Summary
Här presenterar vi en flödescytometribaserad metod för visualisering och kvantifiering av flera åldrandeassocierade markörer i enstaka celler.
Abstract
Kemoterapeutiska läkemedel kan inducera irreparabel DNA-skada i cancerceller, vilket leder till apoptos eller för tidig åldrande. Till skillnad från apoptotisk celldöd är åldrande ett fundamentalt annorlunda maskineri som hindrar förökning av cancerceller. Årtionden av vetenskapliga studier har avslöjat de komplexa patologiska effekterna av åldrande cancerceller i tumörer och mikromiljöer som modulerar cancerceller och stromaceller. Nya bevis tyder på att åldrande är en potent prognostisk faktor under cancerbehandling, och därför är snabb och exakt upptäckt av åldrande celler i cancerprover avgörande. Denna artikel presenterar en metod för att visualisera och detektera terapiinducerad åldrande (TIS) i cancerceller. Diffusa cellinjer med stort B-celllymfom (DLBCL) behandlades med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) och undersöktes med avseende på åldrandemarkören, åldrandeassocierad β-galaktosidas (SA-β-gal), DNA-syntesmarkören 5-etynyl-2′-deoxyuridin (EdU) och DNA-skademarkören gamma-H2AX (γH2AX). Flödescytometeravbildning kan hjälpa till att generera högupplösta encellsbilder på kort tid för att samtidigt visualisera och kvantifiera de tre markörerna i cancerceller.
Introduction
En mängd olika stimuli kan utlösa cellulär åldrande, vilket får celler att gå in i ett tillstånd av stabil cellcykelstopp. Dessa stimuli inkluderar inneboende signalförändringar eller yttre påfrestningar. Inneboende signaler inkluderar progressiv telomerförkortning, förändringar i telomerstruktur, epigenetisk modifiering, proteostasstörningar, mitokondriell dysfunktion och aktivering av onkogener. Yttre påfrestningar inkluderar inflammatoriska och / eller vävnadsskadesignaler, strålning eller kemisk behandling och näringsbrist 1,2,3,4. Bland olika typer av åldrande är de vanligaste och välstuderade replikativ åldrande, onkogeninducerad åldrande (OIS), strålningsinducerad åldrande och terapiinducerad åldrande (TIS). OIS är ett akut cellulärt svar på genotoxisk skada orsakad av replikativ stress genererad av avvikande onkogenaktivering och kan till viss del förhindra den patologiska utvecklingen från en preneoplastisk lesion till en fullblåst tumör. TIS händer när tumörceller stressas av kemoterapeutiska läkemedel eller joniserande strålning 5,6.
Senescence anses vara ett tveeggat svärd i patologi på grund av dess mycket dynamiska natur. Det beskrevs ursprungligen som en fördelaktig tumörundertryckande mekanism för att ta bort skadade celler från den cirkulerande poolen av delande celler, skydda organens normala funktion och hämma tumörtillväxt 7,8,9. Nya bevis har dock föreslagit en mörk sida av åldrande. Senescenta celler utsöndrar proinflammatoriska cytokiner, känd som åldrande-associerad sekretorisk fenotyp (SASP), vilket leder till fibros och felaktiga organ och främjar tumörinitiering och progression10. Dessutom genomgår senescenta cancerceller epigenetisk och genuttrycksomprogrammering parallellt med kromatinombyggnad och aktivering av ett ihållande DNA-skadesvar (DDR)11,12, vilket nyligen förvärvar nya cancer-stamcellsegenskaper3. Även om åldrande-kapabla tumörer svarar bättre på terapeutisk ingrepp jämfört med åldrande-oförmögna13, kan persistensen hos åldrande celler leda till en dålig långsiktig prognos om de inte effektivt identifieras och elimineras av senolytiska läkemedel5. Hur som helst är en tillförlitlig metod för att bedöma åldrande av betydande kliniskt intresse, inte bara för prognosen för terapibehandling utan också för utvecklingen av nya strategier riktade mot åldrande celler.
Oavsett olika utlösare uppvisar åldrande celler några gemensamma egenskaper, inklusive förstorad, tillplattad, flerkärnig morfologi med stora vakuoler, signifikant expanderade kärnor, bildning av H3K9me3-rik åldrandeassocierad heterokromatin (SAHF) i kärnan, ihållande ackumulering av DNA-skademarkör γH2AX-foci, aktiverad p53-p21CIP1 och Rb-p16INK4a cellcykelregleringsmekanismer, stabil G1-cellcykelstopp, massiv induktion av SASP och förhöjd åldrande-associerad β-galaktosidas (SA-β-gal) aktivitet14. Eftersom ingen enskild markör är tillräcklig för att definiera åldrande kombineras enzymatisk färgning för SA-β-gal-aktivitet, som anses vara guldstandarden för åldrandedetektering, vanligtvis med immunohistokemisk färgning för H3K9me3 och Ki67 för att detektera TIS15. Kemisk kromogenbaserad SA-β-gal är dock svår att kvantifiera. Här kombinerade vi 5-dodekanoylaminofluorescein-di-β-D-galaktopyranosid (C12FDG) fluorescensbaserad SA-β-gal (fSA-β-gal) detektion med immunofluorescerande färgning för γH2AX och EdU-inkorporerat DNA för att identifiera C12FDG + EdU-γH2AX + åldrande celler med hjälp av det avancerade bildflödescytometersystemet, som kombinerar hastighet, känslighet och detaljerade encellsbilder med rumslig information som inte kan tillhandahållas med flödescytometri och mikroskopi. Denna metod möjliggör snabb generering av högupplösta bilder som möjliggör positionering och kvantifiering av fluorescerande signaler i celler, samtidigt som den möjliggör snabb analys av flera prover genom att bygga standardledningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DLBCL-cellinjer med mafosfamid- eller daunorubicinbehandling för att inducera cellulär åldrande
OBS: Protokollet fungerar också för vidhäftande cancerceller. Beroende på cellstorlek ×1-2 celler i en brunn på en 6-brunnsplatta och inkubera plattan i en 5% CO2, 37 ° C inkubator över natten före behandling. Protokollstegen är desamma som för suspensionsceller men med två undantag. Först måste celler trypsiniseras från plattan efter steg 3.4. För det andra utförs tvättsteg utan centrifugering före trypsinisering.
- Räkna DLBCL-celler och frö 1 × 106 celler / ml i 4 ml medium per brunn i en 6-brunns odlingsplatta. Odla DLBCL-celler i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100 U / ml penicillin / streptomycin.
- Tillsätt MAF (5 μg / ml) eller DN (20 ng / ml) i cellkulturen och gunga försiktigt plattan för att blanda.
OBS: MAF och DN är inte stabila. Efter upplösning i DMSO ska stamlösningen alikvoteras och förvaras vid -20 °C. Frysnings-/upptiningscykler bör undvikas. - Inkubera plattan i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i 3 dagar.
- Efter en 3 dagars inkubation, samla DLBCL-cellerna i 15 ml sterila centrifugrör och snurra vid 100 × g, 4 °C i 5 minuter.
- Kassera supernatanten, återsuspendera cellpelletsen med 4 ml färskt medium och tillsätt suspensionerna tillbaka i 6-brunnsplattan.
- Odla cellplattan i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i ytterligare två dagar före skörd för analys.
2. Förbered lösningar för färgning (tabell 1)
3. Fläck DLBCL-celler med olika åldrande markörer
OBS: Cellprover färgade med individuella markörer (dvs pacific blue-EdU, C12FDG eller Alexa Fluor 647-γH2AX) är beredda att generera en kompensationsmatris för att korrigera fluorescensspillover under mätningen. Även om det rekommenderas starkt kan detta steg avbrytas när det finns en utelämnad överlappning (kompensationskoefficientvärde ≤ 0,1) av emissionsspektra mellan olika fluoroforer. Användare måste dock bestämma standardiserade kompensationssteg när de använder olika instrument och fluorescerande paneler.
- Tillsätt 10 mM EdU-lösning i förhållandet 1:1 000 i DLBCL-cellodlingen som genereras från steg 1,6 (slutlig EdU-koncentration är 10 μM). Gunga försiktigt plattan för att blanda och inkubera i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i 3 timmar.
- Ta ut plattan ur inkubatorn och tillsätt 100 mM klorokinlösning till en slutlig koncentration på 75 μM (se diskussion). Gunga försiktigt plattan för att blanda och inkubera i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i 30 minuter.
- Ta ut plattan ur inkubatorn och tillsätt 20 mM C12FDG-lösning vid 1: 1 000 till en slutlig C12FDG-koncentration på 20 μM. Gunga försiktigt plattan för att blanda och inkubera i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i 1 timme.
- Ta ut plattan ur inkubatorn och tillsätt 100 mM 2-fenyletyl-β-D-tiogolaktosidlösning (PETG) vid 1:50 för att stoppa fSA-β-gal-färgningen (slutlig PETG-koncentration på 2 mM). Vrid försiktigt plattan för att blanda.
- Överför cellerna till 15 ml sterila centrifugrör och snurra vid 100 × g, 4 °C i 5 minuter. Kassera supernatanten och tvätta cellerna med 4 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Upprepa PBS-tvättsteget. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i 500 μL 4% paraformaldehydfixeringslösning.
- Efter 10 min inkubation vid rumstemperatur, centrifugera vid 250 × g, rumstemperatur i 5 min. Kassera supernatanten och tvätta cellerna med 4 ml PBS.
- Upprepa PBS-tvättsteget. Kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 200 μL saponinpermeabiliseringsbuffert och överför suspensionen till ett nytt 1,5 ml rör. Efter 10 min inkubation vid rumstemperatur, centrifugera vid 250 × g, rumstemperatur i 5 min.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i 200 μL primär antikroppslösning (1:500 γH2AX-antikropp i antikroppsinkubationslösning). Inkubera vid 4 °C över natten i mörker.
- Centrifugera rören vid 250 × g, 4 °C i 5 min. Kassera supernatanten och tvätta med 100 μL saponintvättlösning.
- Upprepa tvättsteget ytterligare två gånger. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i 500 μL EdU-detektionscocktail.
- Inkubera i rumstemperatur i 30 min i mörkret. Centrifugera vid 250 × g, rumstemperatur i 5 min. Kassera supernatanten och tvätta med 1 ml saponintvättlösning.
- Upprepa tvättsteget två gånger. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i 20-50 μl PBS. Fortsätt till avsnitt 4 för provmätning.
4. Avbildning av åldrande markörer med hjälp av bildflödescytometersystemet
- Töm avfallsvätskeflaskan. Kontrollera nivåerna av hastighetspärlor, sterilisator, rengöringsmedel, debubbler, mantel och sköljreagens (avjoniserat vatten) för att säkerställa tillräckliga vätskor innan du slår på instrumentet (se materialtabellen).
- Slå på instrumentet och bildbehandlingsprogrammet (se programvarugränssnittet i figur 1A).
- Klicka på startknappen för att initiera fluidik och systemkalibrering.
OBS: Denna procedur tar cirka 45 minuter. - Ställ in förstoringen på 40x, ställ in fluidikhastigheten på låg och slå på de lasrar som behövs i experimentet. Slå på 405 nm, 488 nm och 642 nm lasrar för att mäta EdU-pacific blue, C12FDG respektive Alexa Fluor 647-γH2AX ( eller Alexa Fluor 647-Ki67). Ange Ch6 för spridningskanal och Ch1 och Ch9 för brightfield.
- Börja med provet som förväntas ha den högsta fluorescensen för att ställa in laserns intensitet. Vänd försiktigt provröret för att blanda. Öppna rörlocket och sätt in provröret på dockan. Klicka på Ladda för att starta.
- Öppna ett spridningsdiagram och välj de funktioner Area_M01 och Ratio_M01 för X- respektive Y-axlarna. Ställ in en grind över bildförhållandet på 0,5 för att utesluta dubbletter och cellaggregat under och på höger sida och hastighetspärlepopulationen på vänster sida (figur 1B).
- Öppna ett histogramdiagram och välj funktionen Gradient RMS_M01_Ch01 för X-axeln. Välj singletpopulationen och ställ in grinden för att välja för fokuserade celler (figur 1C).
OBS: Bildsystemet använder automatiskt hastighetspärlor för att justera fokus för avbildning. Det rekommenderas dock att välja den högra halvan av histogramtoppen för den bäst fokuserade befolkningen. - Öppna ett histogramdiagram och välj Raw Max Pixel-intensiteter för X-axeln för varje färgkanal (Ch2, 7 och 11). Justera laserkrafterna (dvs. 488 nm, 405 nm och 642 nm lasrar för Ch2, 7 respektive 11), så att varje fluorokrom har ett Raw Max Pixel-värde mellan 100 och 4 000 för att undvika övermättnad.
OBS: För detta experiment är lasereffektinställningen 50 mW, 200 mW och 50 mW för lasrar 488 nm, 405 nm respektive 642 nm. - Välj den fokuserade populationen som ska registreras och klicka på Hämta för att mäta DLBCL-proverna med konsekventa inställningar. När du byter prover för mätning, klicka på Retur för att återställa provröret. Tryck på Läs in för att ta bort exemplet.
- När alla prover har mätts, stäng av ljusfältet och sprida lasern. Mät enfärgade kontrollprover för att generera en kompensationsmatris.
- Klicka på Stäng av för att stänga bildsystemet.
- Analysera data i bildanalysprogramvaran.
- Använd Spot Wizard-verktyget i bildanalysprogramvaran för att automatiskt räkna och kvantifiera nukleära γH2AX-foci i levande cellbilder. Välj två cellpopulationer (en med högt och ett med lågt punktantal) för att träna spotguiden för ytterligare automatisk dekorräkningsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En kompensationsmatris genererades med hjälp av bildanalysprogramvara genom att ladda inspelade data från enfärgade kontrollprover. Som visas i kompletterande figur S1 detekterades en icke försumbar (koefficientvärde ≥ 0,1) ljusspridning från EdU till C12FDG med överhörningskoefficientvärde 0,248, medan överhörningen bland andra kanaler inte var signifikant. Fyra olika DLBCL-cellinjer behandlades med 5 μg /ml MAF eller 20 ng / ml DN för att inducera cellulär åldrande och analyserades med antingen konventionell SA-β-gal-färgning eller avbildningsflödescytometrimetoden.
Mer än 70% av KARPAS422-, WSU-DLCL2- och OCI-LY1-cellerna gick in i åldrandestatus, indikerat av positiv SA-β-gal, medan SU-DHL6 var helt resistent mot åldrandeinduktion av MAF och DN (Kompletterande figur S2A). I synnerhet inducerade MAF och DN också celldöd i alla DLBCL-celler, men inte dramatiskt (Kompletterande figur S2B). Med hjälp av avbildningsflödescytometrimetoden visade encellsbilder och flödescytometribaserad kvantifiering en ökad C12FDG + EdU-γH2AX + senescent population i KARPAS422, WSU-DLCL2 och OCI-LY1 men inte i SU-DHL6-celler (figur 2A-D), vilket överensstämde med de konventionella SA-β-gal-färgningsresultaten. Procentandelen av C12FDG+EdU-γH2AX+senescentpopulationen var dock signifikant lägre än den konventionella SA-β-gal-färgningsmetoden (figur 2 och kompletterande figur S2).
Dessutom visade bildflödescytometrianalys olika åldrandeducerbarhet bland olika DLBCL-cellinjer, vilket inte tydligt utmärkte sig av konventionell SA-β-gal-färgning. Procentandelen C12FDG + EdU-γH2AX + senescenta OCI-LY1-celler (dvs. 43,2% respektive 31,9% med MAF respektive DN) var signifikant lägre än för KARPAS422 (62,2% respektive 73,8% med MAF respektive DN) och WSU-DLCL2 (60% och 58,1% med MAF respektive DN) (Figur 2). Viktigt är att bildbaserad analys presenterade signifikant högre antal γH2AX-foci i KARPAS422, WSU-DLCL2 och OCI-LY1 men inte i SU-DHL6-celler (figur 3A,B).
Bild 1: Gränssnitt för operativsystem och instrumentinställning. Bildpanelen för levande celler (uppe till vänster) innehåller live-cellbilder av alla 12 bildkanaler och bildjusteringsverktyg (t.ex. zoom, cellpopulationsval, färgändring, mask och justering av bildegenskaper). Analysområdet för flödescytometri (längst ned till vänster) innehåller ett verktygsfält för flödescytometrianalys, såsom histogramdiagram, spridningsdiagram, olika regiongatning, layout och befolkningsstatistik. Kontrollpanelen (till höger) innehåller menyer för datainsamling och sparande, belysningsinställning, förstoring, fluidikhastighetskontroll, fokusering och centrering. (B) Urval av encellspopulation. (C) Urval av fokuserad cellpopulation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Visualisering och kvantifiering av åldrande celler på encellsnivå. Representativa bilder (vänster panel) och flödescytometrianalys av C12FDG + EdU-γH2AX + senescent celler (höger panel) av (A) KARPAS422, (B) WSU-DLCL2, (C) OCI-LY1 och (D) SU-DHL6-celler behandlade med 5 μg / ml MAF eller 20 ng / ml DN i 5 dagar och färgade för fSA-β-gal, EdU och γH2AX. DMSO-behandlade celler användes som kontroll. Förkortningar: C12FDG = 5-dodekanoylaminofluorescein-di-β-Dgalaktopyranosid; EdU = 5-etynyl-2′-deoxyuridin; γH2AX = fosforylerad form av histon H2AX; DMSO = dimetylsulfoxid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; fSA-β-gal = fluorescensbaserad åldrandeassocierad β-galaktosidas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Avbildningsbaserad kvantifiering av nukleära γH2AX-foci i åldrande celler. (B) Frekvens (vänster) och kvantifiering (höger) av γH2AX-foci räknas i DLBCL-celler. Förkortningar: γH2AX = fosforylerad form av histon H2AX; DMSO = dimetylsulfoxid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Kommentarer | |
| 10 mM EdU-lösning i DMSO | Förvaras vid -20 °C. | |
| 20 mM C12FDG-lösning i DMSO | Förvaras vid -20 °C. | |
| 100 mM klorokinlösning i avjoniserat vatten | Förvaras vid -20 °C. | |
| 100 mM PETG-lösning i avjoniserat vatten | Förvaras vid -20 °C. | |
| Fixeringslösning: 4% PFA (paraformaldehyd) i PBS | nyberedd; VARNING: PFA är skadligt. Använd med lämpliga försiktighetsåtgärder. | |
| Permeabiliseringsbuffert: 1% saponin (w / v), 3% BSA (w / v) i PBS, nyberedd. | nyberedd | |
| Antikroppsinkuationslösning: 0,1% saponin (w / v), 3% BSA (w / v) i PBS | nyberedd | |
| Tvättlösning: 0,1% saponin (w /v), 0,5% BSA (w / v) i PBS | nyberedd | |
| EdU-detektionscocktail: Utspädd CuSO4 (100 mM) vid 1:50, stillahavsblå azidlösning vid 1:200 och reaktionsbufferttillsats (200 mg / ml) vid 1:100 i PBS | nyberedd | |
Tabell 1: Lösningar för färgning.
Kompletterande figur S1: Kompensationsmatris för EdU-pacific blue, C12FDG-Fluorescein och AF647-γH2AX. Förkortningar: C12FDG = 5-dodekanoylaminofluorescein-di-β-Dgalaktopyranosid; EdU = 5-etynyl-2′-deoxyuridin; γH2AX = fosforylerad form av histon H2AX; AF647 = Alexa Fluor 647. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Terapiinducerad åldrande av DLBCL-cellinjer. (A) Konventionell SA-β-gal-färgning (vänster panel) och kvantifiering (höger panel) av indikerade DLBCL-cellinjer behandlade med 5 μg / ml MAF eller 20 ng / ml DN. Skalstänger = 50 μm. (B) Procentandel av celldöd analyserad med flödescytometri (vänster panel) och kvantifiering (höger panel) av DLBCL-cellinjer som i A. Cellerna färgades med spökfärg-stillahavsblått vid rumstemperatur i 15 min. Förkortningar: DMSO = dimetylsulfoxid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; SA-β-gal = åldrande associerad β-galaktosidas. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Representativa bilder och flödescytometrianalys. (A) Representativa bilder och flödescytometrianalys av C12FDG + EdU-Ki67 + senescenta celler (B) av KARPAS422 och WSU-DLCL2-celler behandlade med MAF i 5 dagar och färgade för fSA-β-gal, EdU och Ki67. DMSO-behandlade celler användes som kontroll. Förkortningar: C12FDG = 5-dodekanoylaminofluorescein-di-β-Dgalaktopyranosid; EdU = 5-etynyl-2′-deoxyuridin; DMSO = dimetylsulfoxid; MAF = mafosfamid; DN = daunorubicin; fSA-β-gal = fluorescensbaserad åldrandeassocierad β-galaktosidas. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod undersökte åldrandets inträdande förmåga hos fyra olika DLBCL-cellinjer vid kemoterapibehandling, med ljusfältsavbildning och flödescytometribaserad kvantifiering. På encellsnivå upptäckte vi framgångsrikt stora C12FDG + EdU-Ki67 + senescentpopulationer i behandlade KARPAS422- och WSU-DLCL2-celler, och i mindre utsträckning i OCI-LY1-celler, medan SU-DHL6-cellinjen var resistent mot behandlingen. Skillnaden i åldrande-ingångsförmåga mellan cellinjer kan förklaras av deras distinkta genomiska defekter16,17. Emellertid, olämplig cellodling densitet eller läkemedelskoncentration kan också påverka åldrande inducerbarhet. Seriella utspädningar av celltäthet och läkemedelskoncentration bör väljas noggrant för en mer omfattande undersökning. I synnerhet var denna metod tillräckligt känslig för att exakt detektera den naturligt förekommande åldrande populationen i DLBCL-celler utan ytterligare genotoxisk stimulering (C12FDG + EdU-Ki67 + DMSO-behandlad grupp i figur 3).
Nivån av β-galaktosidasaktivitet och rytmen i DNA-syntesen varierar avsevärt mellan olika celltyper. Den angivna inkubationstiden (dvs. 3 timmar för EdU och 1 h för C12FDG) är i allmänhet tillräcklig för att skilja positiv och negativ färgning in vitro. Under speciella omständigheter (t.ex. långsamt växande celler eller celler med extremt hög β-galaktosidasaktivitet) kan det dock vara nödvändigt att förlänga EdU-märkningen eller förkorta C12FDG-färgningen för bättre diskriminering. Det föreslås att man utför ett pilotexperiment med en seriell inkubationstid för att optimera experimentella förhållanden (t.ex. 30 min ökning eller 15 min minskning för EdU respektive C12FDG). För att bättre skilja skillnaderna i fSA-β-gal mellan prolifererande celler och deras åldrande motsvarigheter rekommenderas preinkubering med klorokin eller bafilomycin A1 för att sänka den basala lysosomala aktiviteten genom att inducera lysosomal alkalisering18,19. För celler med relativt låg lysosomal aktivitet kan preincubationssteget utelämnas.
Intakt cellmembranstruktur är avgörande för fSA-β-gal-detektering. I denna metod använde vi EdU istället för BrdU (5-bromo-2'-deoxiuridin) för att mäta DNA-syntes. Jämfört med BrdU-inkorporering behöver EdU ett relativt milt färgningstillstånd, vilket bevarar den intakta membranstrukturen och möjliggör samfärgning med fSA-β-gal. I synnerhet behöver antikroppsmedierad detektion av intracellulära eller kärnproteiner (t.ex. γH2AX) som beskrivs här också permeabilisering av cellmembranet för att möjliggöra antikroppsinträde. Här byttes saponin ut mot det starka tvättmedlet Triton X-100 för att undvika släckning av fSA-β-gal-signal.
Kemoterapeutisk behandling utlöser inte bara åldrande utan också celldöd i DLBCL-celler. Döda celler kan ha en icke försumbar inverkan vid kvantifiering av åldrandepopulationen eftersom de kan resultera i falska positiva eller falska negativa under färgning. Även om de flesta cellrester och små döda cellkroppar kommer att uteslutas under flera tvätt- och centrifugeringssteg, kan den återstående döda cellpopulationen fortfarande ha ett icke försumbart inflytande. Det föreslås att optimera läkemedelskoncentrationen för att undvika drastisk celldöd. Dessutom kan cellviabilitetsfärgning (t.ex. spökfärgämne) användas för att underlätta diskriminerande dödcellspopulation och kvantifiera åldrandepopulationen strängare.
Det avancerade bildflödescytometrisystemet som används i denna metod är en flerkanalig bildflödescytometer, som möjliggör kvantifiering av flödescytometribaserade mätningar och inspektion av flerfärgade bilder av enstaka celler parallellt. Det ger en snabb, effektiv och exakt kvantitativ lösning för åldrandedetektering, och under tiden genererar encellsupplösning, flerfärgade bilder med rumslig information om flera markörer. Vissa begränsningar kvarstår dock. Till exempel är bildupplösningen begränsad jämfört med det avancerade mikroskopet, vilket hindrar en omfattande analys av subcellulär lokalisering när man spårar proteiner som finns i andra mindre organeller än kärnan. Jämfört med sofistikerad drift och analysprogramvara för en standardflödescytometer är det mindre bekvämt och mindre effektivt att ställa in eller ändra befolkningsstrategier. Kvantifiering och statistisk analys är också mer komplicerade.
fSA-β-gal färgning har betydande fördelar jämfört med konventionell SA-β-gal för snabb färgning och opartisk kvantifiering och har potential för effektiv klassificering av åldrande celler. Denna teknik har framgångsrikt tillämpats för att screena för åldrande celler som åter kommer in i celldelningscykeln 3,18,19,20. I den här metoden tog vi ett steg längre för att kombinera fSA-β-gal med EdU och γH2AX för att identifiera åldrande celler mer exakt och tillförlitligt. Även om fSA-β-gal, EdU och γH2AX valdes som åldrande associerade markörer i denna metod, kan andra tillförlitliga åldrandemarkörer enkelt anpassas för att ersätta eller lägga till de tre markörerna. På grund av det stora intresset för åldrande inom akademin har många tillförlitliga åldrandeassocierade markörer identifierats, såsom förhöjd cytoplasmatisk reaktiv syreart (ROS), utsöndrade SASP-faktorer, nedreglerad Ki67, förlust av kärnhöljesprotein Lamin B1 och ökad heterokromatinmarkör H3K9me321,22. Kompletterande figur S3 visade framgångsrik detektion av C12FDG + EdU-Ki67- senescentpopulationer i TIS KARPAS422- och WSU-DLCL2-celler.
Dessutom finns det många senescence cellytemarkörer tillgängliga för testning med denna metod, såsom ICAM-1, NOTCH1, NOTCH3, DDP4, CD36 och uPAR. Detektion av cellytemarkörer kräver endast en kort antikroppsinstruktionstid utan cellfixering och permeabilisering, vilket kommer att förkorta färgningsproceduren till ett 6-timmars arbetsflöde i kombination med fSA-β-gal och EdU, eller till och med till ett 2-timmars experiment i kombination med endast fSA-β-gal, och ännu viktigare, det möjliggör levande cellavbildning. Den modifierade metoden kan potentiellt fungera som ett snabbt, tillförlitligt och genomförbart tillvägagångssätt i kliniken för att identifiera åldrande celler in vivo, inte bara för diagnostisk och prognostisk utvärdering utan också för att stödja ytterligare senolytisk intervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag till Yong Yu från Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
