Summary
Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.
Abstract
Los medicamentos quimioterapéuticos pueden inducir daños irreparables en el ADN en las células cancerosas, lo que lleva a la apoptosis o senescencia prematura. A diferencia de la muerte celular apoptótica, la senescencia es una maquinaria fundamentalmente diferente que restringe la propagación de las células cancerosas. Décadas de estudios científicos han revelado los complejos efectos patológicos de las células cancerosas senescentes en tumores y microambientes que modulan las células cancerosas y las células estromales. La nueva evidencia sugiere que la senescencia es un potente factor pronóstico durante el tratamiento del cáncer y, por lo tanto, la detección rápida y precisa de las células senescentes en muestras de cáncer es esencial. Este artículo presenta un método para visualizar y detectar la senescencia inducida por la terapia (TIS) en las células cancerosas. Las líneas celulares de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) se trataron con mafosfamida (MAF) o daunorrubicina (DN) y se examinaron para detectar el marcador de senescencia, la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal), el marcador de síntesis de ADN 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y el marcador gamma-H2AX de daño al ADN (γH2AX). Las imágenes del citómetro de flujo pueden ayudar a generar imágenes unicelulares de alta resolución en un corto período de tiempo para visualizar y cuantificar simultáneamente los tres marcadores en las células cancerosas.
Introduction
Una variedad de estímulos puede desencadenar la senescencia celular, haciendo que las células entren en un estado de detención estable del ciclo celular. Estos estímulos incluyen cambios intrínsecos de señalización o tensiones extrínsecas. Las señales intrínsecas incluyen acortamiento progresivo de los telómeros, cambios en la estructura de los telómeros, modificación epigenética, trastornos de proteostasis, disfunción mitocondrial y activación de oncogenes. Las tensiones extrínsecas incluyen señales de daño inflamatorio y/o tisular, radiación o tratamiento químico y privación nutricional 1,2,3,4. Entre los distintos tipos de senescencia, los más comúnmente vistos y bien estudiados son la senescencia replicativa, la senescencia inducida por oncogén (OIS), la senescencia inducida por radiación y la senescencia inducida por terapia (TIS). La OIS es una respuesta celular aguda al daño genotóxico causado por el estrés replicativo generado por la activación aberrante del oncogén y puede, en cierta medida, prevenir la progresión patológica de una lesión preneoplásica a un tumor en toda regla. El TIS ocurre cuando las células tumorales están estresadas por medicamentos quimioterapéuticos o radiación ionizante 5,6.
La senescencia se considera un arma de doble filo en patología debido a su naturaleza altamente dinámica. Inicialmente se describió como un mecanismo supresor de tumores beneficioso para eliminar las células dañadas del grupo circulante de células en división, salvaguardando la función normal de los órganos e inhibiendo el crecimiento tumoral 7,8,9. Sin embargo, la evidencia emergente ha sugerido un lado oscuro de la senescencia. Las células senescentes secretan citoquinas proinflamatorias, conocidas como fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), que conducen a fibrosis y órganos defectuosos y promueven el inicio y la progresión del tumor10. Además, las células cancerosas senescentes se someten a una reprogramación epigenética y de expresión génica en paralelo con la remodelación de la cromatina y la activación de una respuesta sostenida de daño al ADN (DDR)11,12, adquiriendo recientemente nuevas propiedades de células madre cancerosas3. Aunque los tumores con capacidad de senescencia responden mejor a la intervención terapéutica en comparación con los incapaces de senescencia13, la persistencia de las células senescentes puede conducir a un mal pronóstico a largo plazo si no son identificados y eliminados eficazmente por los fármacos senolíticos5. De cualquier manera, un método confiable para evaluar la senescencia es de gran interés clínico, no solo para el pronóstico del tratamiento terapéutico, sino también para el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas a las células senescentes.
Independientemente de los diferentes desencadenantes, las células senescentes exhiben algunas características comunes, incluida la morfología agrandada, aplanada y multinucleada con grandes vacuolas, núcleos significativamente expandidos, formación de heterocromatina asociada a la senescencia rica en H3K9me3 (SAHF) en el núcleo, acumulación persistente de focos del marcador de daño al ADN γH2AX,cip1 p53-p21 activado y RB-p16INK4a mecanismos reguladores del ciclo celular, detención estable del ciclo celular G1, inducción masiva de SASP y actividad elevada asociada a la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal)14. Dado que ningún marcador único es suficiente para definir la senescencia, la tinción enzimática para la actividad SA-β-gal, que se considera el estándar de oro para la detección de senescencia, generalmente se combina con la tinción inmunohistoquímica para H3K9me3 y Ki67 para detectar TIS15. Sin embargo, el SA-β-gal basado en cromosomas químicos es difícil de cuantificar. Aquí, combinamos la detección de SA-β-gal basada en fluorescencia de 5-dodecanoylaminofluoresce-di-β-D-galactopiranosido (C12FDG) basada en fluorescencia (fSA-β-gal) con tinción inmunofluorescente para γH2AX y ADN incorporado a EdU para identificar células senescentes C12FDG + EdU-γH2AX + utilizando el sistema de citómetro de flujo de imágenes avanzadas, que combina la velocidad, la sensibilidad y las imágenes detalladas de una sola célula con información espacial que no se puede proporcionar mediante citometría de flujo y microscopía. Este método permite la generación rápida de imágenes de alta resolución que permiten el posicionamiento y la cuantificación de señales fluorescentes dentro de las células, al tiempo que autoriza el análisis rápido de múltiples muestras mediante la construcción de tuberías estándar.
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Protocol
1. Líneas celulares DLBCL con tratamiento con mafosfamida o daunorrubicina para inducir senescencia celular
NOTA: El protocolo también funciona para las células cancerosas adherentes. Dependiendo del tamaño de la célula, sembra 1-2 × 105 células en un pozo de una placa de 6 pocillos e incuba la placa en una incubadora de 5% de CO2, 37 ° C durante la noche antes del tratamiento. Los pasos del protocolo son los mismos que para las celdas de suspensión, pero con dos excepciones. Primero, las células deben ser tripsinizadas de la placa después del paso 3.4. En segundo lugar, los pasos de lavado se realizan sin centrifugación antes de la tripsinización.
- Cuente las células DLBCL y la semilla 1 × 106 células / ml en 4 ml de medio por pozo en una placa de cultivo de 6 pocillos. Cultivar células DLBCL en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
- Agregue MAF (5 μg / ml) o DN (20 ng / ml) en el cultivo celular y meca suavemente la placa para mezclar.
NOTA: MAF y DN no son estables. Después de disolverse en DMSO, la solución madre debe alicitarse y almacenarse a -20 °C. Se deben evitar los ciclos de congelación/descongelación. - Incubar la placa en una incubadora de 5% de CO2, 37 °C durante 3 días.
- Después de una incubación de 3 días, recoja las células DLBCL en tubos de centrífuga estériles de 15 ml y gire a 100 × g, 4 ° C durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender los gránulos celulares con 4 ml de medio fresco y vuelva a agregar las suspensiones en la placa de 6 pocillos.
- Cultive la placa celular en una incubadora de 5% de CO2, 37 ° C durante otros 2 días antes de la cosecha para su análisis.
2. Preparar soluciones para la tinción (Tabla 1)
3. Tinción de células DLBCL con diferentes marcadores de senescencia
NOTA: Las muestras celulares teñidas con marcadores individuales (es decir, azul pacífico-EdU, C12FDG o Alexa Fluor 647-γH2AX) están preparadas para generar una matriz de compensación para corregir el derrame de fluorescencia durante la medición. Aunque muy sugerido, este paso podría suspenderse cuando hay una superposición omitible (valor del coeficiente de compensación ≤ 0,1) de los espectros de emisión entre diferentes fluoróforos. Sin embargo, los usuarios deben determinar los pasos de compensación estandarizados cuando se utilizan diferentes instrumentos y paneles fluorescentes.
- Añadir una solución de EdU de 10 mM en una proporción de 1:1.000 en el cultivo celular DLBCL generado a partir del paso 1,6 (la concentración final de EdU es de 10 μM). Mece suavemente la placa para mezclar e incubar en una incubadora de 5% de CO2, 37 °C durante 3 h.
- Saque la placa de la incubadora y agregue una solución de cloroquina de 100 mM a una concentración final de 75 μM (ver discusión). Mece suavemente la placa para mezclar e incubar en una incubadora de 5% de CO2, 37 °C durante 30 min.
- Saque la placa de la incubadora y agregue 20 mM C12solución FDG a 1: 1,000 a una concentración final de C12FDG de 20 μM. Balancee suavemente la placa para mezclar e incubar en una incubadora de 5% CO2, 37 ° C durante 1 h.
- Saque la placa de la incubadora y agregue 100 mM de solución de 2-feniletil-β-D-tiogalactósido (PETG) a 1:50 para detener la tinción de fSA-β-gal (concentración final de PETG de 2 mM). Gire suavemente la placa para mezclar.
- Transfiera las células a tubos de centrífuga estériles de 15 ml y gire a 100 × g, 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave las células con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Repita el paso de lavado de PBS. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 500 μL de solución de fijación de paraformaldehído al 4%.
- Después de 10 min de incubación a temperatura ambiente, centrífuga a 250 × g, temperatura ambiente durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave las células con 4 ml de PBS.
- Repita el paso de lavado de PBS. Deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en 200 μL de tampón de permeabilización de saponina y transfiera la suspensión a un nuevo tubo de 1,5 ml. Después de 10 min de incubación a temperatura ambiente, centrífuga a 250 × g, temperatura ambiente durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 200 μL de solución primaria de anticuerpos (anticuerpo 1:500 γH2AX en solución de incubación de anticuerpos). Incubar a 4 °C durante la noche en la oscuridad.
- Centrifugar los tubos a 250 × g, 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave con 100 μL de solución de lavado de saponina.
- Repita el paso de lavado dos veces más. Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 500 μL de cóctel de detección de EdU.
- Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. Centrífuga a 250 × g, a temperatura ambiente durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave con 1 ml de solución de lavado de saponina.
- Repita el paso de lavado dos veces. Deseche el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 20-50 μL de PBS. Continúe con la sección 4 para la medición de la muestra.
4. Obtención de imágenes de marcadores de senescencia utilizando el sistema de citómetro de flujo de imágenes
- Vacíe la botella de líquido residual. Verifique los niveles de perlas de velocidad, esterilizador, limpiador, desacreditador, vaina y reactivos de enjuague (agua desionizada) para asegurarse de que haya suficientes líquidos antes de encender el instrumento (consulte la Tabla de materiales).
- Encienda el instrumento y el software de imágenes (consulte la interfaz del software en la Figura 1A).
- Haga clic en el botón Inicio para inicializar la fluidez y la calibración del sistema.
NOTA: Este procedimiento dura aproximadamente 45 min. - Ajuste el aumento a 40x, establezca la velocidad de fluidics en baja y encienda los láseres necesarios en el experimento. Encienda los láseres de 405 nm, 488 nm y 642 nm para medir EdU-pacific blue, C12FDG y Alexa Fluor 647-γH2AX (o Alexa Fluor 647-Ki67), respectivamente. Establezca Ch6 para el canal de dispersión y Ch1 y Ch9 para el campo brillante.
- Comience con la muestra que se espera que tenga la mayor fluorescencia para configurar la intensidad de los láseres. Voltee suavemente el tubo de muestra para mezclar. Abra la tapa del tubo e inserte el tubo de muestra en la base. Haga clic en Cargar para comenzar.
- Abra un diagrama de dispersión y seleccione las funciones Area_M01 y aspect Ratio_M01 para los ejes X e Y, respectivamente. Establezca una puerta por encima de la relación de aspecto de 0,5 para excluir los dobletes y los agregados de celdas debajo y en el lado derecho, y la población de cuentas de velocidad en el lado izquierdo (Figura 1B).
- Abra una gráfica de histograma y seleccione la función Degradado RMS_M01_Ch01 para el eje X. Elija la población singlete y establezca la puerta para seleccionar las celdas enfocadas (Figura 1C).
NOTA: El sistema de imágenes utilizará automáticamente cuentas de velocidad para ajustar el enfoque de las imágenes. Sin embargo, se recomienda seleccionar la mitad derecha del pico del histograma para la población mejor enfocada. - Abra una gráfica de histograma y seleccione Intensidades máximas de píxeles sin procesar para el eje X para cada canal de color (Ch2, 7 y 11). Ajuste las potencias del láser (es decir, láseres de 488 nm, 405 nm y 642 nm para Ch2, 7 y 11, respectivamente), de modo que cada fluorocromo tenga un valor de píxel máximo raw entre 100 y 4.000 para evitar la sobresaturación.
NOTA: Para este experimento, el ajuste de potencia del láser es de 50 mW, 200 mW y 50 mW para láseres de 488 nm, 405 nm y 642 nm, respectivamente. - Elija la población enfocada para registrar y haga clic en Adquirir para medir las muestras de DLBCL con configuraciones consistentes. Al cambiar las muestras para la medición, haga clic en Retorno para recuperar el tubo de muestra. Pulse Cargar para descartar el ejemplo.
- Después de medir todas las muestras, apague el láser de campo brillante y dispersión. Mida muestras de control de un solo color para generar una matriz de compensación.
- Haga clic en Apagar para cerrar el sistema de imágenes.
- Analice los datos en el software de análisis de imágenes.
- Utilice la herramienta Spot Wizard del software de análisis de imágenes para contar y cuantificar automáticamente los focos nucleares γH2AX en imágenes de células vivas. Seleccione dos poblaciones celulares (una con alto y otra con bajo conteo de puntos) para entrenar al asistente de puntos para un análisis más automático de conteo de puntos.
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Representative Results
Se generó una matriz de compensación utilizando un software de análisis de imágenes mediante la carga de datos grabados de muestras de control de un solo color. Como se muestra en la Figura Suplementaria S1, se detectó un derrame de luz no despreciable (valor de coeficiente ≥ 0.1) de EdU a C12FDG con un valor de coeficiente de diafonía de 0.248, mientras que la diafonía entre otros canales no fue significativa. Cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL fueron tratadas con 5 μg/mL MAF o 20 ng/mL DN para inducir senescencia celular y analizadas utilizando tinción convencional SA-β-gal o el método de citometría de flujo por imágenes.
Más del 70% de las células KARPAS422, WSU-DLCL2 y OCI-LY1 entraron en estado de senescencia, indicado por SA-β-gal positivo, mientras que SU-DHL6 fue totalmente resistente a la inducción de senescencia por MAF y DN (Figura suplementaria S2A). En particular, MAF y DN también indujeron la muerte celular en todas las células DLBCL, aunque no dramáticamente (Figura suplementaria S2B). Utilizando el método de citometría de flujo por imágenes, las imágenes de una sola célula y la cuantificación basada en citometría de flujo mostraron un aumento de la población senescente C12FDG + EdU-γH2AX + en KARPAS422, WSU-DLCL2 y OCI-LY1, pero no en las células SU-DHL6 (Figura 2A-D), lo que fue consistente con los resultados convencionales de tinción SA-β-gal. Sin embargo, el porcentaje de la población senescente C12FDG+EdU-γH2AX+ fue significativamente menor que el método convencional de tinción SA-β-gal (Figura 2 y Figura suplementaria S2).
Además, el análisis de citometría de flujo por imágenes mostró una inducibilidad de senescencia diversa entre diferentes líneas celulares DLBCL, que no se distinguió claramente por la tinción convencional de SA-β-gal. El porcentaje de células C12FDG+EdU-γH2AX+ senescentes OCI-LY1 (es decir, 43,2% y 31,9% con MAF y DN, respectivamente), fue significativamente menor que el de KARPAS422 (62,2% y 73,8% con MAF y DN, respectivamente) y WSU-DLCL2 (60% y 58,1% con MAF y DN, respectivamente) (Figura 2). Es importante destacar que el análisis basado en imágenes presentó un número significativamente mayor de focos γH2AX en KARPAS422, WSU-DLCL2 y OCI-LY1, pero no en células SU-DHL6 (Figura 3A, B).
Figura 1: Interfaz de software de funcionamiento y configuración del instrumento. (A) Interfaz de software de citómetro de flujo de imágenes. El panel de imágenes de celdas activas (arriba a la izquierda) contiene imágenes de células vivas de los 12 canales de imagen y herramientas de ajuste de imagen (por ejemplo, zoom, selección de población de celdas, cambio de color, máscara y ajuste de propiedades de imagen). El área de análisis de citometría de flujo (abajo a la izquierda) contiene una barra de herramientas para el análisis de citometría de flujo, como gráfico de histograma, diagrama de dispersión, varias regiones, diseño y estadísticas de población. El panel de control (derecha) contiene menús para la adquisición y el almacenamiento de datos, la configuración de la iluminación, la ampliación, el control de velocidad de los fluidos, el enfoque y el centrado. B) Selección de la población unicelular. (C) Selección de la población celular focalizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visualización y cuantificación de células senescentes a nivel de una sola célula. Imágenes representativas (panel izquierdo) y análisis de citometría de flujo de células senescentes C12FDG+EdU-γH2AX+ (panel derecho) de (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1 y (D) células SU-DHL6 tratadas con 5 μg/mL MAF o 20 ng/mL DN durante 5 días y teñidas para fSA-β-gal, EdU y γH2AX. Las células tratadas con DMSO se utilizaron como control. Abreviaturas: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-etinil-2′-desoxiuridina; γH2AX = forma fosforilada de la histona H2AX; DMSO = dimetilsulfóxido; MAF = mafosfamida; DN = daunorrubicina; fSA-β-gal = β-galactosidasa asociada a la senescencia basada en fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación basada en imágenes de focos nucleares γH2AX en células senescentes. (A) Imágenes representativas de focos γH2AX en células DLBCL (ver texto de la Figura 2 para detalles de tratamiento y tinción). (B) Frecuencia (izquierda) y cuantificación (derecha) de los recuentos de focos γH2AX en células DLBCL. Abreviaturas: γH2AX = forma fosforilada de la histona H2AX; DMSO = dimetilsulfóxido; MAF = mafosfamida; DN = daunorrubicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Comentarios | |
| Solución EdU de 10 mM en DMSO | Conservar a -20 °C. | |
| Solución FDG C12 de 20mM en DMSO | Conservar a -20 °C. | |
| Solución de cloroquina de 100 mM en agua desionizada | Conservar a -20 °C. | |
| Solución de PETG de 100 mM en agua desionizada | Conservar a -20 °C. | |
| Solución de fijación: 4% PFA (paraformaldehído) en PBS | recién preparado; PRECAUCIÓN: El PFA es dañino. Usar con las precauciones adecuadas. | |
| Tampón de permeabilización: 1% de saponina (p/v), 3% de BSA (p/v) en PBS, recién preparado. | recién preparado | |
| Solución de incubación de anticuerpos: saponina al 0,1% (p/v), BSA al 3% (p/v) en PBS | recién preparado | |
| Solución de lavado: saponina al 0,1% (p/v), BSA al 0,5% (p/v) en PBS | recién preparado | |
| Cóctel de detección de EdU: Diluir CuSO4 (100 mM) a 1:50, solución de azida azul pacífico a 1:200 y aditivo tampón de reacción (200 mg/mL) a 1:100 en PBS | recién preparado | |
Tabla 1: Soluciones para la tinción.
Figura suplementaria S1: Matriz de compensación de EdU-pacific blue, C12FDG-Fluorescein y AF647-γH2AX. Abreviaturas: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-etinil-2′-desoxiuridina; γH2AX = forma fosforilada de la histona H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Senescencia inducida por terapia de líneas celulares DLBCL. (A) Tinción convencional de SA-β-gal (panel izquierdo) y cuantificación (panel derecho) de líneas celulares DLBCL indicadas tratadas con 5 μg/mL MAF o 20 ng/mL DN. Barras de escala = 50 μm. (B) Porcentaje de muerte celular analizada por citometría de flujo (panel izquierdo) y cuantificación (panel derecho) de líneas celulares DLBCL como en A. Las celdas se tiñeron con azul pacífico de tinte fantasma a temperatura ambiente durante 15 minutos. Abreviaturas: DMSO = dimetilsulfóxido; MAF = mafosfamida; DN = daunorrubicina; SA-β-gal = β-galactosidasa asociada a la senescencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Imágenes representativas y análisis de citometría de flujo. (A) Imágenes representativas y análisis de citometría de flujo de células senescentes C12FDG+EdU-Ki67+ (B) de células KARPAS422 y WSU-DLCL2 tratadas con MAF durante 5 días y teñidas con fSA-β-gal, EdU y Ki67. Las células tratadas con DMSO se utilizaron como control. Abreviaturas: C12FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-Dgalactopyranoside; EdU = 5-etinil-2′-desoxiuridina; DMSO = dimetilsulfóxido; MAF = mafosfamida; DN = daunorrubicina; fSA-β-gal = β-galactosidasa asociada a la senescencia basada en fluorescencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este método examinó la capacidad de entrada de senescencia de cuatro líneas celulares diferentes de DLBCL durante el tratamiento de quimioterapia, con imágenes de campo brillante y cuantificación basada en citometría de flujo. A nivel unicelular, detectamos con éxito poblaciones senescentes C12FDG+EdU-Ki67+ principales en células KARPAS422 y WSU-DLCL2 tratadas, y en menor medida en células OCI-LY1, mientras que la línea celular SU-DHL6 fue resistente al tratamiento. La diferencia en la capacidad de entrada de senescencia entre las líneas celulares puede explicarse por sus distintos defectos genómicos16,17. Sin embargo, la densidad de cultivo celular inadecuada o la concentración de fármacos también pueden influir en la inducibilidad de la senescencia. Las diluciones seriadas de la densidad celular y la concentración del fármaco deben seleccionarse cuidadosamente para un examen más completo. En particular, este método fue lo suficientemente sensible como para detectar con precisión la población senescente natural en las células DLBCL sin estimulación genotóxica adicional (C12FDG + EdU-Ki67 + grupo tratado con DMSO en la Figura 3).
El nivel de actividad de la β-galactosidasa y el ritmo de la síntesis de ADN varían significativamente entre los diferentes tipos de células. El tiempo de incubación indicado (es decir, 3 h para EdU y 1 h para C12FDG) es generalmente suficiente para discriminar la tinción positiva y negativa in vitro. Sin embargo, en circunstancias especiales (por ejemplo, células de crecimiento lento o células con una actividad extremadamente alta de β-galactosidasa), podría ser necesario prolongar el etiquetado de EdU o acortar la tinción de FDG C12para una mejor discriminación, respectivamente. Se sugiere realizar un experimento piloto con un tiempo de incubación en serie para optimizar las condiciones experimentales (por ejemplo, aumento de 30 minutos o disminución de 15 minutos para EdU o C12FDG, respectivamente). Para distinguir mejor las diferencias en fSA-β-gal entre las células proliferantes y sus contrapartes senescentes, se recomienda la preincubación con cloroquina o bafilomicina A1 para disminuir la actividad lisosomal basal mediante la inducción de la alcalinización lisosomal18,19. Para las células con una actividad lisosomal relativamente baja, se puede omitir el paso previo a la ejecución.
La estructura intacta de la membrana celular es esencial para la detección de fSA-β-gal. En este método, utilizamos EdU en lugar de BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina) para medir la síntesis de ADN. En comparación con la incorporación de BrdU, EdU necesita una condición de tinción relativamente leve, que preserva la estructura intacta de la membrana y permite la tinción conjunta con fSA-β-gal. En particular, la detección mediada por anticuerpos de proteínas intracelulares o nucleares (por ejemplo, γH2AX) descritas aquí también necesita permeabilización de la membrana celular para permitir la entrada de anticuerpos. Aquí, la saponina se cambió por el fuerte detergente Triton X-100 para evitar el enfriamiento de la señal fSA-β-gal.
El tratamiento quimioterapéutico no solo desencadena la senescencia, sino también la muerte celular en las células DLBCL. Las células muertas pueden tener un impacto no despreciable al cuantificar la población de senescencia, ya que pueden dar lugar a falsos positivos o falsos negativos durante la tinción. Aunque la mayoría de los restos celulares y los cuerpos de células muertas de pequeño tamaño se excluirán durante múltiples pasos de lavado y centrifugación, la población de células muertas restante aún puede tener una influencia no despreciable. Se sugiere optimizar la concentración del fármaco para evitar la muerte celular drástica. Además, la tinción de viabilidad celular (por ejemplo, tinte fantasma) se puede emplear para facilitar la discriminación de la población de células muertas y la cuantificación de la población de senescencia de manera más estricta.
El sistema avanzado de citometría de flujo de imágenes utilizado en este método es un citómetro de flujo de imágenes multicanal, que permite cuantificar las mediciones basadas en citometría de flujo e inspeccionar imágenes multicolor de células individuales en paralelo. Proporciona una solución cuantitativa rápida, eficiente y precisa para la detección de senescencia y, mientras tanto, genera imágenes multicolor de resolución de una sola celda con información espacial de múltiples marcadores. Sin embargo, persisten algunas limitaciones. Por ejemplo, la resolución de la imagen es limitada en comparación con el microscopio de gama alta, lo que impide un análisis exhaustivo de la localización subcelular al rastrear proteínas ubicadas en orgánulos más pequeños que no sean el núcleo. En comparación con el sofisticado software de operación y análisis de un citómetro de flujo estándar, es menos conveniente y menos eficiente configurar o cambiar las estrategias de cierre de la población. La cuantificación y el análisis estadístico también son más complicados.
La tinción fSA-β-gal tiene ventajas significativas sobre la SA-β-gal convencional para la tinción rápida y la cuantificación imparcial y tiene el potencial para la clasificación efectiva de las células senescentes. Esta técnica se ha aplicado con éxito para detectar células senescentes que vuelven a entrar en el ciclo de división celular 3,18,19,20. En este método, dimos un paso más allá para combinar fSA-β-gal con EdU y γH2AX para identificar células senescentes con mayor precisión y fiabilidad. En particular, aunque fSA-β-gal, EdU y γH2AX se eligieron como marcadores asociados a la senescencia en este método, otros marcadores de senescencia confiables se pueden adaptar fácilmente para sustituir o agregar a los tres marcadores. Debido al alto interés en la senescencia en la academia, se han identificado muchos marcadores confiables asociados a la senescencia, como la producción elevada de especies reactivas de oxígeno (ROS) citoplasmáticas, los factores SASP secretados, el Ki67 regulado a la baja, la pérdida de la proteína envolvente nuclear Lamin B1 y el aumento del marcador de heterocromatina H3K9me321,22. La Figura Suplementaria S3 mostró la detección exitosa de C12FDG+ EdU-Ki67- poblaciones senescentes en células TIS KARPAS422 y WSU-DLCL2.
Además, hay muchos marcadores de superficie de células de senescencia disponibles para ser probados utilizando este método, como ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 y uPAR. La detección de marcadores de superficie celular solo requiere un corto tiempo de incubación de anticuerpos sin fijación celular y permeabilización, lo que acortará el procedimiento de tinción en un flujo de trabajo de 6 h en combinación con fSA-β-gal y EdU, o incluso en un experimento de 2 h en combinación con fSA-β-gal solamente, y lo que es más importante, permite imágenes de células vivas. El método modificado podría servir potencialmente como un enfoque rápido, confiable y factible en la clínica para identificar células de senescencia in vivo, no solo para la evaluación diagnóstica y pronóstica, sino también para apoyar una intervención senolítica adicional.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención a Yong Yu de la Universidad Johannes Kepler de Linz (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
