Summary
여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.
Abstract
화학 요법 약물은 암세포에서 돌이킬 수없는 DNA 손상을 유도하여 아폽토시스 또는 조기 노화를 유발할 수 있습니다. 세포사멸 세포 사멸과는 달리, 노화는 암세포의 번식을 억제하는 근본적으로 다른 기계이다. 수십 년간의 과학적 연구는 암세포와 기질 세포를 조절하는 종양 및 미세 환경에서 노인성 암 세포의 복잡한 병리학 적 효과를 밝혀 냈습니다. 새로운 증거는 노화가 암 치료 중 강력한 예후 인자이므로 암 샘플에서 노화 세포의 신속하고 정확한 검출이 필수적임을 시사합니다. 이 논문은 암세포에서 치료 유도 노화 (TIS)를 시각화하고 검출하는 방법을 제시합니다. 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) 세포주를 마포스파미드 (MAF) 또는 다우노루비신 (DN)으로 처리하고, 노화 마커, 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal), DNA 합성 마커 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU), 및 DNA 손상 마커 감마-H2AX (γH2AX)에 대해 조사하였다. 유세포 분석기 이미징은 단기간에 고해상도 단일 세포 이미지를 생성하여 암세포의 세 가지 마커를 동시에 시각화하고 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
다양한 자극은 세포 노화를 유발하여 세포가 안정된 세포 주기 정지 상태로 진입하게 할 수 있습니다. 이러한 자극에는 내재적 신호 변화 또는 외적 스트레스가 포함됩니다. 내재적 신호에는 진행성 텔로미어 단축, 텔로미어 구조의 변화, 후성유전학적 변형, 프로테오스타시스 장애, 미토콘드리아 기능장애, 종양유전자의 활성화가 포함된다. 외인성 스트레스에는 염증 및/또는 조직 손상 신호, 방사선 또는 화학적 치료, 영양 결핍 1,2,3,4가 포함됩니다. 뚜렷한 유형의 노화 중에서 가장 일반적으로 볼 수 있고 잘 연구 된 것은 복제 노화, 종양 유전자 유도 노화 (OIS), 방사선 유도 노화 및 치료 유도 노화 (TIS)입니다. OIS는 비정상적인 종양유전자 활성화에 의해 생성된 복제 스트레스에 의해 야기되는 유전독성 손상에 대한 급성 세포 반응이며, 신생물성 병변으로부터 본격적인 종양으로의 병리학적 진행을 어느 정도 예방할 수 있다. TIS는 종양 세포가 화학 요법 약물 또는 이온화 방사선 5,6에 의해 스트레스를 받을 때 발생합니다.
노화는 매우 역동적 인 특성으로 인해 병리학에서 양날의 검으로 간주됩니다. 처음에는 분열 세포의 순환 풀에서 손상된 세포를 제거하고 장기의 정상적인 기능을 보호하고 종양 성장 7,8,9을 억제하는 유익한 종양 억제 메커니즘으로 설명되었습니다. 그러나 새로운 증거는 노화의 어두운면을 시사했다. 노화 세포는 노화 관련 분비 표현형(SASP)으로 알려진 전염증성 사이토카인을 분비하여, 섬유증 및 기능성 기관을 유도하고 종양 개시 및 진행을 촉진한다(10). 더욱이, 노년기 암세포는 후성유전학적 및 유전자-발현 리프로그래밍을 통해 크로마틴 리모델링 및 지속적인 DNA-손상 반응(DDR)11,12의 활성화와 병행하여, 새로운 암-줄기-세포 특성을 새롭게 획득한다3. 노화가 가능한 종양은 노화가 불가능한 종양(13)에 비해 치료 개입에 더 잘 반응하지만, 노화 세포의 지속성은 혈청용해제에 의해 효과적으로 확인되고 제거되지 않으면 장기간 예후가 좋지 않을 수 있다5. 어느 쪽이든, 노화를 평가하는 신뢰할 수있는 방법은 치료 치료의 예후뿐만 아니라 노인 세포를 목표로하는 새로운 전략 개발에도 중요한 임상 적 관심사입니다.
다른 트리거에 관계없이, 노화 세포는 큰 액포를 갖는 확대, 평탄화, 다핵 형태학, 상당히 확장된 핵, 핵에서 H3K9me3 풍부 노화 관련 헤테로크로마틴(SAHF)의 형성, DNA 손상 마커 γH2AX 초점의 지속적인 축적, 활성화된 p53-p21CIP1 및 Rb-p16INK4a 등 몇 가지 공통된 특징을 나타낸다. 세포 주기 조절 메카니즘, 안정한 G1 세포 주기 정지, SASP의 대규모 유도, 및 상승된 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal) 활성14. 노화를 정의하기에 충분한 단일 마커가 없기 때문에, 노화 검출의 황금 표준으로 간주되는 SA-β-gal 활성에 대한 효소 염색은 일반적으로 TIS15를 검출하기 위해 H3K9me3 및 Ki67에 대한 면역 조직화학 염색과 결합됩니다. 그러나, 화학적 염색체-기반 SA-β-gal은 정량화하기가 어렵다. 여기에서는 5-도데카노일아미노플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드(C12 FDG) 형광 기반 SA-β-gal(fSA-β-gal) 검출을 γH2AX 및 EdU 혼입 DNA에 대한 면역형광 염색과 결합하여 속도, 감도 및 상세한 단일 세포 이미지를 유세포 분석기 및 현미경으로 제공할 수 없는 공간 정보와 결합한 고급 이미징 유세포 분석기 시스템을 사용하여C12FDG+EdU-γH2AX+ 노인 세포를 확인했습니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 이미지를 신속하게 생성할 수 있으므로 세포 내에서 형광 신호를 배치하고 정량화할 수 있으며, 표준 파이프라인을 구축하여 여러 샘플을 신속하게 분석할 수 있습니다.
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Protocol
1. 세포 노화를 유도하기 위해 마포스파미드 또는 다우노루비신 처리를 이용한 DLBCL 세포주
참고: 이 프로토콜은 부착성 암세포에도 적용됩니다. 세포 크기에 따라, 시드 1-2 × 10개의 5개 세포를 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 넣고 플레이트를5 %CO2, 37°C 인큐베이터에서 밤새 처리 전에 인큐베이션한다. 프로토콜 단계는 서스펜션 셀과 동일하지만 두 가지 예외가 있습니다. 먼저, 세포는 단계 3.4 후에 플레이트 밖으로 트립신화될 필요가 있다. 둘째, 세척 단계는 트립신화 전에 원심분리 없이 수행된다.
- DLBCL 세포를 계수하고 1 × 10 6 세포/mL를 웰당 배지 4 mL에 넣고6 -웰 배양 플레이트에 넣는다. DLBCL 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하십시오.
- MAF (5 μg / mL) 또는 DN (20 ng / mL)을 세포 배양물에 넣고 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하십시오.
참고: MAF 및 DN은 안정적이지 않습니다. DMSO에 용해시킨 후, 원액을 분취하여 -20°C에서 보관해야 한다. 동결 / 해동 사이클은 피해야합니다. - 플레이트를 3일 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
- 3일간 배양한 후, DLBCL 세포를 15 mL 멸균 원심분리 튜브에 수집하고, 100 × g, 4°C에서 5분 동안 스핀시켰다.
- 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 4 mL의 신선한 배지로 재현탁시키고, 현탁액을 다시 6-웰 플레이트에 첨가한다.
- 세포 플레이트를 분석을 위해 수확하기 전에 또 다른 2일 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 배양한다.
2. 염색용 용액 준비(표 1)
3. 다른 노화 마커를 갖는 염색 DLBCL 세포
참고: 개별 마커(즉, 퍼시픽 블루-EdU,C12FDG 또는 알렉사 플루오르 647-γH2AX)로 염색된 세포 샘플은 측정 동안 형광 유출을 보정하기 위해 보상 매트릭스를 생성하도록 준비된다. 고도로 제안되었지만, 이 단계는 상이한 형광단들 사이에서 방출 스펙트럼들의 생략가능한 중첩(보상 계수 값 ≤ 0.1)이 있을 때 현탁될 수 있다. 그러나 사용자는 다른 기기와 형광 패널을 사용할 때 표준화 된 보상 단계를 결정해야합니다.
- 1:1,000의 비율로 10 mM EdU 용액을 단계 1.6에서 생성된 DLBCL 세포 배양물에 첨가한다(최종 EdU 농도는 10 μM이다). 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 3시간 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
- 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 100 mM 클로로퀸 용액을 최종 농도 75 μM로 첨가한다 (논의 참조). 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 30분 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
- 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 20 mMC12FDG 용액을 1:1,000에서 20 μM의 최종 C12FDG 농도에 첨가한다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 1:50에 100 mM 2-페닐에틸-β-D-티오갈락토시드(PETG) 용액을 첨가하여 fSA-β-gal 염색을 중단시켰다(최종 PETG 농도 2 mM). 플레이트를 부드럽게 돌려 혼합합니다.
- 세포를 15 mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고 100 × g, 4°C에서 5분 동안 스핀한다. 상청액을 버리고 세포를 4 mL의 인산완충식염수(PBS)로 세척한다.
- PBS 세척 단계를 반복한다. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 500 μL의 4% 파라포름알데히드 고정 용액에 재현탁시킨다.
- 실온에서 10분 인큐베이션한 후, 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 세포를 PBS 4 mL로 세척한다.
- PBS 세척 단계를 반복한다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 사포닌 투과화 완충액에 재현탁시키고, 현탁액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 실온에서 10분 인큐베이션한 후, 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 세포 펠렛을 200 μL의 일차 항체 용액 (항체 인큐베이션 용액 중 1:500 γH2AX 항체)에 재현탁시킨다. 어둠 속에서 하룻밤 동안 4°C에서 인큐베이션한다.
- 튜브를 250 × g, 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 100 μL의 사포닌 세척 용액으로 세척한다.
- 세척 단계를 추가로 두 번 반복하십시오. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 500 μL의 EdU 검출 칵테일에 재현탁시킨다.
- 어둠 속에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 사포닌 세척액 1mL로 세척한다.
- 세척 단계를 두 번 반복하십시오. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 PBS의 20-50 μL에 재현탁시킨다. 샘플 측정을 위해 섹션 4로 진행하십시오.
4. 이미징 유세포 분석기 시스템을 사용하여 노화 마커 이미징
- 폐액 병을 비우십시오. 장비를 켜기 전에 충분한 유체를 확보하기 위해 속도 비드, 멸균기, 클리너, 디버블러, 시스 및 헹굼 시약 (탈 이온수)의 수준을 확인하십시오 ( 재료 표 참조).
- 계측기 및 이미징 소프트웨어를 켭니다( 그림 1A의 소프트웨어 인터페이스 참조).
- 시작 버튼을 클릭하여 유체 공학 및 시스템 교정을 초기화합니다.
참고: 이 절차는 약 45분 정도 걸립니다. - 배율을 40x로 설정하고 유체 속도를 낮게 설정한 다음 실험에 필요한 레이저를 켭니다. 405nm, 488nm 및 642nm 레이저를 켜서 EdU-pacific blue,C12FDG 및 Alexa Fluor 647-γH2AX(또는 Alexa Fluor 647-Ki67)를 각각 측정합니다. 분산형 채널에는 Ch6을, 브라이트필드에는 Ch1과 Ch9를 설정합니다.
- 레이저의 강도를 설정하기 위해 가장 높은 형광을 가질 것으로 예상되는 샘플부터 시작하십시오. 샘플 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 튜브 뚜껑을 열고 샘플 튜브를 도크에 삽입합니다. 로드 를 클릭하여 시작하십시오.
- 산점도를 열고 X축과 Y축에 대해 각각 Area_M01 피쳐와 종횡비 Ratio_M01을 선택합니다. 게이트를 종횡비 0.5 이상으로 설정하여 아래와 오른쪽의 더블릿 및 셀 응집체를 제외하고, 왼쪽에는 스피드 비드 모집단을 제외합니다(그림 1B).
- 히스토그램 플롯을 열고 X축에 대한 그라디언트 RMS_M01_Ch01 피쳐를 선택합니다. 일중항 모집단을 선택하고 집중된 셀을 선택할 게이트를 설정합니다(그림 1C).
주: 이미징 시스템은 자동으로 스피드 비드를 사용하여 이미징을 위한 초점을 조정합니다. 그러나 가장 집중된 모집단에 대해 히스토그램 피크의 오른쪽 절반을 선택하는 것이 좋습니다. - 히스토그램 플롯을 열고 각 색상 채널(Ch2, 7 및 11)에 대해 X축에 대해 원시 최대 픽셀 강도를 선택합니다. 레이저 파워(즉, Ch2, 7 및 11의 경우 각각 488nm, 405nm 및 642nm 레이저)를 조정하여 과포화를 피하기 위해 각 형광색이 100에서 4,000 사이의 원시 최대 픽셀 값을 갖도록 합니다.
참고: 이 실험에서 레이저 전력 설정은 레이저 488nm, 405nm 및 642nm의 경우 각각 50mW, 200mW 및 50mW입니다. - 기록할 집중 모집단을 선택하고 획득 을 클릭하여 일관된 설정으로 DLBCL 샘플을 측정합니다. 측정을 위해 샘플을 변경할 때 반환 을 클릭하여 샘플 튜브를 복구하십시오. 로드 를 눌러 샘플을 삭제 합니다.
- 모든 샘플이 측정 된 후 밝은 필드와 산란 레이저를 끕니다. 단색 제어 샘플을 측정하여 보정 매트릭스를 생성합니다.
- 종료를 클릭하여 이미징 시스템을 닫습니다.
- 이미지 분석 소프트웨어의 데이터를 분석합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어의 스팟 마법사 도구를 사용하여 라이브 셀 이미지에서 핵 γH2AX 초점을 자동으로 계산하고 정량화할 수 있습니다. 두 개의 세포 집단(하나는 높은 세포와 낮은 반점 카운트)을 선택하여 추가 자동 스팟 카운트 분석을 위해 스팟 마법사를 훈련시킵니다.
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Representative Results
보상 매트릭스는 단색 제어 샘플의 기록된 데이터를 로딩하여 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. 보충 그림 S1에 나타난 바와 같이, EdU에서 C12 FDG로의 무시할 수 없는(계수 값 ≥0.1) 광 유출은 누화 계수 값 0.248로 검출된 반면, 다른 채널들 사이의 누화는 유의하지 않았다. 네 개의 상이한 DLBCL 세포주를 5 μg/mL MAF 또는 20 ng/mL DN로 처리하여 세포 노화를 유도하고 기존의 SA-β-gal 염색 또는 이미징 유세포 분석기 방법을 사용하여 분석하였다.
KARPAS422, WSU-DLCL2 및 OCI-LY1 세포의 70% 이상이 SA-β-gal 양성으로 나타나는 노화 상태에 들어간 반면, SU-DHL6은 MAF 및 DN에 의한 노화 유도에 완전히 내성을 보였다(보충 그림 S2A). 주목할 만하게, MAF 및 DN은 또한 극적으로 비록 아니지만 모든 DLBCL 세포에서 세포 사멸을 유도하였다 (보충도 S2B). 영상화 유세포 분석기 방법을 사용하여, 단일 세포 이미지 및 유세포 분석기-기반 정량화는 SU-DHL6 세포에서는 그렇지 않은 KARPAS422, WSU-DLCL2, 및 OCI-LY1에서 증가된 C12FDG+EdU-γH2AX+ 노인 집단을 나타냈으며(도 2A-D), 이는 종래의 SA-β-gal 염색 결과와 일치하였다. 그러나,C12FDG+EdU-γH2AX+ 노인 집단의 백분율은 종래의 SA-β-gal 염색 방법보다 현저히 낮았다(도 2 및 보충도 S2).
더욱이, 이미징 유세포 분석 결과는 상이한 DLBCL 세포주 사이에서 다양한 노화 유도성을 나타냈으며, 이는 종래의 SA-β-gal 염색에 의해 명확하게 구별되지 않았다. C12FDG+EdU-γH2AX+ 노인성 OCI-LY1 세포의 백분율(즉, MAF 및 DN의 경우 각각 43.2% 및 31.9%)은 KARPAS422(MAF 및 DN의 경우 각각 62.2% 및 73.8%)와 WSU-DLCL2(MAF 및 DN의 경우 각각 60% 및 58.1%)보다 유의하게 낮았다(그림 2). 중요하게도, 영상화 기반 분석은 KARPAS422, WSU-DLCL2 및 OCI-LY1에서는 상당히 더 많은 수의 γH2AX 초점이 나타났지만 SU-DHL6 세포에서는 그렇지 않았다(도 3A,B).
그림 1: 작동 소프트웨어 인터페이스 및 기기 설정 . (A) 이미징 유량계-세포계 소프트웨어 인터페이스. 라이브 셀 이미지 패널(왼쪽 상단)은 모든 12개의 이미지 채널 및 이미지 조정 도구(예: 줌, 셀 집단 선택, 색상 변경, 마스크 및 이미지 속성 조정)의 라이브 셀 이미지를 포함합니다. 유세포 분석 영역(왼쪽 아래)에는 히스토그램 플롯, 산점도, 다양한 영역 게이팅, 레이아웃 및 인구 통계와 같은 유세포 분석을 위한 도구 모음이 포함되어 있습니다. 제어판(오른쪽)에는 데이터 수집 및 저장, 조명 설정, 배율, 유체 속도 제어, 초점 및 센터링을 위한 메뉴가 포함되어 있습니다. (B) 단세포 집단의 선택. (c) 집중된 세포 집단의 선택. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단일 세포 수준에서 노화 세포의 시각화 및 정량화. (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1, 및 (D) SU-DHL6 세포를 5일 동안 5 μg/mL MAF 또는 20 ng/mL DN로 처리한 SU-DHL6 세포의 C12 FDG+EdU-γH2AX+ 노인성 세포(오른쪽 패널)의 대표적인 이미지(왼쪽 패널) 및 유세포 분석 및 fSA-β-gal, EdU 및γH2ACX에 대해 염색하였다. DMSO 처리된 세포를 대조군으로 사용하였다. 약어:C12FDG = 5-도데카노일아미노플루오레세인-디β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; γH2AX = 히스톤 H2AX의 인산화된 형태; DMSO = 디메틸설폭사이드; MAF = 마포스파미드; DN = 다우노루비신; fSA-β-gal = 형광-기반 노화-관련 β-갈락토시다제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 노화 세포에서 핵 γH2AX 초점의 이미징 기반 정량화. (A) DLBCL 세포에서 γH2AX 초점의 대표적인 이미지(처리 및 염색 세부사항은 도 2의 텍스트 참조). (b) DLBCL 세포에서 γH2AX 초점의 주파수 (왼쪽) 및 정량화 (오른쪽). 약어: γH2AX = 히스톤 H2AX의 인산화된 형태; DMSO = 디메틸설폭사이드; MAF = 마포스파미드; DN = 다우노루비신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 코멘트 | |
| DMSO 중의 10 mM EdU 용액 | -20°C에서 보관한다. | |
| DMSO 중의 20 mM C12FDG 용액 | -20°C에서 보관한다. | |
| 탈이온수 중 100 mM 클로로퀸 용액 | -20°C에서 보관한다. | |
| 탈이온수 중 100 mM PETG 용액 | -20°C에서 보관한다. | |
| 고정 용액 : PBS 중 4 % PFA (파라 포름 알데히드) | 갓 준비; 주의: PFA는 해롭다. 적절한 예방 조치와 함께 사용하십시오. | |
| 투과화 완충액: PBS에서 1% 사포닌 (w/v), 3% BSA (w/v), 갓 준비. | 갓 준비한 | |
| 항체 인큐베이션 용액: PBS 중 0.1% 사포닌 (w/v), 3% BSA (w/v) | 갓 준비한 | |
| 세척 용액: PBS에서 0.1% 사포닌 (w/v), 0.5% BSA (w/v) | 갓 준비한 | |
| EdU 검출 칵테일: PBS에서 1:50에 CuSO4 (100 mM)를 희석하고, 1:200에 퍼시픽 블루 아지드 용액 및 반응 완충액 첨가제 (200 mg/mL)를 1:100에 희석 | 갓 준비한 | |
표 1: 염색을 위한 용액.
보충 그림 S1: EdU-pacific blue,C12FDG-Fluorescein 및 AF647-γH2AX의 보상 매트릭스. 약어:C12FDG = 5-도데카노일아미노플루오레세인-디β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; γH2AX = 히스톤 H2AX의 인산화된 형태; AF647 = 알렉사 플루오르 647. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충도 S2: 치료-유도된 DLBCL 세포주의 노화. (A) 5 μg/mL MAF 또는 20 ng/mL DN으로 처리된 지시된 DLBCL 세포주의 종래의 SA-β-gal 염색(왼쪽 패널) 및 정량화(오른쪽 패널). 스케일 막대 = 50 μm. (B) A에서와 같이 DLBCL 세포주의 유세포 분석기(왼쪽 패널) 및 정량화(오른쪽 패널)에 의해 분석된 세포 사멸의 백분율. 세포를 실온에서 15분 동안 고스트 염료-퍼시픽 블루로 염색하였다. 약어: DMSO = 디메틸설폭사이드; MAF = 마포스파미드; DN = 다우노루비신; SA-β-gal = 노화-관련 β-갈락토시다제. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도표 S3: 대표적인 이미지 및 유세포 분석 (A) MAF로 5일 동안 처리된 KARPAS422 및 WSU-DLCL2 세포의C12FDG+EdU-Ki67+ 노인성 세포(B)의 대표적인 이미지 및 유세포 분석 및 fSA-β-gal, EdU 및 Ki67에 대해 염색하였다. DMSO 처리된 세포를 대조군으로 사용하였다. 약어:C12FDG = 5-도데카노일아미노플루오레세인-디β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; DMSO = 디메틸설폭사이드; MAF = 마포스파미드; DN = 다우노루비신; fSA-β-gal = 형광-기반 노화-관련 β-갈락토시다제. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법은 화학 요법 치료시 네 개의 다른 DLBCL 세포주의 노화 진입 능력을 밝은 필드 이미징 및 유세포 측정 기반 정량화로 조사했습니다. 단일 세포 수준에서, 우리는 처리 된 KARPAS422 및 WSU-DLCL2 세포에서 주요C12 FDG + EdU-Ki67 + 노인성 집단을 성공적으로 검출했으며, OCI-LY1 세포에서는 SU-DHL6 세포주가 치료에 내성을 갖는 반면, OCI-LY1 세포에서는 더 적은 정도까지 성공적으로 검출했습니다. 세포주 사이의 노화 진입 능력의 차이는 그들의 뚜렷한 게놈 결함16,17에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 부적절한 세포 배양 밀도 또는 약물 농도는 또한 노화 유도성에 영향을 미칠 수 있다. 세포 밀도 및 약물 농도의 연속 희석은보다 포괄적 인 검사를 위해 신중하게 선택해야합니다. 주목할 만하게, 이 방법은 추가적인 유전독성 자극 없이 DLBCL 세포에서 자연적으로 발생하는 노인성 집단을 정확하게 검출할 수 있을 정도로 민감하였다(도 3의C12FDG+EdU-Ki67+ DMSO 처리군).
β-갈락토시다제 활성의 수준과 DNA 합성의 리듬은 세포 유형마다 상당히 다릅니다. 명시된 인큐베이션 시간(즉, EdU의 경우 3시간 및C12FDG의 경우 1h)은 일반적으로 시험관내에서 양성 및 음성 염색을 구별하기에 충분하다. 그러나, 특수한 상황(예를 들어, 느리게 성장하는 세포 또는 극도로 높은 β-갈락토시다제 활성을 갖는 세포)에서, 더 나은 차별을 위해 각각 EdU 표지를 연장하거나C12FDG 염색을 단축시킬 필요가 있을 수 있다. 실험 조건을 최적화하기 위해 연속 인큐베이션 시간을 갖는 파일럿 실험을 수행하는 것이 제안된다(예를 들어, EdU 또는 C12 FDG에 대해 각각 30분 증가 또는15분 감소). 증식하는 세포와 그들의 노화 대응물 사이의 fSA-β-gal의 차이를 더 잘 구별하기 위해, 클로로퀸 또는 바필로마이신 A1을 사용한 프리인큐베이션은 리소좀 알칼리화18,19를 유도함으로써 기저 리소좀 활성을 낮추는 것이 좋다. 상대적으로 낮은 리소좀 활성을 갖는 세포의 경우, 예비 배양 단계가 생략될 수 있다.
온전한 세포막 구조는 fSA-β-gal 검출에 필수적이다. 이 방법에서는 DNA 합성을 측정하기 위해 BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) 대신 EdU를 사용했습니다. BrdU 혼입과 비교할 때, EdU는 손상되지 않은 막 구조를 보존하고 fSA-β-gal과의 공동 염색을 허용하는 비교적 온화한 염색 조건을 필요로합니다. 주목할 만하게, 본원에 기재된 항체-매개 세포내 또는 핵 단백질 (예를 들어, γH2AX)의 검출은 또한 항체 진입을 허용하기 위해 세포막의 투과화를 필요로 한다. 여기서, 사포닌은 fSA-β-gal 신호의 담금질을 피하기 위해 강한 세제 트리톤 X-100으로 교환되었다.
화학 요법 치료는 노화뿐만 아니라 DLBCL 세포의 세포 사멸을 유발합니다. 죽은 세포는 염색 중에 위양성 또는 위음성이 발생할 수 있으므로 노화 집단을 정량화할 때 무시할 수 없는 영향을 미칠 수 있다. 대부분의 세포 파편 및 소형 죽은 세포체는 다중 세척 및 원심분리 단계 동안 배제되지만, 남아있는 죽은 세포 집단은 여전히 무시할 수없는 영향을 미칠 수 있습니다. 과감한 세포 사멸을 피하기 위해 약물 농도를 최적화하는 것이 좋습니다. 또한, 세포 생존력 염색 (예를 들어, 고스트 염료)은 죽은 세포 집단을 구별하고 노화 집단을보다 엄격하게 정량화하는 것을 용이하게하기 위해 사용될 수 있습니다.
이 방법에 사용되는 고급 이미징 유세포 분석기 시스템은 다중 채널 이미징 유세포 분석기로, 유세포 측정 기반 측정을 정량화하고 단일 세포의 다색 이미지를 병렬로 검사 할 수 있습니다. 노화 감지를위한 빠르고 효율적이며 정확한 정량 솔루션을 제공하며 그 동안 여러 마커의 공간 정보와 함께 단일 세포 해상도, 다중 색상 이미지를 생성합니다. 그러나 몇 가지 제한 사항이 유지됩니다. 예를 들어, 이미지 해상도는 하이 엔드 현미경에 비해 제한되며, 이는 핵 이외의 작은 소기관에 위치한 단백질을 추적 할 때 세포 내 국소화에 대한 포괄적 인 분석을 방해합니다. 표준 유세포 분석기의 정교한 작동 및 분석 소프트웨어와 비교할 때, 집단 게이팅 전략을 수립하거나 변경하는 것이 덜 편리하고 덜 효율적입니다. 정량화 및 통계 분석 또한 더 복잡합니다.
fSA-β-gal 염색은 신속한 염색 및 편향되지 않은 정량화를 위해 기존의 SA-β-gal에 비해 상당한 이점을 가지며 노화 세포의 효과적인 분류에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기술은 세포 분열 주기 3,18,19,20에 재진입하는 노화 세포를 스크리닝하는데 성공적으로 적용되었다. 이 방법에서, 우리는 노년기 세포를보다 정확하고 안정적으로 식별하기 위해 fSA-β-gal을 EdU 및 γH2AX와 결합하기 위해 한 걸음 더 나아갔습니다. 특히, fSA-β-gal, EdU 및 γH2AX가 이 방법에서 노화 관련 마커로 선택되었지만, 다른 신뢰할 수 있는 노화 마커는 세 개의 마커를 대체하거나 추가하도록 쉽게 적응될 수 있다. 학계에서 노화에 대한 높은 관심으로 인해, 상승된 세포질 반응성 산소 종(ROS) 생산, 분비된 SASP 인자, 하향조절된 Ki67, 핵 포위 단백질 Lamin B1의 손실, 및 증가된 헤테로크로마틴 마커 H3K9me321,22와 같은 많은 신뢰할 수 있는 노화 관련 마커가 확인되었다. 보충도 S3는 TIS KARPAS422 및 WSU-DLCL2 세포에서C12FDG+EdU-Ki67-노인성 집단의 성공적인 검출을 보여주었다.
더욱이, ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 및 uPAR과 같은 이 방법을 사용하여 시험할 수 있는 많은 노화 세포 표면 마커가 있다. 세포 표면 마커의 검출은 세포 고정 및 투과 없이 단지 짧은 항체 인큐베이션 시간을 필요로 하며, 이는 fSA-β-gal 및 EdU와 조합된 6시간 워크플로우로 염색 절차를 단축시키거나, 심지어 fSA-β-gal과 조합하여 2시간 실험으로 하여도 살아있는 세포 이미징을 허용한다는 것이다. 변형 된 방법은 잠재적으로 진단 및 예후 평가뿐만 아니라 추가 혈청 적 개입을 지원하기 위해 생체 내에서 노화 세포를 확인하기위한 클리닉에서 신속하고 신뢰할 수 있으며 실현 가능한 접근법으로 작용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Johannes Kepler University Linz (BERM16108001)의 Yong Yu에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
