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Cancer Research

थेरेपी-प्रेरित सेनेसेंट कैंसर कोशिकाओं में कई फ्लोरोसेंट सेनेसेंस मार्करों का एक साथ इमेजिंग और फ्लो-साइटोमेट्री-आधारित डिटेक्शन

Published: July 12, 2022 doi: 10.3791/63973
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,2,3, 1
1Johannes Kepler University Linz, 2Charité - University Medicine Berlin, 3Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

Summary

यहां हम एकल कोशिकाओं में कई सेनेसेंस से जुड़े मार्करों के दृश्य और मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

कीमोथेरेप्यूटिक दवाएं कैंसर कोशिकाओं में अपूरणीय डीएनए क्षति को प्रेरित कर सकती हैं, जिससे एपोप्टोसिस या समय से पहले बुढ़ापा हो सकता है। एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु के विपरीत, वृद्धावस्था एक मौलिक रूप से अलग मशीनरी है जो कैंसर कोशिकाओं के प्रसार को रोकती है। दशकों के वैज्ञानिक अध्ययनों से ट्यूमर और माइक्रोएन्वायरमेंट में सेनेसेंट कैंसर कोशिकाओं के जटिल रोग संबंधी प्रभावों का पता चला है जो कैंसर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं को संशोधित करते हैं। नए सबूत बताते हैं कि कैंसर के उपचार के दौरान वृद्धावस्था एक शक्तिशाली पूर्वानुमान कारक है, और इसलिए कैंसर के नमूनों में वृद्ध कोशिकाओं का तेजी से और सटीक पता लगाना आवश्यक है। यह पेपर कैंसर कोशिकाओं में थेरेपी-प्रेरित सेनेसेंस (टीआईएस) की कल्पना और पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। फैलाना बड़े बी-सेल लिंफोमा (डीएलबीसीएल) सेल लाइनों को माफोसफेमाइड (एमएएफ) या डौनोरुबिसिन (डीएन) के साथ इलाज किया गया था और सेनेसेंस मार्कर, सेनेसेंस से जुड़े β-गैलेक्टोसिडेस (एसए-β-गैल), डीएनए संश्लेषण मार्कर 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू), और डीएनए क्षति मार्कर गामा-एच 2 ए के लिए जांच की गई थी। फ्लो साइटोमीटर इमेजिंग कैंसर कोशिकाओं में तीन मार्करों की एक साथ कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए थोड़े समय में उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल-सेल छवियों को उत्पन्न करने में मदद कर सकता है।

Introduction

विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाएं सेलुलर सेनेसेंस को ट्रिगर कर सकती हैं, जिससे कोशिकाएं स्थिर सेल चक्र गिरफ्तारी की स्थिति में प्रवेश कर सकती हैं। इन उत्तेजनाओं में आंतरिक सिग्नलिंग परिवर्तन या बाहरी तनाव शामिल हैं। आंतरिक संकेतों में प्रगतिशील टेलोमेयर शॉर्टनिंग, टेलोमेयर संरचना में परिवर्तन, एपिजेनेटिक संशोधन, प्रोटियोस्टेसिस विकार, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और ऑन्कोजीन की सक्रियता शामिल है। बाहरी तनाव में भड़काऊ और / या ऊतक क्षति संकेत, विकिरण या रासायनिक उपचार, और पोषण संबंधी अभाव 1,2,3,4 शामिल हैं। विभिन्न प्रकार के सेनेसेंस में, सबसे अधिक देखा और अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है प्रतिकृति सेनेसेंस, ऑन्कोजीन-प्रेरित सेनेसेंस (ओआईएस), विकिरण-प्रेरित सेनेसेंस और थेरेपी-प्रेरित सेनेसेंस (टीआईएस)। ओआईएस जीनोटॉक्सिक क्षति के लिए एक तीव्र सेलुलर प्रतिक्रिया है जो विचलित ऑन्कोजीन सक्रियण द्वारा उत्पन्न प्रतिकृति तनाव के कारण होती है और कुछ हद तक प्रीनोप्लास्टिक घाव से पूर्ण विकसित ट्यूमर तक रोग संबंधी प्रगति को रोक सकती है। टीआईएस तब होता है जब ट्यूमर कोशिकाओं को कीमोथेरेप्यूटिक दवाओं या आयनीकरण विकिरण 5,6 द्वारा जोर दिया जाता है।

सेनेसेंस को इसकी अत्यधिक गतिशील प्रकृति के कारण पैथोलॉजी में एक दोधारी तलवार माना जाता है। इसे शुरू में विभाजित कोशिकाओं के परिसंचारी पूल से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को हटाने के लिए एक फायदेमंद ट्यूमर-दमनकारी तंत्र के रूप में वर्णित किया गया था, अंगों के सामान्य कार्य की रक्षा करना और ट्यूमर के विकास को 7,8,9 रोकना। हालांकि, उभरते सबूतों ने बुढ़ापे के एक अंधेरे पक्ष का सुझाव दिया है। सेनेसेंट कोशिकाएं प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का स्राव करती हैं, जिसे सेनेसेंस से जुड़े स्रावी फेनोटाइप (एसएएसपी) के रूप में जाना जाता है, जिससे फाइब्रोसिस और खराब अंग होते हैं और ट्यूमर दीक्षा और प्रगति को बढ़ावामिलता है 10. इसके अलावा, सेनेसेंट कैंसर कोशिकाएं क्रोमैटिन रीमॉडेलिंग और निरंतर डीएनए-क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) 11,12 के सक्रियण के समानांतर एपिजेनेटिक और जीन-अभिव्यक्ति रीप्रोग्रामिंग से गुजरती हैं, नए कैंसर-स्टेम-सेल गुणों को प्राप्त करती हैं 3. यद्यपि सेनेसेंस-सक्षम ट्यूमर सेनेसेंस-असमर्थ लोगों की तुलना में चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए बेहतर प्रतिक्रिया देते हैं13, सेनेसेंट कोशिकाओं की दृढ़ता से खराब दीर्घकालिक रोग का निदान हो सकता है यदि उन्हें प्रभावी ढंग से पहचाना और सेनोलिटिक दवाओं द्वारा समाप्त नहीं किया जाता है5. किसी भी तरह से, बुढ़ापे का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका महत्वपूर्ण नैदानिक रुचि का है, न केवल चिकित्सा उपचार के पूर्वानुमान के लिए बल्कि सेनेसेंट कोशिकाओं को लक्षित करने वाली उपन्यास रणनीतियों के विकास के लिए भी।

विभिन्न ट्रिगर्स के बावजूद, सेनेसेंट कोशिकाएं कुछ सामान्य विशेषताओं का प्रदर्शन करती हैं, जिनमें बड़े रिक्तिकाओं के साथ बढ़े हुए, चपटा, बहुआयामी आकृति विज्ञान, काफी विस्तारित नाभिक, नाभिक में एच 3 के 9 एम ई 3 समृद्ध सेनेसेंस से जुड़े हेटरोक्रोमैटिन (एसएएचएफ) का गठन, डीएनए क्षति मार्कर αH2AX फोसी का लगातार संचय, सक्रिय पी 53-पी21 सीआईपी 1 और आरबी-पी 16आईएनके 4 ए सेल चक्र नियामक तंत्र, स्थिर जी 1 सेल चक्र गिरफ्तारी, एसएएसपी के बड़े पैमाने पर प्रेरण, और ऊंचा सेनेसेंस से जुड़े β-गैलेक्टोसिडेस (एसए-β-गैल) गतिविधि14. चूंकि सीनेसेंस को परिभाषित करने के लिए कोई भी मार्कर पर्याप्त नहीं है, एसए-β-गैल गतिविधि के लिए एंजाइमेटिक धुंधला, जिसे सेनेसेंस डिटेक्शन के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, आमतौर पर टीआईएस15 का पता लगाने के लिए एच 3 के 9 एमई 3 और केआई 67 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के साथ जोड़ा जाता है। हालांकि, रासायनिक क्रोमोजेनिक-आधारित एसए-β-गैल को निर्धारित करना मुश्किल है। यहां, हमने 5-डोडेकानोइलामिनोफ्लोरेसिन-डि-β-डी-गैलेक्टोपिरानोसाइड (सी12एफडीजी) प्रतिदीप्ति-आधारित एसए-β-गैल (एफएसए-β-गैल) का पता लगाने के साथ γएच 2 एएक्स और ईडीयू-शामिल डीएनए के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के साथ सी12एफडीजी + ईडीयू-एच 2 एएक्स + सेनेसेंट कोशिकाओं को जोड़ा यह विधि मानक पाइपलाइनों के निर्माण द्वारा कई नमूनों के तेजी से विश्लेषण को लाइसेंस देते हुए कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंट संकेतों की स्थिति और मात्रा का ठहराव की अनुमति देने वाली उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की तेजी से पीढ़ी को सक्षम बनाती है।

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Protocol

1. सेलुलर सेनेसेंस को प्रेरित करने के लिए मैफोस्फेमाइड या डौनोरुबिसिन उपचार के साथ डीएलबीसीएल सेल लाइनें

नोट: प्रोटोकॉल भी अनुयायी कैंसर कोशिकाओं के लिए काम करता है। सेल आकार के आधार पर, बीज 1-2 × 105 कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में और उपचार से पहले रात भर 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट सेते हैं। प्रोटोकॉल चरण निलंबन कोशिकाओं के लिए समान हैं लेकिन दो अपवादों के साथ। सबसे पहले, चरण 3.4 के बाद कोशिकाओं को प्लेट से ट्रिप्सिनाइज करने की आवश्यकता होती है। दूसरा, ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले सेंट्रीफ्यूजेशन के बिना धोने के कदम किए जाते हैं।

  1. डीएलबीसीएल कोशिकाओं और बीज 1 × 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में अच्छी तरह से प्रति माध्यम के 4 एमएल में 10 6 कोशिकाओं / आरपीएमआई -1640 माध्यम में डीएलबीसीएल कोशिकाओं की खेती करें जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक हैं।
  2. एमएल) या डीएन (20 एनजी / एमएल) सेल संस्कृति में जोड़ें और मिश्रण करने के लिए प्लेट को धीरे से रॉक करें।
    नोट: एमएएफ और डीएन स्थिर नहीं हैं। डीएमएसओ में भंग होने के बाद, स्टॉक समाधान को विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। पिघलना चक्र से बचा जाना चाहिए।
  3. 3 दिनों के लिए एक 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट सेते हैं।
  4. 3 दिन के इनक्यूबेशन के बाद, 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डीएलबीसीएल कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, ताजा माध्यम के 4 मिलीलीटर के साथ सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें, और निलंबन को 6-अच्छी तरह से प्लेट में वापस जोड़ें।
  6. विश्लेषण के लिए कटाई से पहले एक और 2 दिनों के लिए 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेल प्लेट की खेती करें।

2. धुंधला के लिए समाधान तैयार करें (तालिका 1)

3. विभिन्न सेनेसेंस मार्करों के साथ डीएलबीसीएल कोशिकाओं को दाग दें

नोट: व्यक्तिगत मार्करों (यानी, प्रशांत ब्लू-एडयू, सी12एफडीजी, या एलेक्सा फ्लोर 647-αH2AX) के साथ दाग सेल नमूने माप के दौरान प्रतिदीप्ति स्पिलओवर को सही करने के लिए एक मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए तैयार हैं। यद्यपि अत्यधिक सुझाव दिया गया है, इस चरण को निलंबित किया जा सकता है जब विभिन्न फ्लोरोफोरस के बीच उत्सर्जन स्पेक्ट्रा का एक छोड़ने योग्य ओवरलैप (मुआवजा गुणांक मूल्य ≤ 0.1) होता है। हालांकि, उपयोगकर्ताओं को विभिन्न उपकरणों और फ्लोरोसेंट पैनलों का उपयोग करते समय मानकीकृत मुआवजा चरणों को निर्धारित करना होगा।

  1. चरण 1.6 से उत्पन्न डीएलबीसीएल सेल संस्कृति में 1: 1,000 के अनुपात में 10 एमएम ईडीयू समाधान जोड़ें (अंतिम ईडीयू एकाग्रता 10 μM है)। धीरे मिश्रण और 3 घंटे के लिए एक 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं करने के लिए प्लेट रॉक।
  2. प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और 75 μM की अंतिम एकाग्रता में 100 एमएम क्लोरोक्वीन समाधान जोड़ें (चर्चा देखें)। धीरे मिश्रण और 30 मिनट के लिए एक 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं करने के लिए थाली रॉक।
  3. प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और1 पर 20 एमएम सी 12एफडीजी समाधान जोड़ें: 20 μM के अंतिम C 12 FDG एकाग्रता के लिए1,000।
  4. प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और एफएसए-β-गैल धुंधला (2 एमएम की अंतिम पीईटीजी एकाग्रता) को रोकने के लिए 1:50 बजे 1:50 पर 100 एमएम 2-फेनिलेथिल-β-डी-थियोगलैक्टोसाइड (पीईटीजी) समाधान जोड़ें। मिश्रण करने के लिए प्लेट को धीरे से घुमाएं।
  5. 15 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 4 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  6. पीबीएस धोने के कदम को दोहराएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण समाधान के 500 μL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  7. कमरे के तापमान पर 10 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, 250 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, 5 मिनट के लिए कमरे का तापमान। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 4 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  8. पीबीएस धोने के कदम को दोहराएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, सैपोनिन पारगम्य बफर के 200 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और निलंबन को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, 250 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, 5 मिनट के लिए कमरे का तापमान।
  9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μL (एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समाधान में 1: 500 αH2AX एंटीबॉडी) में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  10. 5 मिनट के लिए 250 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सैपोनिन धोने के समाधान के 100 μL के साथ धो लें।
  11. धोने के चरण को अतिरिक्त दो बार दोहराएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ईडीयू डिटेक्शन कॉकटेल के 500 μL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  12. अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 250 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, 5 मिनट के लिए कमरे का तापमान। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सैपोनिन धोने के समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ धो लें।
  13. धोने के चरण को दो बार दोहराएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 20-50 μL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। नमूना माप के लिए धारा 4 पर आगे बढ़ें।

4. इमेजिंग प्रवाह साइटोमीटर प्रणाली का उपयोग कर इमेजिंग सेनेसेंस मार्कर

  1. अपशिष्ट तरल पदार्थ की बोतल खाली करें। साधन को चालू करने से पहले पर्याप्त तरल पदार्थ सुनिश्चित करने के लिए गति मोती, स्टरलाइज़र, क्लीनर, डेबबलर, म्यान और कुल्ला अभिकर्मकों (विआयनीकृत पानी) के स्तर की जांच करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. साधन और इमेजिंग सॉफ्टवेयर चालू करें ( चित्रा 1 ए में सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस देखें)।
  3. तरल पदार्थ और सिस्टम अंशांकन शुरू करने के लिए स्टार्टअप बटन पर क्लिक करें।
    नोट: इस प्रक्रिया में लगभग 45 मिनट लगते हैं।
  4. आवर्धन को 40x पर सेट करें, तरल पदार्थ की गति को कम पर सेट करें, और प्रयोग में आवश्यक लेजर चालू करें। क्रमशः एडीयू-पैसिफिक ब्लू, सी12एफडीजी और एलेक्सा फ्लोर 647-δH2AX (या एलेक्सा फ्लोर 647-Ki67) को मापने के लिए 405 एनएम, 488 एनएम और 642 एनएम लेजर चालू करें। स्कैटर चैनल के लिए सीएच 6 सेट करें, और ब्राइटफील्ड के लिए सीएच 1 और सीएच 9।
  5. लेज़रों की तीव्रता स्थापित करने के लिए उच्चतम प्रतिदीप्ति होने की उम्मीद वाले नमूने के साथ शुरू करें। मिश्रण करने के लिए नमूना ट्यूब धीरे फ्लिप। ट्यूब ढक्कन खोलें, और गोदी पर नमूना ट्यूब डालें। शुरू करने के लिए लोड पर क्लिक करें।
  6. एक स्कैटर प्लॉट खोलें और क्रमशः एक्स- और वाई-अक्षों के लिए Area_M01 और पहलू Ratio_M01 सुविधाओं का चयन करें। नीचे और दाईं ओर डबलेट्स और सेल समुच्चय को बाहर करने के लिए 0.5 के पहलू अनुपात के ऊपर एक गेट सेट करें, और बाईं ओर गति मनका आबादी (चित्रा 1 बी)।
  7. हिस्टोग्राम प्लॉट खोलें और एक्स-अक्ष के लिए सुविधा ग्रेडिएंट RMS_M01_Ch01 का चयन करें। सिंगलेट आबादी चुनें और केंद्रित कोशिकाओं (चित्रा 1 सी) के लिए चयन करने के लिए गेट सेट करें।
    नोट: इमेजिंग सिस्टम स्वचालित रूप से इमेजिंग के लिए फोकस को समायोजित करने के लिए गति मोती का उपयोग करेगा। हालांकि, सर्वोत्तम केंद्रित आबादी के लिए हिस्टोग्राम चोटी के दाहिने आधे हिस्से का चयन करने की सिफारिश की जाती है।
  8. एक हिस्टोग्राम प्लॉट खोलें और प्रत्येक रंग चैनल (सीएच 2, 7 और 11) के लिए एक्स-अक्ष के लिए रॉ मैक्स पिक्सेल तीव्रता का चयन करें। लेजर शक्तियों को समायोजित करें (यानी, सीएच 2, 7 और 11 के लिए क्रमशः 488 एनएम, 405 एनएम और 642 एनएम लेजर), इसलिए प्रत्येक फ्लोरोक्रोम में ओवरसैचुरेशन से बचने के लिए 100 और 4,000 के बीच एक कच्चा मैक्स पिक्सेल मूल्य होता है।
    नोट: इस प्रयोग के लिए, लेजर पावर सेटिंग क्रमशः 488 एनएम, 405 एनएम और 642 एनएम लेजर के लिए 50 मेगावाट, 200 मेगावाट और 50 मेगावाट है।
  9. रिकॉर्ड करने के लिए केंद्रित आबादी चुनें और सुसंगत सेटिंग्स के साथ डीएलबीसीएल नमूनों को मापने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें। माप के लिए नमूने बदलते समय, नमूना ट्यूब को पुनर्प्राप्त करने के लिए रिटर्न पर क्लिक करें। नमूना छोड़ने के लिए लोड दबाएँ।
  10. सभी नमूनों को मापने के बाद, ब्राइटफील्ड और स्कैटर लेजर को बंद कर दें। मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए एकल-रंग नियंत्रण नमूनों को मापें।
  11. इमेजिंग सिस्टम को बंद करने के लिए शटडाउन पर क्लिक करें।
  12. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा का विश्लेषण करें।
    1. लाइव-सेल छवियों में स्वचालित रूप से परमाणु αH2AX फोकी की गणना और मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के स्पॉट विज़ार्ड टूल का उपयोग करें। आगे स्वचालित स्पॉट काउंट विश्लेषण के लिए स्पॉट विज़ार्ड को प्रशिक्षित करने के लिए दो सेल आबादी (उच्च और कम स्पॉट काउंट के साथ एक) का चयन करें।

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Representative Results

एकल-रंग नियंत्रण नमूनों के रिकॉर्ड किए गए डेटा को लोड करके छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक मुआवजा मैट्रिक्स उत्पन्न किया गया था। जैसा कि पूरक चित्रा एस 1 में दिखाया गया है, ईडीयू से सी 12 एफडीजी तक एक गैर-नगण्य (गुणांक मूल्य≥ 0.1) प्रकाश स्पिलओवर क्रॉसस्टॉक गुणांक मूल्य 0.248 के साथ पाया गया था, जबकि अन्य चैनलों के बीच क्रॉसस्टॉक महत्वपूर्ण नहीं था। एमएल डीएन के साथ चार अलग-अलग डीएलबीसीएल सेल लाइनों का इलाज सेलुलर सेनेसेंस को प्रेरित करने के लिए किया गया था और पारंपरिक एसए-β-गैल धुंधला या इमेजिंग प्रवाह-साइटोमेट्री विधि का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।

कार्पास 422, डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2, और ओसीआई-एलवाई 1 कोशिकाओं के 70% से अधिक ने सकारात्मक एसए-β-गैल द्वारा इंगित सेनेसेंस स्थिति में प्रवेश किया, जबकि एसयू-डीएचएल 6 एमएएफ और डीएन (पूरक चित्रा एस 2 ए) द्वारा सेनेसेंस प्रेरण के लिए पूरी तरह से प्रतिरोधी था। विशेष रूप से, एमएएफ और डीएन ने सभी डीएलबीसीएल कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु को भी प्रेरित किया, हालांकि नाटकीय रूप से नहीं (पूरक चित्रा एस 2 बी)। इमेजिंग प्रवाह-साइटोमेट्री विधि, एकल-कोशिका छवियों और प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित मात्रा का ठहराव का उपयोग करके कार्पास422, डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2, और ओसीआई-एलवाई 1 में सी 12 एफडीजी + ईडीयू-एच 2 एएक्स + सेनेसेंट आबादी में वृद्धि हुई है, लेकिन एसयू-डीएचएल 6 कोशिकाओं (चित्रा 2 ए-डी) में नहीं, जो पारंपरिक एसए-β-गैल धुंधला परिणामों के अनुरूप था। हालांकि, सी12एफडीजी + एडीयू-α एच 2 एएक्स + सेनेसेंट आबादी का प्रतिशत पारंपरिक एसए-β-गैल धुंधला विधि (चित्रा 2 और पूरक चित्रा एस 2) की तुलना में काफी कम था।

इसके अलावा, इमेजिंग प्रवाह-साइटोमेट्री विश्लेषण ने विभिन्न डीएलबीसीएल सेल लाइनों के बीच विविध सेनेसेंस प्रेरकता दिखाई, जो पारंपरिक एसए-β-गैल धुंधला द्वारा स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित नहीं थी। सी12एफडीजी + ईडीयू-αH2AX + सेनेसेंट ओसीआई-एलवाई 1 कोशिकाओं (यानी, एमएएफ और डीएन के साथ क्रमशः 43.2% और 31.9%) का प्रतिशत, कार्पास 422 (एमएएफ और डीएन के साथ क्रमशः 62.2% और 73.8%) और डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2 (एमएएफ और डीएन के साथ 60% और 58.1%) की तुलना में काफी कम था। महत्वपूर्ण रूप से, इमेजिंग-आधारित विश्लेषण ने कार्पास 422, डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2, और ओसीआई-एलवाई 1 में αH2AX फोसी की काफी अधिक संख्या प्रस्तुत की, लेकिन एसयू-डीएचएल 6 कोशिकाओं (चित्रा 3 ए, बी) में नहीं।

Figure 1
चित्रा 1: ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस और साधन सेटअप. (ए) इमेजिंग प्रवाह-साइटोमीटर सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस। लाइव-सेल छवि पैनल (ऊपर बाएं) में सभी 12 छवि चैनलों और छवि समायोजन उपकरणों (जैसे, ज़ूम, सेल जनसंख्या चयन, रंग परिवर्तन, मुखौटा और छवि गुण समायोजन) की लाइव-सेल छवियां शामिल हैं। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण क्षेत्र (नीचे बाएं) में प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एक टूलबार होता है, जैसे कि हिस्टोग्राम प्लॉट, स्कैटर प्लॉट, विभिन्न क्षेत्र गेटिंग, लेआउट और जनसंख्या आँकड़े। नियंत्रण कक्ष (दाएं) में डेटा अधिग्रहण और बचत, रोशनी सेटिंग, आवर्धन, द्रव गति नियंत्रण, फोकस और केंद्रित करने के लिए मेनू शामिल हैं। (बी) एकल-कोशिका आबादी का चयन। (सी) केंद्रित सेल आबादी का चयन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एकल-कोशिका स्तर पर वृद्धावस्था कोशिकाओं का दृश्य और मात्रा का ठहराव। प्रतिनिधि छवियां (बाएं पैनल) और सी12एफडीजी + ईडीयू-γ एच 2 एएक्स + सेनेसेंट कोशिकाओं (दाएं पैनल) के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (ए) कार्पस 422, (बी) डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2, (सी) ओसीआई-एलवाई 1, और (डी) एसयू-डीएचएल 6 कोशिकाओं को 5 दिनों के लिए 5 μg / एमएल एमएएफ या 20 एनजी / एमएल डीएन के साथ इलाज किया जाता है और एफएसए-β-गैल के लिए दाग दिया जाता है। डीएमएसओ-उपचारित कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। संक्षिप्त नाम: सी12एफडीजी = 5-डोडेकानोयलामिनोफ्लोरेसिन-डि-β-डगलैक्टोपायरानोसाइड; ईडीयू = 5-एथिनाइल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन; αH2AX = हिस्टोन H2AX का फॉस्फोराइलेटेड रूप; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; एमएएफ = माफोस्फामाइड; डीएन = डौनोरुबिसिन; एफएसए-β-गैल = प्रतिदीप्ति-आधारित सेनेसेंस-जुड़े β-गैलेक्टोसिडेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सेनेसेंट कोशिकाओं में परमाणु αH2AX फोकी की इमेजिंग-आधारित मात्रा का ठहराव. (ए) डीएलबीसीएल कोशिकाओं में αH2AX फोकी की प्रतिनिधि छवियां (उपचार और धुंधला विवरण के लिए चित्रा 2 का पाठ देखें)। (बी) डीएलबीसीएल कोशिकाओं में αH2AX फोकी की आवृत्ति (बाएं) और परिमाणीकरण (दाएं) मायने रखता है। संक्षिप्त नाम: αH2AX = हिस्टोन H2AX का फॉस्फोराइलेटेड रूप; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; एमएएफ = माफोस्फामाइड; डीएन = डौनोरुबिसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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डीएमएसओ में 10 एमएम ईडीयू समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
डीएमएसओ में20 एमएम सी 12एफडीजी समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
विआयनीकृत पानी में 100 एमएम क्लोरोक्वीन समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
विआयनीकृत पानी में 100 एमएम पीईटीजी समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
निर्धारण समाधान: पीबीएस में 4% पीएफए (पैराफॉर्मलडिहाइड) ताजा तैयार; सावधानी: पीएफए हानिकारक है। उचित सावधानी के साथ प्रयोग करें।
पारगम्यता बफर: पीबीएस में 1% सैपोनिन (डब्ल्यू / वी), 3% बीएसए (डब्ल्यू / वी), हौसले से तैयार किया गया। ताजा तैयार
एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समाधान: पीबीएस में 0.1% सैपोनिन (डब्ल्यू / वी), 3% बीएसए (डब्ल्यू / ताजा तैयार
धोने का समाधान: पीबीएस में 0.1% सैपोनिन (डब्ल्यू / वी), 0.5% बीएसए (डब्ल्यू / ताजा तैयार
ईडीयू डिटेक्शन कॉकटेल: 1:50 पर पतला सीयूएसओ4 (100 एमएम), 1:200 पर प्रशांत नीला एजाइड समाधान और पीबीएस में 1:100 पर प्रतिक्रिया बफर योजक (200 मिलीग्राम / ताजा तैयार

तालिका 1: धुंधला करने के लिए समाधान।

पूरक चित्रा एस 1: एडीयू-पैसिफिक ब्लू, सी12एफडीजी-फ्लोरोसिन, और एएफ 647-αएच 2 एएक्स का मुआवजा मैट्रिक्स। संक्षिप्त नाम: सी12एफडीजी = 5-डोडेकानोयलामिनोफ्लोरेसिन-डि-β-डगलैक्टोपायरानोसाइड; ईडीयू = 5-एथिनाइल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन; αH2AX = हिस्टोन H2AX का फॉस्फोराइलेटेड रूप; एएफ 647 = एलेक्सा फ्लोर 647। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: डीएलबीसीएल सेल लाइनों की थेरेपी-प्रेरित सेनेसेंस। (ए) पारंपरिक एसए-β-गैल धुंधला (बाएं पैनल) और संकेतित डीएलबीसीएल सेल लाइनों का परिमाणीकरण (दाएं पैनल) 5 μg / एमएल एमएएफ या 20 एनजी / एमएल डीएन के साथ इलाज किया जाता है स्केल बार = 50 μm। (बी) प्रवाह साइटोमेट्री (बाएं पैनल) और डीएलबीसीएल सेल लाइनों के परिमाणीकरण (दाएं पैनल) द्वारा विश्लेषण की गई कोशिका मृत्यु का प्रतिशत ए में। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर भूत डाई-पैसिफिक नीले रंग के साथ दाग दिया गया था। संक्षिप्त नाम: डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; एमएएफ = माफोस्फामाइड; डीएन = डौनोरुबिसिन; एसए-β-गैल = सेनेसेंस से जुड़े β-गैलेक्टोसिडेस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: प्रतिनिधि छवियां और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। (ए) प्रतिनिधि छवियां और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सी12एफडीजी + ईडीयू-केआई 67 + कार्पास 422 और डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2 कोशिकाओं के सेनेसेंट कोशिकाओं (बी) को 5 दिनों के लिए एमएएफ के साथ इलाज किया गया और एफएसए-β-गैल, ईडीयू और केआई 67 के लिए दाग दिया गया। डीएमएसओ-उपचारित कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। संक्षिप्त नाम: सी12एफडीजी = 5-डोडेकानोयलामिनोफ्लोरेसिन-डि-β-डगलैक्टोपायरानोसाइड; ईडीयू = 5-एथिनाइल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; एमएएफ = माफोस्फामाइड; डीएन = डौनोरुबिसिन; एफएसए-β-गैल = प्रतिदीप्ति-आधारित सेनेसेंस-जुड़े β-गैलेक्टोसिडेस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पद्धति ने उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग और प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित मात्रा का ठहराव के साथ कीमोथेरेपी उपचार पर चार अलग-अलग डीएलबीसीएल सेल लाइनों की सीनेसेंस-प्रवेश क्षमता की जांच की। एकल-कोशिका स्तर पर, हमने इलाज किए गए कार्पास422और डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2 कोशिकाओं में प्रमुख सी 12 एफडीजी + ईडीयू-केआई 67 + सेनेसेंट आबादी का सफलतापूर्वक पता लगाया, और ओसीआई-एलवाई 1 कोशिकाओं में कुछ हद तक, जबकि एसयू-डीएचएल 6 सेल लाइन उपचार के लिए प्रतिरोधी थी। सेल लाइनों के बीच वृद्धावस्था-प्रवेश क्षमता में अंतर उनके विशिष्ट जीनोमिक दोष16,17 के लिए जिम्मेदार हो सकता है। हालांकि, अनुचित सेल संस्कृति घनत्व या दवा एकाग्रता भी बुढ़ापे की प्रेरकता को प्रभावित कर सकती है। सेल घनत्व और दवा एकाग्रता के धारावाहिक कमजोर पड़ने को अधिक व्यापक परीक्षा के लिए सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए। विशेष रूप से, यह विधि अतिरिक्त जीनोटॉक्सिक उत्तेजना (चित्रा 3 में सी12एफडीजी + ईडीयू-केआई 67 + डीएमएसओ-उपचारित समूह) के बिना डीएलबीसीएल कोशिकाओं में स्वाभाविक रूप से होने वाली सेनेसेंट आबादी का सटीक रूप से पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील थी।

β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि का स्तर और डीएनए संश्लेषण की लय विभिन्न सेल प्रकारों के बीच काफी भिन्न होती है। कहा इनक्यूबेशन समय (यानी, ईडीयू के लिए 3 घंटे और सी12एफडीजी के लिए 1 घंटे) आमतौर पर इन विट्रो में सकारात्मक और नकारात्मक धुंधला भेदभाव करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, विशेष परिस्थितियों में (उदाहरण के लिए, धीमी गति से बढ़ती कोशिकाएं या अत्यधिक उच्च β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि वाली कोशिकाएं), क्रमशः बेहतर भेदभाव के लिए ईडीयू लेबलिंग को लम्बा खींचना या सी12एफडीजी धुंधला करना आवश्यक हो सकता है। प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए एक धारावाहिक इनक्यूबेशन समय के साथ एक पायलट प्रयोग करने का सुझाव दिया जाता है (उदाहरण के लिए, क्रमशः ईडीयू या सी 12 एफडीजी के लिए 30 मिनट की वृद्धि या15मिनट की कमी)। प्रसार कोशिकाओं और उनके सेनेसेंट समकक्षों के बीच एफएसए-β-गैल में अंतर को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए, क्लोरोक्वीन या बाफिलोमाइसिन ए 1 के साथ प्रीइनक्यूबेशन को लाइसोसोमल क्षारीयकरण18,19 को प्रेरित करके बेसल लाइसोसोमल गतिविधि को कम करने की सिफारिश की जाती है। अपेक्षाकृत कम लाइसोसोमल गतिविधि वाली कोशिकाओं के लिए, प्रीइनक्यूबेशन चरण को छोड़ा जा सकता है।

एफएसए-β-गैल डिटेक्शन के लिए बरकरार सेल झिल्ली संरचना आवश्यक है। इस विधि में, हमने डीएनए संश्लेषण को मापने के लिए बीआरडीयू (5-ब्रोमो -2'-डीऑक्सीयूरिडीन) के बजाय ईडीयू का उपयोग किया। बीआरडीयू निगमन की तुलना में, ईडीयू को अपेक्षाकृत हल्के धुंधला स्थिति की आवश्यकता होती है, जो बरकरार झिल्ली संरचना को संरक्षित करता है और एफएसए-β-गैल के साथ सह-धुंधला होने की अनुमति देता है। विशेष रूप से, इंट्रासेल्युलर या परमाणु प्रोटीन (जैसे, αH2AX) के एंटीबॉडी-मध्यस्थता का पता लगाने के लिए यहां वर्णित कोशिका झिल्ली के पारगम्यता की भी आवश्यकता होती है ताकि एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति मिल सके। यहां, एफएसए-β-गैल सिग्नल के शमन से बचने के लिए मजबूत डिटर्जेंट ट्राइटन एक्स -100 के लिए सैपोनिन का आदान-प्रदान किया गया था।

कीमोथेरेप्यूटिक उपचार न केवल वृद्धावस्था को ट्रिगर करता है, बल्कि डीएलबीसीएल कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु भी करता है। वृद्धावस्था आबादी को मापते समय मृत कोशिकाओं का गैर-नगण्य प्रभाव हो सकता है क्योंकि धुंधला होने के दौरान झूठी सकारात्मक या झूठी नकारात्मक हो सकती है। यद्यपि अधिकांश सेल मलबे और छोटे आकार के मृत सेल निकायों को कई धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के दौरान बाहर रखा जाएगा, शेष मृत सेल आबादी में अभी भी गैर-नगण्य प्रभाव हो सकता है। कठोर कोशिका मृत्यु से बचने के लिए दवा एकाग्रता को अनुकूलित करने का सुझाव दिया जाता है। इसके अलावा, सेल व्यवहार्यता धुंधला (जैसे, भूत डाई) को मृत कोशिका आबादी को भेदभाव करने और वृद्धावस्था आबादी को अधिक कड़ाई से मापने की सुविधा के लिए नियोजित किया जा सकता है।

इस पद्धति में उपयोग की जाने वाली उन्नत इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री प्रणाली एक मल्टी-चैनल इमेजिंग फ्लो साइटोमीटर है, जो प्रवाह-साइटोमेट्री-आधारित मापों को मापने और समानांतर में एकल कोशिकाओं की बहु-रंगीन छवियों का निरीक्षण करने की अनुमति देती है। यह सेनेसेंस डिटेक्शन के लिए एक त्वरित, कुशल और सटीक मात्रात्मक समाधान प्रदान करता है, और इस बीच, कई मार्करों की स्थानिक जानकारी के साथ एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन, बहु-रंगीन छवियां उत्पन्न करता है। हालांकि, कुछ सीमाएं बनी हुई हैं। उदाहरण के लिए, छवि रिज़ॉल्यूशन उच्च अंत माइक्रोस्कोप की तुलना में सीमित है, जो नाभिक के अलावा अन्य छोटे ऑर्गेनेल में स्थित प्रोटीन को ट्रैक करते समय उपकोशिकीय स्थानीयकरण के व्यापक विश्लेषण में बाधा डालता है। एक मानक प्रवाह साइटोमीटर के परिष्कृत ऑपरेटिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर की तुलना में, जनसंख्या गेटिंग रणनीतियों को स्थापित करने या बदलने के लिए यह कम सुविधाजनक और कम कुशल है। परिमाणीकरण और सांख्यिकीय विश्लेषण भी अधिक जटिल हैं।

एफएसए-β-गैल धुंधला तेजी से धुंधला और निष्पक्ष मात्रा का ठहराव के लिए पारंपरिक एसए-β-गैल पर महत्वपूर्ण फायदे हैं और इसमें सेनेसेंट कोशिकाओं के प्रभावी वर्गीकरण की क्षमता है। इस तकनीक को कोशिका विभाजन चक्र 3,18,19,20 में फिर से प्रवेश करने वाली सेनेसेंट कोशिकाओं के लिए स्क्रीन पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है। इस पद्धति में, हमने अधिक सटीक और मज़बूती से सेनेसेंट कोशिकाओं की पहचान करने के लिए ईडीयू और αएच 2 एएक्स के साथ एफएसए-β-गैल को संयोजित करने के लिए एक कदम आगे बढ़ाया। विशेष रूप से, हालांकि एफएसए-β-गैल, ईडीयू और αएच 2 एएक्स को इस विधि में सेनेसेंस से जुड़े मार्करों के रूप में चुना गया था, अन्य विश्वसनीय सेनेसेंस मार्करों को आसानी से तीन मार्करों को प्रतिस्थापित करने या जोड़ने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अकादमिक में वृद्धावस्था में उच्च रुचि के कारण, कई विश्वसनीय सेनेसेंस से जुड़े मार्करों की पहचान की गई है, जैसे कि ऊंचा साइटोप्लाज्मिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन, स्रावित एसएएसपी कारक, डाउनरेगुलेटेड केआई 67, परमाणु आवरण प्रोटीन लैमिन बी 1 का नुकसान, और हेटरोक्रोमैटिन मार्कर एच 3 के 9 एमई 321,22 में वृद्धि हुई है। पूरक चित्रा एस 3 ने टीआईएस कार्पास422और डब्ल्यूएसयू-डीएलसीएल 2 कोशिकाओं में सी 12 एफडीजी + ईडीयू-केआई 67- सेनेसेंट आबादी का सफल पता लगाया।

इसके अलावा, इस पद्धति का उपयोग करके परीक्षण करने के लिए कई सेनेसेंस सेल सतह मार्कर उपलब्ध हैं, जैसे आईसीएएम -1, नॉच 1, नॉच 3, डीडीपी 4, सीडी 36 और यूपीएआर। सेल सतह मार्करों का पता लगाने के लिए केवल सेल निर्धारण और पारगम्यता के बिना समय इनक्यूबेशन एक छोटी एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, जो एफएसए-β-गैल और ईडीयू के साथ संयोजन में धुंधला प्रक्रिया को 6 घंटे के वर्कफ़्लो में छोटा कर देगा, या यहां तक कि एफएसए-β-गैल के संयोजन में 2 घंटे के प्रयोग में भी, और इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह लाइव-सेल इमेजिंग की अनुमति देता है। संशोधित विधि संभावित रूप से विवो में सेनेसेंस कोशिकाओं की पहचान करने के लिए क्लिनिक में एक तेज, विश्वसनीय और व्यवहार्य दृष्टिकोण के रूप में काम कर सकती है, न केवल नैदानिक और पूर्वानुमान मूल्यांकन के लिए बल्कि आगे सेनोलिटिक हस्तक्षेप का समर्थन करने के लिए भी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जोहान्स केपलर यूनिवर्सिटी लिंज़ (बीईआरएम 16108001) से योंग यू को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody Biolegend 613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) Biolegend 350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) Fisher Scientific 11590276
Chloroquin -diphosphat Sigma aldrich C6628
Cleanser (Coulter Clenz) Beckman Coulter 8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit Thermo Scientific C10418
Daunorubicin Medchemexpress HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol) Millipore 1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) Luminex CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) Luminex 100220
KARPAS DSMZ ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine Niomech D-17272
OCI-LY1 DSMZ ACC 722
Paraformaldehyde Fisher Scientific 11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)  Sigma aldrich P4902
saponin Sigma aldrich 47036
Sheath Millipore BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream Luminex 400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) VWR JT9416-1
SU-DHL6 DSMZ ACC 572
WSU-DLCL2 DSMZ ACC 575

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References

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Dovjak, E., Mairhofer, M.,… More

Dovjak, E., Mairhofer, M., Wöß, C., Qi, J., Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A., Yu, Y. Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells. J. Vis. Exp. (185), e63973, doi:10.3791/63973 (2022).

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