Summary
כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.
Abstract
תרופות כימותרפיות יכולות לגרום לנזק בלתי הפיך לדנ"א בתאים סרטניים, מה שמוביל לאפופטוזיס או לסנסנציה מוקדמת. שלא כמו מוות של תאים אפופטוטיים, סנסנציה היא מנגנון שונה במהותו המרסן את התפשטותם של תאים סרטניים. עשרות שנים של מחקרים מדעיים חשפו את ההשפעות הפתולוגיות המורכבות של תאי סרטן סנסנטיים בגידולים ובמיקרו-סביבה המווסתים תאים סרטניים ותאים סטרומליים. ראיות חדשות מצביעות על כך שסנסנציה היא גורם פרוגנוסטי רב עוצמה במהלך הטיפול בסרטן, ולכן זיהוי מהיר ומדויק של תאים סנסנטיים בדגימות סרטן הוא חיוני. מאמר זה מציג שיטה לדמיין ולזהות סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול (TIS) בתאים סרטניים. קווי תאים מתפזרים של לימפומה של תאי B גדולים (DLBCL) טופלו באמצעות מאפוספמיד (MAF) או דאונורוביצין (DN) ונבדקו לאיתור סמן הסנסנציה, β-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה (SA-β-gal), סמן סינתזת הדנ"א 5-אתניל-2′-דאוקסיורידין (EdU), וסמן הנזק לדנ"א gamma-H2AX (γH2AX). הדמיית ציטומטר זרימה יכולה לסייע ביצירת תמונות חד-תאיות ברזולוציה גבוהה בפרק זמן קצר כדי לדמיין ולכמת בו-זמנית את שלושת הסמנים בתאים סרטניים.
Introduction
מגוון גירויים יכולים לגרום לסנסנציה תאית, ולגרום לתאים להיכנס למצב של עצירה יציבה של מחזור התא. גירויים אלה כוללים שינויי איתות פנימיים או לחצים חיצוניים. אותות פנימיים כוללים קיצור טלומרים פרוגרסיבי, שינויים במבנה הטלומרים, שינוי אפיגנטי, הפרעות פרוטאוסטזיס, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה והפעלה של אונקוגנים. לחצים חיצוניים כוללים אותות דלקת ו/או נזק לרקמות, קרינה או טיפול כימי, וחסך תזונתי 1,2,3,4. מבין הסוגים המובהקים של סנסנציה, הנפוצים ביותר הנראים והנחקרים היטב הם סנסנציה משכפלת, סנסנציה המושרה על ידי אונקוגן (OIS), סנסנציה המושרה על ידי קרינה וסנסנציה המושרה על ידי טיפול (TIS). OIS היא תגובה תאית חריפה לנזק גנוטוקסי הנגרם על ידי עקה משכפלת הנוצרת על ידי הפעלת אונקוגן חריגה ויכולה במידה מסוימת למנוע את ההתקדמות הפתולוגית מנגע קדם-אופלסטי לגידול מלא. TIS קורה כאשר תאי הגידול נלחצים על ידי תרופות כימותרפיות או קרינה מייננת 5,6.
Senescence נחשב חרב פיפיות בפתולוגיה בשל אופיו הדינמי מאוד. הוא תואר בתחילה כמנגנון מדכא גידול מועיל להסרת תאים פגומים ממאגר התאים המתחלקים במחזור הדם, תוך שמירה על תפקודם התקין של האיברים ועיכוב צמיחת הגידול 7,8,9. עם זאת, עדויות חדשות מצביעות על צד אפל של סנסנציה. תאים סנסנטיים מפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים, הידועים בשם פנוטיפ הפרשה הקשור לסנסנציה (SASP), מה שמוביל לפיברוזיס ואיברים לא תקינים ומקדם את התחלת הגידול והתקדמותו10. יתר על כן, תאים סרטניים סנסנטיים עוברים תכנות מחדש אפיגנטי וביטוי גנים במקביל לשיפוץ כרומטין והפעלה של תגובה מתמשכת של נזק לדנ"א (DDR)11,12, תוך רכישת תכונות חדשות של תאי סרטן-גזע3. אף על פי שגידולים בעלי יכולת סנסנסנציה מגיבים טוב יותר להתערבות טיפולית בהשוואה לגידולים שאינם מסוגלים לסנסנציה13, ההתמדה של תאים סנסנטיים עלולה להוביל לפרוגנוזה גרועה לטווח ארוך אם הם לא יזוהו ביעילות ויסולקו על ידי תרופות סנוליטיות5. כך או כך, שיטה אמינה להערכת סנסנציה היא בעלת עניין קליני משמעותי, לא רק לפרוגנוזה של הטיפול, אלא גם לפיתוח אסטרטגיות חדשניות המכוונות לתאים סנסנטיים.
ללא קשר לטריגרים שונים, תאים סנסנטיים מציגים כמה מאפיינים נפוצים, כולל מורפולוגיה מוגדלת, שטוחה ורב-גרעינית עם ואקואולות גדולות, גרעינים מורחבים באופן משמעותי, היווצרות של הטרוכרומטין עשיר בסנסנציה H3K9me3 (SAHF) בגרעין, הצטברות מתמשכת של סמן נזק לדנ"א γH2AX מוקדים, מופעל p53-p21CIP1 ו- Rb-p16INK4a מנגנוני ויסות מחזור התא, עצירת מחזור תאי G1 יציבה, אינדוקציה מסיבית של SASP ופעילות מוגברת הקשורה לסנסנציה β-גלקטוזידאז (SA-β-gal)14. מכיוון שאין מספיק סמן יחיד כדי להגדיר סנסנציה, צביעה אנזימטית עבור פעילות SA-β-gal, הנחשבת לתקן הזהב לזיהוי סנסנציות, משולבת בדרך כלל עם צביעה אימונוהיסטוכימית עבור H3K9me3 ו- Ki67 כדי לזהות TIS15. עם זאת, קשה לכמת SA-β-gal המבוסס על כרומוגניה כימית. כאן, שילבנו 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) מבוסס פלואורסצנציה מבוסס SA-β-gal (fSA-β-gal) עם צביעה אימונופלואורסנטית עבור γH2AX ו- DNA משולב EdU כדי לזהות C12FDG+EdU-γH2AX+ תאים סנסנטיים באמצעות מערכת ציטומטר זרימת ההדמיה המתקדמת, המשלבת את המהירות, הרגישות ותמונות מפורטות של תא יחיד עם מידע מרחבי שלא ניתן לספק על ידי ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה. שיטה זו מאפשרת יצירה מהירה של תמונות ברזולוציה גבוהה המאפשרת מיקום וכימות של אותות פלואורסצנטיים בתוך תאים, תוך מתן רישיון לניתוח מהיר של דגימות מרובות על ידי בניית צינורות סטנדרטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קווי תאים DLBCL עם טיפול באפוספמיד או דאונורוביצין כדי לגרום לסנסנציה תאית
הערה: הפרוטוקול פועל גם עבור תאים סרטניים חסידיים. בהתאם לגודל התא, זרע 1-2 × 105 תאים לתוך באר אחת של צלחת 6 בארות ולדגום את הצלחת באינקובטור 5% CO2, 37 °C לילה לפני הטיפול. שלבי הפרוטוקול זהים לאלה של תאי ההשעיה אך עם שני יוצאים מן הכלל. ראשית, יש לנסות את התאים מהצלחת לאחר שלב 3.4. שנית, שלבי שטיפה מבוצעים ללא צנטריפוגה לפני טריפסיניזציה.
- ספירת תאי DLBCL וזרע 1 × 106 תאים/מ"ל ב-4 מ"ל של בינוני לכל באר לתוך צלחת תרבית של 6 בארות. טפחו תאי DLBCL במדיום RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-100 פניצילין/סטרפטומיצין U/mL.
- הוסיפו MAF (5 מיקרוגרם/מ"ל) או DN (20 ננוגרם/מ"ל) לתרבית התאים ונדנדו בעדינות את הצלחת לערבוב.
הערה: MAF ו- DN אינם יציבים. לאחר פירוק ב- DMSO, יש למקם את פתרון המניות ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. יש להימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה. - דגירה של הצלחת באינקובטור 5% CO2, 37 °C למשך 3 ימים.
- לאחר דגירה של 3 ימים, לאסוף את תאי DLBCL בצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מ"ל ולסובב ב 100 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- השליכו את ה-supernatant, החיזרו את כדורי התאים עם 4 מ"ל של מדיום רענן, והוסיפו את המתלים בחזרה לצלחת בעלת 6 הבארות.
- טפחו את צלחת התא בחממה של 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים נוספים לפני הקטיף לניתוח.
2. הכינו פתרונות לצביעה (טבלה 1)
3. כתם תאי DLBCL בסמני סנסנציה שונים
הערה: דגימות תאים מוכתמות בסמנים בודדים (כלומר, כחול-EdU פסיפי, C12FDG, או Alexa Fluor 647-γH2AX) מוכנות ליצור מטריצת פיצוי כדי לתקן את הזליגה הפלואורסצנטית במהלך המדידה. למרות שהוצע מאוד, ניתן להשעות שלב זה כאשר קיימת חפיפה ניתנת להשמטה (ערך מקדם הפיצוי ≤ 0.1) של ספקטרום הפליטה בקרב פלואורופורים שונים. עם זאת, על המשתמשים לקבוע שלבי פיצוי סטנדרטיים בעת שימוש במכשירים שונים ובלוחות פלורסנט שונים.
- הוסף תמיסת EdU של 10 mM ביחס של 1:1,000 לתרבית התאים DLBCL הנוצרת משלב 1.6 (ריכוז EdU הסופי הוא 10 μM). נדנדו בעדינות את הצלחת כדי לערבב ולדגום באינקובטור 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
- מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומוסיפים תמיסת כלורוקין 100 מ"מ לריכוז סופי של 75 מיקרומטר (ראו דיון). נדנדו בעדינות את הצלחת כדי לערבב ולדגום באינקובטור 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- הוציאו את הצלחת מהאינקובטור והוסיפו תמיסת 20 mM C12FDG ב-1: 1,000 לריכוז C12FDG סופי של 20 מיקרומטר.
- הוציאו את הצלחת מהאינקובטור והוסיפו תמיסת 100 mM 2-פנילאתיל-β-D-thiogalactoside (PETG) בשעה 1:50 כדי לעצור את תמיסת fSA-β-gal (ריכוז PETG סופי של 2 mM). סובבו בעדינות את הצלחת כדי לערבב.
- מעבירים את התאים לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 15 מ"ל ומסובבים ב-100 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. יש להשליך את חומר העל ולשטוף את התאים ב-4 מ"ל של מלח בעל מאגר פוספט (PBS).
- חזור על שלב הכביסה של PBS. השליכו את הסופרנאטנט והחזירו את כדורי התא ב-500 μL של תמיסת קיבוע פרפורמלדהיד של 4%.
- לאחר 10 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 250 × גרם, טמפרטורת החדר במשך 5 דקות. השליכו את תאי הסופרנטנט ושטפו 4 מ"ל של PBS.
- חזור על שלב הכביסה של PBS. יש להשליך את הסופרנטנט, להחיות את גלולת התא ב-200 μL של חיץ חדירת סאפונין ולהעביר את ההשעיה לצינור חדש של 1.5 מ"ל. לאחר 10 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 250 × גרם, טמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- יש להשליך את הסופרנטנט ולהחיות את כדורי התאים ב-200 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית (נוגדן 1:500 γH2AX בתמיסת הדגירה של נוגדנים). דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בחושך.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 250 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את ה-supernatant ושטפו עם תמיסת שטיפת סאפונין ב-100 μL.
- חזרו על שלב הכביסה פעמיים נוספות. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את כדורי התא ב-500 מיקרול' של קוקטייל זיהוי EdU.
- דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך. צנטריפוגה ב 250 × גרם, טמפרטורת החדר במשך 5 דקות. יש להשליך את ה-supernatant ולשטוף עם 1 מ"ל של תמיסת שטיפת ספונין.
- חזור על שלב הכביסה פעמיים. יש להשליך את הסופרנטנט ולהחיות את כדורי התא ב-20-50 מיקרול של PBS. המשך לסעיף 4 למדידת מדגם.
4. הדמיה של סמני סנסנציה באמצעות מערכת ציטומטר זרימת ההדמיה
- רוקנו את בקבוק נוזל הפסולת. בדקו את רמות החרוזים המהירים, המעקרים, המנקה, ההפרחות, הנדן וריאגנטי השטיפה (מים שעברו דה-יוניזציה) כדי להבטיח מספיק נוזלים לפני הפעלת המכשיר (ראו טבלת החומרים).
- הפעילו את המכשיר ואת תוכנת ההדמיה (ראו את ממשק התוכנה באיור 1A).
- לחץ על לחצן הפעלה כדי לאתחל נוזלים וכיול המערכת.
הערה: הליך זה אורך כ-45 דקות. - הגדר את ההגדלה ל-40x, הגדר את מהירות הנוזלים לנמוכה והפעל את הלייזרים הדרושים בניסוי. הפעל לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-642 ננומטר כדי למדוד את הלייזרים הכחולים של EdU-pacific, C12FDG ו-Alexa Fluor 647-γH2AX (או Alexa Fluor 647-Ki67), בהתאמה. הגדר את Ch6 עבור ערוץ פיזור, ו- Ch1 ו- Ch9 עבור ברייטפילד.
- התחילו עם הדגימה שצפויה להיות בעלת הפלואורסצנציה הגבוהה ביותר כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים. הפוך בעדינות את צינור הדגימה כדי לערבב. פתח את מכסה הצינור, והכנס את צינור הדגימה לרציף. לחץ על טען כדי להתחיל.
- פתח תרשים פיזור ובחר את התכונות Area_M01 ו - Aspect Ratio_M01 עבור צירי X ו - Y, בהתאמה. הגדר שער מעל יחס גובה-רוחב של 0.5 כדי לא לכלול כפלים וצבירת תאים מתחת ובצד ימין, ואת אוכלוסיית חרוזי המהירות בצד שמאל (איור 1B).
- פתח תרשים היסטוגרמה ובחר את התכונה מעבר צבע RMS_M01_Ch01 עבור ציר ה- X. בחרו את אוכלוסיית הסינגלטים והגדירו את השער לבחירה עבור תאים ממוקדים (איור 1C).
הערה: מערכת ההדמיה תשתמש באופן אוטומטי בחרוזי מהירות כדי להתאים את המיקוד להדמיה. עם זאת, מומלץ לבחור את המחצית הימנית של שיא ההיסטוגרמה עבור האוכלוסייה הממוקדת ביותר. - פתח תרשים היסטוגרמה ובחר עוצמות פיקסלים של Raw Max עבור ציר X עבור כל ערוץ צבע (Ch2, 7 ו- 11). התאימו את הספקות הלייזר (כלומר, לייזרים של 488 ננומטר, 405 ננומטר ו-642 ננומטר עבור Ch2, 7 ו-11, בהתאמה), כך שלכל פלואורוכרום יהיה ערך Raw Max Pixel בין 100 ל-4,000 כדי למנוע פיזור יתר.
הערה: עבור ניסוי זה, הגדרת הספק הלייזר היא 50 mW, 200 mW ו - 50 mW עבור לייזרים 488 ננומטר, 405 ננומטר ו - 642 ננומטר, בהתאמה. - בחר את האוכלוסייה הממוקדת שתקליט ולחץ על רכוש כדי למדוד את דגימות ה- DLBCL עם הגדרות עקביות. בעת שינוי דגימות למדידה, לחץ על Return כדי לשחזר את צינור הדגימה. לחץ על טען כדי להשליך את הדגימה.
- לאחר שכל הדגימות נמדדות, כבו את שדה הבהיר ופזרו את הלייזר. מדוד דגימות בקרה בצבע יחיד כדי ליצור מטריצת פיצוי.
- לחץ על כיבוי כדי לסגור את מערכת ההדמיה.
- נתח את הנתונים בתוכנת ניתוח התמונות.
- השתמש בכלי Spot Wizard של תוכנת ניתוח התמונות כדי לספור ולכמת באופן אוטומטי מוקדי γH2AX גרעיניים בתמונות של תאים חיים. בחר שתי אוכלוסיות תאים (אחת עם גבוהה ואחת עם ספירת נקודות נמוכה) כדי לאמן את אשף הנקודות לניתוח אוטומטי נוסף של ספירת הכתמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטריצת פיצוי נוצרה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות על ידי טעינת נתונים מוקלטים של דגימות בקרה בצבע יחיד. כפי שניתן לראות באיור המשלים S1, זליגת אור לא זניחה (ערך מקדם ≥ 0.1) מ-EdU ל-C12FDG זוהתה עם ערך מקדם crosstalk 0.248, בעוד שה-crosstalk בין ערוצים אחרים לא היה משמעותי. ארבעה קווי תאים שונים של DLBCL טופלו ב-5 מיקרוגרם/מ"ל MAF או 20 ננוגרם/מ"ל DN כדי לגרום לסנסנציה תאית ונותחו באמצעות צביעת SA-β-gal קונבנציונלית או בשיטת ההדמיה של זרימה-ציטומטריה.
יותר מ-70% מתאי KARPAS422, WSU-DLCL2 ו-OCI-LY1 נכנסו למצב של סנסנציה, מה שמצוין על-ידי SA-β-gal חיובי, בעוד ש-SU-DHL6 היה עמיד לחלוטין בפני אינדוקציה של סנסנציה על-ידי MAF ו-DN (איור משלים S2A). יש לציין כי MAF ו-DN גם גרמו למוות תאי בכל תאי ה-DLBCL, אם כי לא באופן דרמטי (איור משלים S2B). באמצעות שיטת ההדמיה של זרימה-ציטומטריה, תמונות חד-תאיות וכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה הראו גידול ב-C12FDG+EdU-γH2AX+ senescent ב-KARPAS422, WSU-DLCL2 ו-OCI-LY1, אך לא בתאי SU-DHL6 (איור 2A-D), מה שהיה תואם את התוצאות המקובלות של צביעת SA-β-gal. עם זאת, אחוזי האוכלוסייה הסנסנטית C12FDG+EdU-γH2AX+ היו נמוכים משמעותית משיטת ההכתמה הרגילה של SA-β-gal (איור 2 ואיור משלים S2).
יתר על כן, ניתוח ציטומטריה של זרימה-ציטומטריה של הדמיה הראה חוסר גרימת סנסנציה מגוונת בין קווי תאי DLBCL שונים, שלא הובחנו בבירור על ידי צביעת SA-β-gal קונבנציונלית. אחוז תאי ה-OCI-LY1 הסנסנטיים C12FDG+EdU-γH2AX+ (כלומר, 43.2% ו-31.9% עם MAF ו-DN, בהתאמה), היה נמוך משמעותית מזה של KARPAS422 (62.2% ו-73.8% עם MAF ו-DN, בהתאמה) ו-WSU-DLCL2 (60% ו-58.1% עם MAF ו-DN, בהתאמה) (איור 2). חשוב לציין שניתוח מבוסס הדמיה הציג מספרים גבוהים משמעותית של מוקדי γH2AX ב-KARPAS422, WSU-DLCL2 ו-OCI-LY1, אך לא בתאי SU-DHL6 (איור 3A,B).
איור 1: ממשק תוכנת הפעלה והגדרת מכשירים. לוח התמונה של התא החי (בפינה השמאלית העליונה) מכיל תמונות של תאים חיים של כל 12 ערוצי התמונה וכלים להתאמת תמונה (לדוגמה, זום, בחירת אוכלוסיית תאים, שינוי צבע, מסיכה והתאמת מאפייני תמונה). אזור הניתוח של ציטומטריית זרימה (למטה משמאל) מכיל סרגל כלים לניתוח ציטומטריה של זרימה, כגון תרשים היסטוגרמה, תרשים פיזור, גידור אזורים שונים, פריסה וסטטיסטיקות אוכלוסייה. לוח הבקרה (מימין) מכיל תפריטים לאיסוף וחיסכון של נתונים, הגדרת תאורה, הגדלה, בקרת מהירות זורמת, מיקוד ומרכוז. (B) בחירת אוכלוסייה חד-תאית. (C) בחירת אוכלוסיית תאים ממוקדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הדמיה וכימות של תאים סנסנטיים ברמה של תא יחיד. תמונות מייצגות (פאנל שמאלי) וניתוח ציטומטריה של זרימה של C12FDG+EdU-γH2AX+ תאים סנסנטיים (פאנל ימני) של (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1, ו-(D) תאי SU-DHL6 שטופלו ב-5 מיקרוגרם/מ"ל MAF או 20 ננוגרם/מ"ל DN במשך 5 ימים ומוכתמים עבור תאי fSA-β-gal, EdU ו-γH2AX. תאים שטופלו ב-DMSO שימשו כבקרה. קיצורים: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-אתיניל-2′-דאוקסיורידין; γH2AX = צורה זרחנית של היסטון H2AX; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; MAF = מאפוספמיד; DN = דאונורוביצין; fSA-β-gal = סנסנציה מבוססת פלואורסצנציה הקשורה β-גלקטוזידאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כימות מבוסס הדמיה של מוקדי γH2AX גרעיניים בתאים סנסנטיים. (A) תמונות מייצגות של מוקדי γH2AX בתאי DLBCL (ראו טקסט של איור 2 למידע על טיפול וצביעה). (B) תדירות (משמאל) וכימות (מימין) של ספירת מוקדי γH2AX בתאי DLBCL. קיצורים: γH2AX = צורה זרחונית של היסטון H2AX; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; MAF = מאפוספמיד; DN = דאונורוביצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| תמיסה | הערות | |
| פתרון 10 mM EdU ב- DMSO | יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. | |
| 20 mM C12FDG פתרון ב DMSO | יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. | |
| תמיסת כלורוקווין 100 mM במים שעברו דה-יוניזציה | יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. | |
| תמיסת PETG של 100 mM במים שעברו דה-יוניזציה | יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. | |
| פתרון קיבוע: 4% PFA (paraformaldehyde) ב- PBS | מוכן טרי; אזהרה: PFA מזיק. השתמש עם אמצעי זהירות מתאימים. | |
| מאגר Permeabilization: 1% saponin (w/v), 3% BSA (w/v) ב- PBS, מוכן טרי. | הוכן טרי | |
| תמיסת דגירה של נוגדנים: 0.1% סאפונין (w/v), 3% BSA (w/v) ב-PBS | הוכן טרי | |
| תמיסת שטיפה: 0.1% סאפונין (w/v), 0.5% BSA (w/v) ב-PBS | הוכן טרי | |
| קוקטייל זיהוי EdU: מדולל CuSO4 (100 mM) בשעה 1:50, תמיסת אזיד כחולה פסיפית בשעה 1:200 ותוסף מאגר תגובה (200 מ"ג/מ"ל) בשעה 1:100 ב-PBS | הוכן טרי | |
טבלה 1: פתרונות לצביעה.
איור משלים S1: מטריצת פיצוי של כחול EdU-pacific, C12FDG-Fluorescein ו-AF647-γH2AX. קיצורים: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-אתיניל-2′-דאוקסיורידין; γH2AX = צורה זרחנית של היסטון H2AX; AF647 = אלכסה פלואור 647. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: סנסנציה הנגרמת על-ידי טיפול בקווי תאים DLBCL. (A) צביעת SA-β-gal קונבנציונלית (לוח שמאלי) וכימות (לוח ימני) של קווי תאי DLBCL מסומנים המטופלים ב-5 מיקרוגרם/מ"ל MAF או 20 ננוגרם/מ"ל DN. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. התאים הוכתמו בצבע רפאים בכחול פסיפי בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. קיצורים: DMSO = דימתיל סולפוקסיד; MAF = מאפוספמיד; DN = דאונורוביצין; SA-β-gal = senescence-associated β-galactosidase. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S3: תמונות מייצגות וניתוח ציטומטריה של זרימה. (A) תמונות מייצגות וניתוח ציטומטריה של זרימה של תאי C12FDG+EdU-Ki67+ senescent (B) של תאי KARPAS422 ו-WSU-DLCL2 שטופלו ב-MAF במשך 5 ימים והוכתמו עבור תאי fSA-β-gal, EdU ו-Ki67. תאים שטופלו ב-DMSO שימשו כבקרה. קיצורים: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-אתיניל-2′-דאוקסיורידין; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; MAF = מאפוספמיד; DN = דאונורוביצין; fSA-β-gal = סנסנציה מבוססת פלואורסצנציה הקשורה β-גלקטוזידאז. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו בחנה את יכולת הכניסה לסנסנציה של ארבעה קווי תאי DLBCL שונים עם טיפול כימותרפי, עם הדמיה בשדה בהיר וכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה. ברמה של תא יחיד, זיהינו בהצלחה אוכלוסיות סנסנטיות עיקריות של C12FDG+EdU-Ki67+ בתאי KARPAS422 ו-WSU-DLCL2 שטופלו, ובמידה פחותה בתאי OCI-LY1, בעוד שקו התאים SU-DHL6 היה עמיד לטיפול. ההבדל ביכולת הכניסה לסנסנציה בין קווי התאים עשוי להיות מוסבר על ידי הפגמים הגנומיים המובהקים שלהם16,17. עם זאת, צפיפות תרביות תאים לא הולמת או ריכוז סמים עשויים גם הם להשפיע על אי-גרימת ה-senescence. דילולים סדרתיים של צפיפות התאים וריכוז התרופה צריכים להיבחר בקפידה לבדיקה מקיפה יותר. יש לציין כי שיטה זו הייתה רגישה מספיק כדי לזהות במדויק את האוכלוסייה הסנסנטית הטבעית המתרחשת בתאי DLBCL ללא גירוי גנוטוקסי נוסף (C12FDG+EdU-Ki67+ קבוצה שטופלה ב-DMSO באיור 3).
רמת הפעילות β-גלקטוזידאז וקצב סינתזת הדנ"א משתנים באופן משמעותי בין סוגי תאים שונים. זמן הדגירה המוצהר (כלומר, 3 שעות עבור EdU ו-1 שעה עבור C12FDG) מספיק בדרך כלל כדי להבחין בכתמים חיוביים ושליליים במבחנה. עם זאת, בנסיבות מיוחדות (למשל, תאים הגדלים לאט או תאים עם פעילות גבוהה במיוחד של β-גלקטוזידאז), ייתכן שיהיה צורך להאריך את תיוג EdU או לקצר את צביעת C12FDG לצורך אפליה טובה יותר, בהתאמה. מומלץ לבצע ניסוי פיילוט עם זמן דגירה סדרתי כדי לייעל את תנאי הניסוי (למשל, עלייה של 30 דקות או ירידה של 15 דקות עבור EdU או C12FDG, בהתאמה). כדי להבחין טוב יותר בהבדלים בין fSA-β-gal בין תאים מתרבים לבין עמיתיהם הסנסנטיים, מומלץ להקדים את ההקפאה עם כלורוקין או בפילומיצין A1 כדי להפחית את הפעילות הליזוזומית הבסיסית על ידי גרימת אלקליניזציה ליזוזומית18,19. עבור תאים עם פעילות ליזוזומית נמוכה יחסית, ניתן להשמיט את שלב הקדם-דגירה.
מבנה ממברנת התא שלם חיוני לזיהוי fSA-β-gal. בשיטה זו, השתמשנו ב-EdU במקום ב-BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) כדי למדוד סינתזת דנ"א. בהשוואה לשילוב BrdU, EdU זקוק למצב צביעה קל יחסית, אשר משמר את מבנה הממברנה השלם ומאפשר צביעה משותפת עם fSA-β-gal. יש לציין כי זיהוי בתיווך נוגדנים של חלבונים תוך-תאיים או גרעיניים (למשל, γH2AX) המתואר כאן זקוק גם הוא לחדירה של קרום התא כדי לאפשר כניסת נוגדנים. כאן הוחלף ספונין בחומר הניקוי החזק טריטון X-100 כדי למנוע מרווה של אות fSA-β-gal.
טיפול כימותרפי לא רק מעורר סנסנציה אלא גם מוות תאי בתאי DLBCL. לתאים מתים עשויה להיות השפעה לא זניחה כאשר מכמתים את אוכלוסיית הסנסנציה, שכן הם עלולים לגרום לתוצאות חיוביות שגויות או שליליות כוזבות במהלך הכתם. אף על פי שרוב פסולת התאים וגופי התאים המתים הקטנים לא ייכללו במהלך שלבי שטיפה וצנטריפוגה מרובים, אוכלוסיית התאים המתים הנותרת עדיין עשויה להיות בעלת השפעה לא זניחה. מומלץ לייעל את ריכוז התרופות כדי למנוע מוות תאי דרסטי. בנוסף, ניתן להשתמש בצביעת הכדאיות של התאים (למשל, צבע רפאים) כדי להקל על הבחנה באוכלוסיית תאים מתים ולכמת את אוכלוסיית הסנסנציה ביתר שאת.
מערכת הציטומטריה המתקדמת של זרימת ההדמיה המשמשת בשיטה זו היא ציטומטר זרימת הדמיה רב-ערוצי, המאפשר כימות מדידות מבוססות ציטומטריה של זרימה ובדיקת תמונות מרובות צבעים של תאים בודדים במקביל. הוא מספק פתרון כמותי מהיר, יעיל ומדויק לזיהוי סנסנציות, ובינתיים, יוצר תמונות מרובות צבעים ברזולוציה של תא יחיד עם מידע מרחבי של סמנים מרובים. עם זאת, כמה מגבלות נמשכות. לדוגמה, רזולוציית התמונה מוגבלת בהשוואה למיקרוסקופ היוקרתי, מה שמעכב ניתוח מקיף של לוקליזציה תת-תאית בעת מעקב אחר חלבונים הממוקמים באברונים קטנים יותר שאינם הגרעין. בהשוואה לתוכנות הפעלה וניתוח מתוחכמות של ציטומטר זרימה סטנדרטי, פחות נוח ופחות יעיל להגדיר או לשנות אסטרטגיות גידור אוכלוסייה. גם הכימות והניתוח הסטטיסטי מורכבים יותר.
לצביעת fSA-β-gal יש יתרונות משמעותיים על פני SA-β-gal קונבנציונלית לצביעה מהירה ולכימות בלתי משוחד ויש לה פוטנציאל לסיווג יעיל של תאים סנסנטיים. טכניקה זו יושמה בהצלחה כדי לסנן תאים סנסנטיים הנכנסים מחדש למחזור חלוקתהתאים 3,18,19,20. בשיטה זו, לקחנו צעד אחד קדימה כדי לשלב את fSA-β-gal עם EdU ו-γH2AX לזיהוי תאים סנסנטיים בצורה מדויקת ואמינה יותר. יש לציין כי למרות ש-fSA-β-gal, EdU ו-γH2AX נבחרו כסמנים הקשורים לסנסנציה בשיטה זו, ניתן להתאים בקלות סמני סנסנציה אמינים אחרים כדי להחליף או להוסיף לשלושת הסמנים. בשל העניין הרב ב-senescence באקדמיה, זוהו סמנים אמינים רבים הקשורים לסנסנציה, כגון ייצור גבוה של מיני חמצן תגובתי ציטופלסמיים (ROS), גורמי SASP מופרשים, Ki67 מופחת, אובדן של חלבון מעטפת גרעינית Lamin B1, וסמן הטרוכרומטין מוגבר H3K9me321,22. איור משלים S3 הראה זיהוי מוצלח שלC 12FDG+EdU-Ki67- אוכלוסיות סנסנטיות בתאי TIS KARPAS422 ו-WSU-DLCL2.
יתר על כן, ישנם סמני פני שטח רבים של תאי סנסנסנציה הזמינים לבדיקה בשיטה זו, כגון ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 ו- uPAR. זיהוי סמני פני השטח של התא דורש רק זמן דגירה קצר של נוגדנים ללא קיבוע תאים וחדירה, מה שיקצר את הליך ההכתמה לזרימת עבודה של 6 שעות בשילוב עם fSA-β-gal ו-EdU, או אפילו לניסוי של 2 שעות בשילוב עם fSA-β-gal בלבד, וחשוב מכך, הוא מאפשר הדמיה של תאים חיים. השיטה המתוקנת עשויה לשמש כגישה מהירה, אמינה וישימה במרפאה לזיהוי תאי סנסנציה in vivo, לא רק לצורך אבחון והערכה פרוגנוסטית, אלא גם לתמיכה בהתערבות סנוליטית נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ליונג יו מאוניברסיטת יוהנס קפלר לינץ (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
