Summary
ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。
Abstract
化学療法薬は、癌細胞に回復不能なDNA損傷を誘発し、アポトーシスまたは早期老化をもたらす可能性がある。アポトーシス細胞死とは異なり、老化は癌細胞の増殖を抑制する根本的に異なる機構である。何十年にもわたる科学的研究により、がん細胞や間質細胞を調節する腫瘍や微小環境における老化がん細胞の複雑な病理学的影響が明らかになってきました。新しい証拠は、老化が癌治療中の強力な予後因子であることを示唆しているため、癌サンプル中の老化細胞の迅速かつ正確な検出が不可欠である。本稿では、がん細胞における治療誘発性老化(TIS)を可視化・検出する方法を提示する。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)細胞株をマフォスファミド(MAF)またはダウノルビシン(DN)で処理し、老化マーカー、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)、DNA合成マーカー5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)、およびDNA損傷マーカーγ-H2AX(γH2AX)について調べた。フローサイトメーターイメージングは、高解像度の単一細胞画像を短時間で生成し、がん細胞の3つのマーカーを同時に視覚化および定量化するのに役立ちます。
Introduction
様々な刺激が細胞老化を誘発し、細胞が安定した細胞周期停止の状態に入る原因となり得る。これらの刺激には、内因性シグナル伝達変化または外因性ストレスが含まれる。内因性シグナルには、進行性テロメア短縮、テロメア構造の変化、エピジェネティック修飾、プロテオスタシス障害、ミトコンドリア機能障害、および癌遺伝子の活性化が含まれる。外因性ストレスには、炎症性および/または組織損傷シグナル、放射線または化学的処置、および栄養欠乏が含まれる1,2,3,4。異なるタイプの老化の中で、最も一般的に見られ、よく研究されているのは、複製性老化、癌遺伝子誘発性老化(OIS)、放射線誘発性老化、および治療誘発性老化(TIS)である。OISは、異常な癌遺伝子活性化によって生じる複製ストレスによって引き起こされる遺伝毒性損傷に対する急性細胞応答であり、腫瘍前病変から本格的な腫瘍への病理学的進行をある程度防ぐことができる。TISは、腫瘍細胞が化学療法薬または電離放射線によってストレスを受けているときに起こります5,6。
老化は、その非常にダイナミックな性質のために病理学において諸刃の剣と考えられている。当初、分裂細胞の循環プールから損傷細胞を除去し、臓器の正常な機能を保護し、腫瘍増殖を阻害する有益な腫瘍抑制機構として記載されていた7,8,9。しかし、新たな証拠は老化の暗い側面を示唆している。老化細胞は、老化関連分泌表現型(SASP)として知られる炎症誘発性サイトカインを分泌し、線維症および機能不全の器官をもたらし、腫瘍の開始および進行を促進する10。さらに、老化癌細胞は、クロマチンリモデリングおよび持続的DNA損傷応答(DDR)11,12の活性化と並行してエピジェネティックおよび遺伝子発現リプログラミングを受け、新たに新しい癌幹細胞特性を獲得する3。老化可能な腫瘍は、老化が不可能な腫瘍と比較して治療介入に対してよりよく応答するが13、老化細胞の持続性は、それらが血清分解薬によって効果的に同定および排除されない場合、長期予後不良につながる可能性がある5。いずれにせよ、老化を評価するための信頼できる方法は、治療治療の予後だけでなく、老化細胞を標的とする新規戦略の開発にとっても、重要な臨床的関心がある。
異なるトリガーにかかわらず、老化細胞は、大きな液胞を有する拡大、扁平化、多核形態、有意に拡張された核、核内のH3K9me3リッチ老化関連ヘテロクロマチン(SAHF)の形成、DNA損傷マーカーγH2AX病巣の持続的な蓄積、活性化p53-p21CIP1およびRb-p16 INK4aを含むいくつかの共通の特徴を示す。 細胞周期調節機構、安定したG1細胞周期停止、SASPの大量誘導、および老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−gal)活性の上昇14。老化を定義するのに十分な単一のマーカーはないため、老化検出のゴールドスタンダードと考えられているSA-β-gal活性の酵素染色は、通常、H3K9me3およびKi67の免疫組織化学染色と組み合わせてTIS15を検出します。しかしながら、化学的発色系SA−β−galは定量化が困難である。ここでは、5-ドデカノイルアミノフルオレセイン-ジ-D-ガラクトピラノシド(C12FDG)蛍光ベースのSA-β-gal(fSA-β β-gal)検出とγH2AXおよびEdU組み込みDNAの免疫蛍光染色を組み合わせて、速度、感度、詳細な単一細胞画像とフローサイトメトリーおよび顕微鏡では提供できない空間情報を組み合わせた高度なイメージングフローサイトメーターシステムを使用して、C12 FDG+EdU-γH2AX+老化細胞を同定しました。この方法により、細胞内の蛍光シグナルの位置決めと定量を可能にする高解像度画像の迅速な生成が可能になり、標準パイプラインを構築することで複数のサンプルの迅速な分析がライセンスされます。
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Protocol
1. 細胞老化を誘導するマフォスファミドまたはダウノルビシン処理によるDLBCL細胞株
注:このプロトコルは、付着がん細胞に対しても機能します。細胞サイズに応じて、種子1〜2×105 個の細胞を6ウェルプレートの1ウェルに浸し、処理前にプレートを5%CO2、37°Cインキュベーター中で一晩インキュベートする。プロトコルの手順は浮遊細胞の場合と同じですが、2 つの例外があります。まず、ステップ3.4の後に細胞をプレートからトリプシン処理する必要があります。第2に、洗浄工程は、トリプシン処理の前に遠心分離なしで行われる。
- DLBCL細胞および種子1×106細胞/mLを1 ウェルあたり4mLの培地でカウントし、6ウェル培養プレートに入れます。10%ウシ胎児血清(FBS)および100U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地でDLBCL細胞を培養する。
- MAF(5 μg/mL)またはDN(20 ng/mL)を細胞培養物に加え、プレートを静かに揺らして混合します。
メモ: MAF と DN は安定していません。DMSOに溶解した後、原液を小分けし、-20°Cで保存すべきである。 凍結/解凍サイクルは避けるべきです。 - プレートを5%CO2、37°Cのインキュベーター内で3日間インキュベートする。
- 3日間のインキュベーション後、DLBCL細胞を15mL滅菌遠沈管に集め、100× g、4°Cで5分間スピンさせた。
- 上清を捨て、細胞ペレットを4 mLの新鮮な培地で再懸濁し、懸濁液を6ウェルプレートに戻します。
- 分析のために回収する前に、細胞プレートを5%CO2、37°Cのインキュベーター内でさらに2日間培養する。
2. 染色用溶液の調製(表1)
3. 異なる老化マーカーでDLBCL細胞を染色する
注:個々のマーカー(パシフィックブルーEdU、C12FDG、またはAlexa Fluor 647-γH2AX)で染色された細胞サンプルは、測定中の蛍光スピルオーバーを補正するための補償マトリックスを生成するために調製されます。強く示唆されていますが、異なる蛍光色素分子間で発光スペクトルの省略可能な重複(補償係数値≤0.1)がある場合、このステップは中断される可能性があります。ただし、ユーザーは、異なる機器や蛍光パネルを使用する場合、標準化された補償手順を決定する必要があります。
- ステップ1.6から生成したDLBCL細胞培養物に10mM EdU溶液を1:1,000の割合で加える(最終EdU濃度は10μM)。プレートを穏やかに揺らして混合し、5%CO2、37°Cのインキュベーター内で3時間インキュベートする。
- プレートをインキュベーターから取り出し、100 mM クロロキン溶液を終濃度 75 μM になるように加えます (ディスカッションを参照)。プレートを穏やかに揺らして混合し、5%CO2、37°Cのインキュベーター内で30分間インキュベートする。
- プレートをインキュベーターから取り出し、20mM C 12 FDG 溶液を 1:1,000 で加え、最終 C12FDG 濃度 20 μM にします。プレートを静かに揺らして混合し、5%CO2、37 °C インキュベーター内で 1 時間インキュベートします。
- プレートをインキュベーターから取り出し、100 mM 2-フェニルエチル-β-D-チオガラクトシド(PETG)溶液を1:50で加えて、fSA-β-gal染色(最終PETG濃度2 mM)を停止します。プレートを静かに回転させて混合します。
- 細胞を15mL滅菌遠沈管に移し、100 × g、4°Cで5分間スピンさせた。上清を捨て、4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄する。
- PBS洗浄工程を繰り返す。上清を捨て、細胞ペレットを500μLの4%パラホルムアルデヒド固定溶液に再懸濁する。
- 室温で10分間インキュベートした後、250× gで遠心分離機、室温で5分間培養する。上清を捨て、4mLのPBSで細胞を洗浄する。
- PBS洗浄工程を繰り返す。上清を捨て、細胞ペレットを200 μLのサポニン透過バッファーに再懸濁し、懸濁液を新しい1.5 mLチューブに移します。室温で10分間インキュベートした後、250× gで遠心分離機、室温で5分間培養する。
- 上清を捨て、細胞ペレットを200 μLの一次抗体溶液(抗体インキュベーション溶液中の1:500 γH2AX抗体)に再懸濁する。暗所で一晩4°Cでインキュベートする。
- チューブを250 × g、4°Cで5分間遠心分離する。上清を捨て、100μLのサポニン洗浄液で洗浄する。
- 洗浄ステップをさらに2回繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを500μLのEdU検出カクテルに再懸濁する。
- 暗所で室温で30分間インキュベートする。250× g、室温で5分間遠心分離する。上清を捨て、1mLのサポニン洗浄液で洗浄する。
- 洗浄工程を2回繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを20〜50μLのPBSに再懸濁する。サンプル測定については、セクション 4 に進みます。
4. イメージングフローサイトメーターシステムを用いた老化マーカーのイメージング
- 廃液ボトルを空にします。スピードビーズ、滅菌器、クリーナー、デバブラー、シース、すすぎ試薬(脱イオン水)のレベルをチェックして、機器の電源を入れる前に十分な液体を確認してください( 材料表を参照)。
- 計測器とイメージングソフトウェアの電源を入れます( 図1Aのソフトウェアインタフェースを参照)。
- スタートアップ ボタンをクリックして、 流体工学とシステムキャリブレーションを初期化します。
メモ: この手順には約 45 分かかります。 - 倍率を40倍に設定し、流体速度を低く設定し、実験に必要なレーザーをオンにします。405 nm、488 nm、および 642 nm レーザーをオンにして、それぞれ EdU-Pacific blue、C 12 FDG、Alexa Fluor 647-γH2AX(または Alexa Fluor 647-Ki67)を測定します。散乱チャンネルには Ch6、明視野には Ch1 と Ch9 を設定します。
- レーザーの強度を設定するために、最も高い蛍光を有すると予想されるサンプルから始めます。サンプルチューブを静かにひっくり返して混合します。チューブの蓋を開き、サンプルチューブをドックに挿入します。 [読み込み] をクリックして開始します。
- 散布図を開き、X 軸と Y 軸のフィーチャArea_M01とアスペクトRatio_M01をそれぞれ選択します。アスペクト比より上のゲートを0.5に設定して、下側と右側のダブレットと細胞凝集体を除外し、左側にスピードビーズ集団を除外します(図1B)。
- ヒストグラムプロットを開き、X 軸の勾配RMS_M01_Ch01機能を選択します。一重項集団を選択し、集束した細胞を選択するゲートを設定します(図1C)。
メモ:イメージングシステムは、自動的にスピードビーズを使用してイメージングの焦点を調整します。ただし、ヒストグラムのピークの右半分を、最も焦点を絞った母集団に対して選択することをお勧めします。 - ヒストグラムプロットを開き、各カラーチャンネル(Ch2、7、および11)のX軸の生の最大ピクセル強度を選択します。レーザー出力を調整します (つまり、Ch2、7、および 11 のレーザーはそれぞれ 488 nm、405 nm、および 642 nm レーザー)、過飽和を避けるために、各蛍光色素の Raw Max Pixel 値が 100 ~ 4,000 になるようにします。
メモ: この実験では、レーザー出力の設定は、レーザー 488 nm、405 nm、および 642 nm の場合、それぞれ 50 mW、200 mW、および 50 mW です。 - 記録する焦点を絞った母集団を選択し、[ 集録] をクリックして、一貫した設定でDLBCLサンプルを測定します。測定用のサンプルを変更する場合は、[ 戻る] をクリックしてサンプルチューブを回収します。 Load を押してサンプルを 破棄 します。
- すべてのサンプルが測定されたら、明視野と散乱レーザーをオフにします。単色コントロールサンプルを測定して補正マトリックスを生成します。
- シャットダウンをクリックして、イメージングシステムを閉じます。
- 画像解析ソフトでデータを解析します。
- 画像解析ソフトウェアの スポットウィザード ツールを使用して、生細胞画像中の核γH2AX病巣を自動的にカウントおよび定量します。2 つの細胞集団 (1 つは高い細胞集団ともう 1 つは低いスポット数) を選択して、スポットウィザードをトレーニングして、さらに自動スポットカウント分析を行います。
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Representative Results
画像解析ソフトウェアを用いて、単色対照サンプルの記録データをロードして補正マトリックスを生成した。 補足図S1に示すように、EdUからC12 FDGへの無視できない(係数値≥0.1)光スピルオーバーはクロストーク係数値0.248で検出されましたが、他のチャネル間のクロストークは有意ではありませんでした。4つの異なるDLBCL細胞株を5μg/mL MAFまたは20ng/mL DNで処理して細胞老化を誘導し、従来のSA-β-gal染色またはイメージングフローサイトメトリー法のいずれかを用いて分析した。
KARPAS422、WSU-DLCL2、およびOCI-LY1細胞の70%以上がSA-β-gal陽性で示された老化状態に入り、SU-DHL6はMAFおよびDNによる老化誘導に対して完全に耐性であった(補足図S2A)。注目すべきことに、MAFおよびDNはまた、劇的ではないが、すべてのDLBCL細胞において細胞死を誘導した(補足図S2B)。イメージングフローサイトメトリー法を用いて、単一細胞画像、およびフローサイトメトリーベースの定量は、KARPAS422、WSU-DLCL2、およびOCI-LY1においてC12FDG+EdU-γH2AX+老化集団の増加を示したが、SU-DHL6細胞では増加しず(図2A-D)、従来のSA-β-gal染色結果と一致した。しかしながら、C12FDG+EdU-γH2AX+老化集団の割合は、従来のSA-β-gal染色法よりも有意に低かった(図2および補足図S2)。
さらに、イメージングフローサイトメトリー分析は、異なるDLBCL細胞株間で多様な老化誘導性を示したが、従来のSA-β-gal染色では明確に区別されなかった。C12FDG+EdU-γH2AX+老化期OCI-LY1細胞の割合(すなわち、MAFおよびDNでそれぞれ43.2%および31.9%)は、KARPAS422(MAFおよびDNでそれぞれ62.2%および73.8%)およびWSU-DLCL2(MAFおよびDNでそれぞれ60%および58.1%)のそれよりも有意に低かった(図2)。重要なことに、イメージングベースの解析では、KARPAS422、WSU-DLCL2、およびOCI-LY1では有意に高い数のγH2AX病巣が提示されましたが、SU-DHL6細胞ではそうではありませんでした(図3A、B)。
図1:オペレーティングソフトウェアインタフェースと計測器のセットアップ(A)イメージングフローサイトメータソフトウェアインタフェース生細胞画像パネル(左上)には、12 個の画像チャンネルすべての生細胞画像と画像調整ツール (ズーム、細胞集団選択、色変更、マスク、画像プロパティ調整など) が含まれています。フローサイトメトリー分析領域(左下)には、ヒストグラムプロット、散布図、さまざまな領域ゲーティング、レイアウト、人口統計など、フローサイトメトリー分析用のツールバーが含まれています。コントロールパネル(右)には、データの取得と保存、照明設定、倍率、流体速度制御、フォーカス、センタリング用のメニューがあります。(b)単一細胞集団の選択。(c)集束細胞集団の選択。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単一細胞レベルでの老化細胞の可視化と定量化。 (A)KARPAS422、(B)WSU-DLCL2、(C)OCI-LY1、および(D)SU-DHL6細胞を5 μg/mL MAFまたは20 ng/mL DNで5日間処理し、fSA-β-gal、EdU、およびγH2AXで染色したC12FDG+EdU-γH2AX+老化細胞(右パネル)の代表的な画像(左パネル)およびフローサイトメトリー解析。DMSO処理細胞をコントロールとして用いた。略語:C12FDG=5-ドデカノイルアミノフルオレセイン-ジ-β-Dgalactoピラノシド;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;γH2AX=ヒストンH2AXのリン酸化型;DMSO=ジメチルスルホキシド;MAF = マフォスファミド;DN = ダウノルビシン;fSA-β-gal = 蛍光ベースの老化関連β-ガラクトシダーゼ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:老化細胞における核γH2AX病巣のイメージングベースの定量(A)DLBCL細胞におけるγH2AX病巣の代表的な画像(治療および染色の詳細については図2のテキストを参照)。(B)DLBCL細胞におけるγH2AX病巣カウントの頻度(左)および定量(右)。略語:γH2AX=ヒストンH2AXのリン酸化型;DMSO=ジメチルスルホキシド;MAF = マフォスファミド;DN = ダウノルビシン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | コメント | |
| DMSOの10 mM EdUソリューション | -20°Cで保存してください。 | |
| DMSO での 20 mM C12FDG ソリューション | -20°Cで保存してください。 | |
| イオン交換水中の100mMクロロキン溶液 | -20°Cで保存してください。 | |
| 脱イオン水中の100mM PETG溶液 | -20°Cで保存してください。 | |
| 固定溶液:PBS中の4%PFA(パラホルムアルデヒド) | 新しく準備された。警告: PFA は有害です。適切な予防措置をとって使用してください。 | |
| 透過バッファー:PBS中の1%サポニン(w / v)、3%BSA(w / v)、新たに調製した。 | 作りたて | |
| 抗体インキュベーション溶液:PBS中の0.1%サポニン(w / v)、3%BSA(w / v) | 作りたて | |
| 洗浄液:PBS中の0.1%サポニン(w / v)、0.5%BSA(w / v) | 作りたて | |
| EdU 検出カクテル: CuSO4 (100 mM) を 1:50 で希釈し、太平洋青アジド溶液を 1:200 で、反応バッファー添加剤 (200 mg/mL) を PBS で 1:100 で希釈します。 | 作りたて | |
表1:染色用溶液
補足図S1:EdU-パシフィックブルー、C12FDG-フルオレセイン、およびAF647-γH2AXの補償マトリックス。 略語:C12FDG=5-ドデカノイルアミノフルオレセイン-ジ-β-Dgalactoピラノシド;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;γH2AX=ヒストンH2AXのリン酸化型;AF647 = アレクサ・フルオール 647。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:DLBCL細胞株の治療誘発性老化。 (A)5 μg/mL MAFまたは20 ng/mL DNで処理した指示されたDLBCL細胞株の従来のSA-β-gal染色(左パネル)および定量(右パネル)。 スケールバー= 50μm。 (B)フローサイトメトリー(左パネル)および定量(右パネル)によって分析された細胞死の割合 Aのように。細胞を、室温で15分間ゴースト染料パシフィックブルーで染色した。略語:DMSO=ジメチルスルホキシド;MAF = マフォスファミド;DN = ダウノルビシン;SA-β-gal = 老化関連β-ガラクトシダーゼ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:代表的な画像およびフローサイトメトリー解析。(A)KARPAS422およびWSU-DLCL2細胞のC12FDG+EdU-Ki67+老化細胞の代表的な画像およびフローサイトメトリー解析(B)MAFで5日間処理し、fSA-β-gal、EdU、およびKi67について染色した。DMSO処理細胞をコントロールとして用いた。略語:C12FDG=5-ドデカノイルアミノフルオレセイン-ジ-β-Dgalactoピラノシド;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;DMSO=ジメチルスルホキシド;MAF = マフォスファミド;DN = ダウノルビシン;fSA-β-gal = 蛍光ベースの老化関連β-ガラクトシダーゼ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、明視野イメージングおよびフローサイトメトリーベースの定量化を用いて、化学療法治療時の4つの異なるDLBCL細胞株の老化侵入能力を調べた。単一細胞レベルでは、治療されたKARPAS422およびWSU-DLCL2細胞において主要なC12 FDG+EdU-Ki67+老化集団を検出することに成功し、OCI-LY1細胞においてより少ない程度であったが、SU-DHL6細胞株は治療に対して耐性であった。細胞株間の老化導入能力の違いは、それらの明確なゲノム欠損によって説明され得る16,17。しかしながら、不適切な細胞培養密度または薬物濃度も老化誘導性に影響を及ぼす可能性がある。細胞密度および薬物濃度の段階希釈は、より包括的な検査のために慎重に選択されるべきである。特に、この方法は、追加の遺伝毒性刺激なしにDLBCL細胞中の天然に存在する老化集団を正確に検出するのに十分な感度を有していた(図3のC12FDG+EdU-Ki67+ DMSO処置群)。
β-ガラクトシダーゼ活性のレベルおよびDNA合成のリズムは、異なる細胞型間で大きく異なる。記載されたインキュベーション時間(すなわち、EdUについては3時間、C12FDGについては1時間)は、一般に、インビトロでの陽性染色と陰性染色を区別するのに十分である。しかしながら、特殊な状況(例えば、増殖の遅い細胞または極めて高いβ-ガラクトシダーゼ活性を有する細胞)では、それぞれより良い識別のために、EdU標識を延長するか、またはC12FDG染色を短縮することが必要な場合がある。実験条件を最適化するために、連続インキュベーション時間でパイロット実験を行うことが推奨される(例えば、EdUまたはC12FDGについてそれぞれ30分の増加または15分の減少)。増殖細胞と老化細胞との間のfSA-β-galの違いをよりよく区別するために、クロロキンまたはバフィロマイシンA1とのプレインキュベーションは、リソソームアルカリ化を誘導することによって基礎リソソーム活性を低下させることが推奨される18,19。比較的低いリソソーム活性を有する細胞の場合、プレインキュベーション工程は省略することができる。
無傷の細胞膜構造は、fSA-β-gal検出に不可欠である。この方法では、BrdU(5-ブロモ-2'-デオキシウリジン)の代わりにEdUを用いてDNA合成を測定した。BrdU の組み込みと比較して、EdU は、無傷の膜構造を維持し、fSA-β-gal との共染色を可能にする比較的穏やかな染色条件を必要とします。特に、ここで説明する細胞内または核タンパク質(例えば、γH2AX)の抗体媒介性検出も、抗体の侵入を可能にするために細胞膜の透過処理を必要とする。ここで、サポニンは、fSA−β−galシグナルの急冷を避けるために強力な洗剤Triton X−100と交換された。
化学療法的治療は、老化を引き起こすだけでなく、DLBCL細胞における細胞死も引き起こす。死細胞は、染色中に偽陽性または偽陰性をもたらす可能性があるため、老化集団を定量化する際に無視できない影響を与える可能性があります。細胞破片および小型の死細胞体の大部分は、複数回の洗浄および遠心分離ステップの間に除外されるが、残りの死細胞集団は依然として無視できない影響を有する可能性がある。劇的な細胞死を避けるために薬物濃度を最適化することが示唆されている。加えて、細胞生存率染色(例えば 、ゴースト色素)は、死細胞集団の判別を容易にし、老化集団をより厳密に定量化するために採用することができる。
この方法で使用される高度なイメージングフローサイトメトリーシステムは、フローサイトメトリーベースの測定値を定量化し、単一細胞のマルチカラー画像を並行して検査することを可能にするマルチチャネルイメージングフローサイトメーターです。老化検出のための迅速、効率的、正確な定量ソリューションを提供し、その間に、複数のマーカーの空間情報を含む単一細胞解像度のマルチカラー画像を生成します。ただし、いくつかの制限は残っています。例えば、画像分解能はハイエンド顕微鏡と比較して制限されており、核以外の小さな細胞小器官に位置するタンパク質を追跡する場合、細胞内局在の包括的な分析を妨げる。標準的なフローサイトメーターの洗練された操作および分析ソフトウェアと比較して、集団ゲーティング戦略を設定または変更することは不便で効率的ではありません。定量化と統計分析もより複雑です。
fSA-β-gal染色は、迅速な染色および偏りのない定量化において従来のSA-β-galよりも大きな利点を有し、老化細胞の効果的な分類の可能性を秘めている。この技術は、細胞分裂サイクル3、18、19、20に再突入する老化細胞のスクリーニングに首尾よく適用されている。この方法では、fSA-β-galをEdUおよびγH2AXと組み合わせて、老化細胞をより正確かつ確実に同定するために、さらに一歩踏み出しました。特に、この方法において老化関連マーカーとしてfSA-β-gal、EdU、およびγH2AXが選択されたが、他の信頼できる老化マーカーは、3つのマーカーを置換または追加するために容易に適合させることができる。学術界における老化への関心が高いため、細胞質活性酸素種(ROS)産生の上昇、分泌されたSASP因子、下方制御されたKi67、核エンベロープタンパク質Lamin B1の喪失、およびヘテロクロマチンマーカーH3K9me3の増加など、多くの信頼できる老化関連マーカーが同定されている21,22。補足図S3は、TIS KARPAS422およびWSU−DLCL2細胞におけるC12FDG+EdU−Ki67−老化集団の検出の成功を示した。
さらに、ICAM-1、NOTCH1、NOTCH3、DDP4、CD36、およびuPARなど、この方法を使用して試験することができる多くの老化細胞表面マーカーが存在する。細胞表面マーカーの検出は、細胞固定および透過処理なしで短い抗体インキュベーション時間のみを必要とするため、染色手順は、fSA-β-galおよびEdUと組み合わせて6時間のワークフローに短縮されるか、fSA-β-galのみと組み合わせて2時間の実験に短縮され、さらに重要なことに、生細胞イメージングが可能になります。この修正された方法は、診断的および予後的評価のためだけでなく、さらなる血清分解的介入を支援するためにも、 インビボで老化細胞を同定するための診療所における迅速で信頼性が高く、実行可能なアプローチとして役立つ可能性がある。
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Disclosures
著者らは、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、ヨハネス・ケプラー大学リンツ校(BERM16108001)からヨン・ユーへの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
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