le potentiel de classification efficace des cellules sénescentes. Cette technique a été appliquée avec succès pour dépister les cellules sénescentes qui rentrent dans le cycle de division cellulaire 3,18,19,20. Dans cette méthode, nous avons fait un pas de plus pour combiner fSA-β-gal avec EdU et γH2AX pour identifier les cellules sénescentes de manière plus précise et fiable. Notamment, bien que fSA-β-gal, EdU et γH2AX aient été choisis comme marqueurs associés à la sénescence dans cette méthode, d’autres marqueurs de sénescence fiables peuvent être facilement adaptés pour remplacer ou ajouter aux trois marqueurs. En raison du grand intérêt pour la sénescence dans le milieu universitaire, de nombreux marqueurs fiables associés à la sénescence ont été identifiés, tels que la production élevée d’espèces réactives cytoplasmiques de l’oxygène (ROS), les facteurs SASP sécrétés, le Ki67 régulé à la baisse, la perte de la protéine d’enveloppe nucléaire Lamin B1 et l’augmentation du marqueur hétérochromatine H3K9me321,22. La figure supplémentaire S3 a montré une détection réussie des populations sénescentes C12FDG+ EdU-Ki67- dans les cellules TIS KARPAS422 et WSU-DLCL2.
De plus, il existe de nombreux marqueurs de surface cellulaire de sénescence disponibles pour être testés à l’aide de cette méthode, tels que ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 et uPAR. La détection des marqueurs de surface cellulaire ne nécessite qu’un court temps d’incubation des anticorps sans fixation cellulaire ni perméabilisation, ce qui raccourcira la procédure de coloration en un flux de travail de 6 h en combinaison avec fSA-β-gal et EdU, ou même en une expérience de 2 h en combinaison avec fSA-β-gal uniquement, et plus important encore, elle permet l’imagerie de cellules vivantes. La méthode modifiée pourrait potentiellement servir d’approche rapide, fiable et réalisable en clinique pour identifier les cellules de sénescence in vivo, non seulement pour le diagnostic et l’évaluation pronostique, mais aussi pour soutenir une intervention sénolytique ultérieure.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention à Yong Yu de l’Université Johannes Kepler de Linz (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
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