Summary
我们提出了一种使用原子力显微镜测量正常和患病肝脏中富含胶原蛋白的区域的弹性模量的方案。同时使用偏振显微镜为定位肝脏切片中富含胶原蛋白的区域提供了高空间精度。
Abstract
基质僵硬被认为是肝纤维化进展的关键驱动因素之一。它对细胞行为的各个方面都有深远的影响，如细胞功能、分化和运动。然而，由于这些过程在整个器官中并不均匀，因此了解组织在细胞水平上的机械性能变化变得越来越重要。
为了能够监测肝叶内富含胶原蛋白的区域的变硬，本文提出了一种通过原子力显微镜（AFM）以高空间精度测量肝组织弹性模量的协议。AFM是一种灵敏的方法，有可能表征局部机械性能，计算为杨氏（也称为弹性）模量。AFM与偏振显微镜相结合，可用于根据组织中胶原纤维的双折射特异性定位纤维化发展区域。使用提出的方案，我们表征了纤维化小鼠肝脏富含胶原蛋白的区域的硬度以及对照小鼠肝脏中相应区域的硬度。
随着纤维化的发展，观察到胶原蛋白阳性区域的硬度显着增加。由于使用了轻度固定的肝组织，所提出的协议允许高度可重复的AFM测量方法，该方法可用于进一步了解疾病引发的局部组织机械性能变化及其对邻近细胞命运的影响。
Introduction
肝脏是维持生物体内平衡的重要器官1，2。慢性肝病每年占全球~200万人死亡3。它们最常见的起源是病毒感染、自身免疫性疾病、代谢综合征或酒精滥用相关疾病，并伴有进行性肝纤维化。肝损伤引起炎症反应，导致沉积细胞外基质（ECM）的细胞在伤口愈合反应中激活。然而，在存在慢性损伤的情况下，过量的ECM会在肝脏内形成未解决的瘢痕组织，导致肝纤维化，肝硬化，肝癌的发展，并最终导致肝衰竭4。
肝细胞损伤立即导致肝硬度增加5，6。这直接影响肝细胞功能，激活肝星状细胞（HSC）和门脉成纤维细胞，并导致它们转分化为胶原沉积的肌成纤维细胞7，8。纤维ECM的沉积进一步增加了肝脏硬度，创造了肝脏硬化和基质产生细胞活化的自我放大反馈回路。
因此，肝硬度已成为肝病预后的重要参数。生物力学组织特性的变化可以在通过组织学分析诊断纤维化之前检测到。因此，在研究和临床应用中已经开发了各种肝硬度测量技术。在临床环境中，瞬时弹性成像（TE）9，10，11，12，13和磁共振弹性成像（MRE）14，15，16，17，18已被用于通过检查肝脏粗硬度来非侵入性诊断肝损伤的早期阶段19。
在TE中，温和振幅和低频（50Hz）的超声波通过肝脏传播，并测量其速度，然后用于计算组织弹性模量13。然而，由于超声波通过肝脏周围组织传输不当，该技术对腹水、肥胖或肋间隙下的患者没有用9.
MRE基于磁共振成像模式，使用20-200 Hz机械横波靶向肝脏。然后使用特定的磁共振成像序列来追踪组织内部的波并计算组织硬度16。TE和MRE技术报告的硬度值与使用组织学METAVIR评分20排名的人肝样本活检获得的肝纤维化程度密切相关（表1）。TE和MRE也已用于测量啮齿动物模型中的肝脏硬度，用于研究目的21，22，23。然而，由于这两种方法都从组织对传播横波的响应中得出刚度值，因此获得的值可能无法反映组织的绝对机械刚度。
为了对啮齿动物肝脏进行直接机械表征，Barnes等人开发了一种模型-凝胶-组织测定（MGT测定），涉及将肝组织包埋在聚丙烯酰胺凝胶24中。该凝胶被脉冲均匀力压缩，从中可以计算杨氏模量。MGT测定与适用于正常肝和纤维化肝脏的压痕测定具有良好的相关性24 （表1）。
表1：体积水平的肝脏硬度值。 TE 和 MRE 与使用压痕和 MGT 测定对不同来源的肝脏进行肝脏弹性模量的直接离体机械测量进行比较。E 和 G 之间的关系由 E = 2G （1 + v） 给出，其中 v 是样品的泊松比;F0 到 F4 代表 METAVIR 评分系统中的纤维化评分，F0 表示低纤维化或无纤维化和 F4 肝硬化。缩写：TE = 瞬态弹性成像;MRE = 磁共振弹性成像;MGT = 模型凝胶组织;E = 弹性（杨氏）模量;G = 剪切模量。请按此下载此表格。
一般肝硬度测量的主要缺点之一是它们不能提供肝脏硬度异质性的细胞级分辨率。在纤维化的进展过程中，与周围的实质25，26相比，富含胶原蛋白的区域显示出更高的刚性。这种刚度梯度局部影响常驻细胞，并在驱动HSC异质性中起重要作用27。因此，需要在微观水平上表征肝病发展过程中局部机械性能的变化，以更好地了解纤维化进展。
AFM允许以高分辨率和高力灵敏度测量组织的机械性能。AFM使用悬臂的尖端以低至几皮顿的力压进样品表面，根据所用尖端的几何形状和尺寸在微观或纳米水平上诱导变形。然后测量样品对施加应变的力响应，作为悬臂28中的偏转。从悬臂的接近和缩回中收集力-位移曲线，可以与适当的接触力学模型配合以评估样品的局部刚度29。
除了测量给定区域的刚度外，AFM还可以提供有关样品中特定特征的形貌信息，例如胶原纤维的结构30，31，32。多项研究描述了AFM的应用，以测量各种健康和患病组织的硬度，例如皮肤32，33，肺34，35，脑36，乳腺37，38，39，软骨40或心脏41，42，43，44来自患者和小鼠模型样本。此外，AFM还用于体外测定细胞和细胞外蛋白质支架的硬度45，46，47。
使用AFM测量生物样品的机械性能非常重要，因为它们的柔软性和易碎性。因此，各种研究标准化了不同的条件和设置，这些条件和设置产生了广泛波动的杨氏模量值（由Mckee等人审查48）。与其他软组织类似，不同等级肝纤维化的肝杨氏模量值也显示出广泛的变化（表2）。杨氏模量值的差异源于AFM操作模式，悬臂尖端，样品制备方法，样品厚度，压痕深度和力，测量过程中的肝组织环境以及分析方法的差异（表2）。
表2：细胞水平的肝硬度值。 使用AFM获得的肝脏硬度值描述了肝脏在细胞水平上的机械性能。缩写：AFM = 原子力显微镜;E = 弹性（杨氏）模量;PFA = 多聚甲醛;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请按此下载此表格。
本文描述了一种通过AFM可重复测量肝组织中富含胶原蛋白的纤维化区域的杨氏模量的方案，并通过使用偏振显微镜提供精确的定位。我们在小鼠模型中施用四氯化碳（CCl4）以小叶中心方式诱导胶原蛋白沉积49 ，可靠地模拟人肝纤维化的关键方面50。由于胶原纤维51的双折射，偏振显微镜图像能够可视化肝脏中的胶原蛋白，这允许悬臂尖端精确定位在肝小叶52内所需的感兴趣区域上。
Protocol
所有动物实验均按照分子遗传学研究所动物护理委员会批准的动物协议和欧盟动物实验指令2010/63 / EU进行。所提出的协议的总体示意图如图 1所示。
图1：AFM评估小鼠肝脏杨氏模量的总体示意图。 （A）从对照或处理的小鼠中分离肝脏，然后在-80°C下切片和储存（最大储存，2周）。（B）将球形珠连接到悬臂上，随后用胶水固化过夜（左）。悬臂校准，然后进行样品安装（右）。（C）偏振片和分析仪的对齐以可视化明亮的胶原蛋白结构，然后将相机中的图像与AFM悬臂下方的测量区域叠加。（D） 获取刚度图和分析。缩写：AFM = 原子力显微镜;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;OCT = 最佳切削温度化合物;CCl 4 = 四氯化碳。 请点击此处查看此图的大图。
1. 样品制备 I
- 从麻醉下因颈椎脱位而安乐死的小鼠打开的腹部切除肝脏。通过在干冰上快速冷冻，分离左侧叶并将左半叶嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物中。将OCT包埋的组织储存在-80°C。
注意：以前的研究表明，冷冻组织和新鲜组织之间的刚度值相似25，26。 - 使用冷冻切片机将30μm厚的肝切片到带正电荷的载玻片上，并将载玻片储存在-80°C，直到AFM测量日不超过2周。
2. 设置仪器
- 将5.7μm磁珠连接到AFM悬臂尖端（补充图S1，步骤1-5）
注意：珠子与悬臂的连接之前也由Norman等人描述过46。- 将直径为5.7μm的三聚氰胺树脂珠的悬浮液均匀地散布在载玻片面积的一半上，并风干以蒸发溶剂（补充图S1，步骤1）。
- 在载玻片的另一半，使用10 μL吸头，制作一条工作时间较长的预混环氧树脂细线（补充图S1，步骤1）。
- 根据制造商的说明将悬臂探头加载到AFM头上。
- 使用装有悬臂探头的AFM头安装滑块和盖子。
注意：研究中使用了SD-qp-BioT-TL-10悬臂。 - 将预混环氧树脂胶带到载玻片的中心，并以低力接近悬臂上的胶水（将 设定值 设置为 1 V 以遵循此协议;补充图S1，步骤2）。
注意：在接近载玻片表面之前，请按照第 2 部分第 3 部分“AFM 悬臂弹簧常数的校准”中的步骤 6-8 确保激光对准悬臂尖端的中心，由高总和电压指示。 - 悬臂探头的尖端与胶水接触后，将其移动到滑块上方以去除多余的胶水。
- 现在，从载玻片上收回悬臂尖端并移动载玻片以将单个珠子放在中心（补充图S1，步骤3）。使用具有更高力（设定点2 V）的AFM悬臂探头再次接近磁珠，将磁珠连接到悬臂探头的中心并放置至少10秒（补充图S1，步骤4）。
- 提取悬臂探头并在室温下保持过夜以使胶水硬化或按照环氧树脂的说明进行操作（补充图S1，步骤5）。
- 设置偏振片和分析仪
- 要定位肝脏切片内感兴趣的区域，请使用偏光片和分析仪设置显微镜。通过手动或以自动方式旋转其中一个方位角，以0°和90°之间的角度对齐它们的振动方位角，以最小化透射光并最大化通过物镜的非凡光线。确保胶原纤维在偏振图像的黑暗背景下看起来很亮（图2），这通过图像直方图的峰值向明亮像素的偏移来反射。
图 2：与明场图像相比，代表性显微镜图像在偏振显微镜中显示出胶原纤维的明显可视化。 用CCl 4 处理3周的小鼠的肝脏切片进行（A）明场和（B）偏振显微镜检查。与明场图像相比，偏振图像中的双折射胶原纤维在白色中清晰可见。红色框表示用于AFM测量的富含胶原蛋白的区域。插图在红色框中显示该区域的放大视图。比例尺 = 100 μm。缩写：AFM = 原子力显微镜;CCl 4 = 四氯化碳;CV = 中央静脉;PV = 门静脉。 请点击此处查看此图的大图。
注意：对于此协议，AFM头可以安装在任何合适的倒置显微镜上，并可以插入偏光片和分析仪。系统必须放置在隔离单元中，以减少背景噪音。
- AFM悬臂弹簧常数的校准
- 根据制造商的说明将悬臂探头（根据第2部分第1部分“将5.7μm珠子连接到AFM悬臂尖端”中的步骤1-8制备）加载到AFM头上。
- 用70%乙醇清洁悬臂，以防止在测量过程中污染悬臂。用蒸馏水充分清洗，以去除尖端残留的乙醇。
- 启用 接触 模式并选择 力映射 作为 测量方法。
- 通过单击相应的按钮，打开软件选项卡中的所有相关窗口（Z 步进电机、电动载物台控制、数据查看器、力扫描图示波器、激光对准和 相机 窗口）。
- 将含有 1.2 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的干净载玻片安装在约 2 cm x 4 cm 的区域内，用疏水性记号笔划定。将AFM头安装在显微镜载物台上，并确保悬臂完全浸入PBS中。
- 将物镜对准悬臂尖端。降低显微镜上透射光的强度，以更好地观察显示器上的激光位置。
- 将激光对准悬臂的半透明端（球形珠连接在其下方），并使用AFM头上的旋钮对准镜子，以最大化探测器上激光束的总强度（由 激光对准 窗口中的总和表示）。
- 使用AFM头上的旋钮对准光电二极管检测器，将激光定位在其中心。
- 让悬臂稳定15分钟，然后再进行校准。
- 打开 校准管理器 并插入 悬臂类型、悬臂尺寸和环境 条件。通过单击校准来校准弹簧常数和灵敏度（也称为反向光学杠杆灵敏度，InvOLS ）。使用制造商的声明确认校准后获得的弹簧常数的准确性。在 非接触 模式下校准悬臂（校准由软件使用Sader等人58推导的热定理执行）。
注意：悬臂的弹簧常数表示悬臂的刚度，由悬臂根据变形长度变形时的阻力给出，以N / m为单位。悬臂的灵敏度描述了光电二极管响应悬臂偏转（纳米）的值（以伏特为单位），通常以nm / V59表示。在非接触模式下，热噪声频谱被记录下来，并在校准后由AFM控制软件自动安装流体动力功能60 。接头提供校准参数，即弹簧常数和InvOLS。本研究中使用的SD-qp-BioT-TL-10悬臂的弹簧常数为0.09 N / m，如制造商所述。
3. 样品制备 II
- 将冷冻部分（储存在-80°C，如第1节，样品制备I中所述）在室温下解冻2分钟。
- 用冰冷的4%多聚甲醛（PFA）在1x PBS中在4°C下固定切片10分钟，然后用1x PBS广泛洗涤（5x）。用纸巾擦拭切片周围的残留PBS，并用疏水记号笔在肝切片周围标记约2 cm x 4 cm的边界。用 1x PBS 覆盖样品（确保划定区域包含 ~1.2 mL 的 1x PBS）。使用样品进行 AFM 测量。
注意：由于PFA是一种危险化学品，因此必须小心处理以防止与皮肤或眼睛接触。为避免其有毒烟雾，所有涉及PFA的程序必须在经过认证的化学通风柜或其他经批准的通风区域进行。
4. 测量
- 通过转到 “设置 ”选项卡并在“自动保存”上打勾来启用 自动保存。指定用于保存测量文件的文件名和目录，方法是转到 “ 设置”选项卡，然后单击 “保存设置”。
- 上样（根据第 3 节，样品制备 II 制备）。通过打开 激光 并单击 接近 键，使用 AFM 悬臂接近组织表面。尖端与组织表面接触后，缩回悬臂尖端，使尖端保持在物镜的焦点上（通过单击缩回键，将悬臂 缩回 压电范围的顶端）。如果激光位置在 激光对准 窗口上远离其中心，请重新对齐探测器。
- 关闭 激光器 ，并通过单击 附件 选项卡，然后选择 直接叠加光学校准，用AFM测量图覆盖显微镜的光学场。在随后的窗口中，单击 “下一步 ”以拍摄悬臂扫描特定区域的一系列图像。再次单击 下一步 以转到下一个窗口。
- 在第一个图像中，手动单击悬臂尖端的中心以描绘软件中的尖端位置。可以通过指示其 半径 来操纵描述尖端位置的圆圈的大小，以提高准确性。单击 校准以自动检测所有图像中的悬臂尖端位置。通过浏览图像确认尖端检测的准确性。
- 单击 下一步 ，然后单击完成以 完成 光学叠加并保存光学校准期间捕获的一系列图像。
- 进一步缩回悬臂以避免其与滑块上较高的表面发生碰撞。移动载物台以使用偏振图像将富含胶原蛋白的区域放置在“数据查看器”选项卡中可见的绿色框中。通过在指定的绿色框中长按鼠标左键在其周围制作一个矩形来选择富含胶原蛋白的区域。在左侧的“网格”选项卡下定义所选区域的尺寸、方向和分辨率。单击确认新扫描区域，将所选区域设置为测量区域。
- 将反馈回路的 IGain 和 PGain参数保持在默认值，如果没有以系统过度敏感的形式出现重大不稳定。要遵循此协议，请将 IGain 设置为 50 Hz ，将 PGain 设置为 0.001。
- 将 设定值 设置为 1 nN。
注意： 设定点 是静止状态下尖端与表面相互作用的力。对于大多数软样品（细胞、凝胶和组织），设定 值 在 0.5-2.0 nN 范围内是合适的。 - 根据所研究材料的机械性能和悬臂的刚度选择 相对设定值 。对于此协议，请将值设置为 5 nN。
注意： 相对设定点表示当达到力-距离曲线的峰值并且尖端运动返回到基线时的最大相互作用力。对于软材料 （1-50 kPa），此参数以纳牛顿 （nN） 为单位设置。此外，对于软悬臂（弹簧常数从0.05 N/m到0.35 N/m），可以施加的最大力约为50 nN。相应地调整设定值和相对设定值。- 确保给定的设定值不会导致压痕深度大于球面压头的半径，否则在计算杨氏模量时无法正确定义压痕表面。计算第一次压痕运行后压痕深度的平均值;请参阅第 5 节 “数据分析”，了解如何处理记录的数据。如果需要，调整 设定值 。
- 将 调整基线 设置为 5。
注意： 此处的 基线 是指用于拟合进近曲线和退刀曲线的多项式次数。将基线设置为 5 可使曲线适合高分辨率，从而确保在测量过程中捕获背景噪声。 - 根据样品的表面形貌在Z轴上选择悬臂运动的长度（Z长度）。要遵循此协议，请将 Z长度 设置为 15μm。
注意：高值（例如 15 μm）会降低测量灵敏度，但对于具有高度不规则表面的样品（例如纤维化肝组织）通常需要测量灵敏度。 - 将 Z 移动 设置为 恒定持续时间。
注意： Z 移动也可以设置为 恒定速度， 以便在不同模式下查看有关 Z 移动 （扩展速度 和 扩展时间）的数据。 - 将 延长时间 设置为 1 秒。将 延伸 延迟和 退刀延迟 设置为 0。
注意：对于非常柔软的材料，请使用 >5.0 μm/s 的延伸速度61，因为较低的压痕速度将导致来自柔软表面的更粘性和更少的弹性响应。 伸展 延迟和回缩延迟 是可用于研究悬臂尖端和底物之间特定相互作用的参数（例如，固定在悬臂表面上的蛋白质与固定在载玻片表面上的蛋白质的相互作用）。 - 将 采样率 设置为 5000 Hz。
注意： 采样率是指在完整的进近-退刀曲线上记录的点的频率。将其设置为较高的值（例如 5000 Hz），以避免由于曲线的转换速度极快而错过曲线的某些区域。 - 用刻度标记 Z 闭环以启用反馈回路系统，确保样品表面和悬臂尖端之间的距离。
- 通过取消选择“ 接合 ”并单击“ 接近 ”来脱离电动载物台，以使用悬臂接近样品。点击 开始扫描 开始在步骤6中设置的区域中收集力-距离曲线;第 4 节，测量。
5. 数据分析
- 使用开源软件“AtomicJ”（可从 https://sourceforge.net/projects/jrobust/ 下载）分析获取的数据。
注意：它支持从安捷伦科技、JPK 仪器或布鲁克原子力显微镜收集的文件。 - 通过单击AtomicJ中的过程力曲线和映射图标，将 力曲线 加载到程序中（补充图S2A，x）。在 处理助手中，通过单击添加按钮 添加 要分析的地图（补充图S2A，y）。加载地图后单击 下一步 （补充图S2A，z）。
- 根据下面描述的步骤在下一个窗口中指定处理设置（对应于 补充图S2B，步骤1-11中的步骤）：
- 通过计算或使用一组拟合曲线参数自动估计样品和悬臂之间的接触点。要遵循此协议，请使用接触点的 自动 估计。
- 通过经典聚焦网格法确定悬臂和样品之间的接触点。
- 根据实测力曲线的质量选择 估计方法 ，以产生接触点的最佳确定，这需要在数据分析优化时根据经验确定。若要遵循此协议，请使用 与模型无关的方法。
- 使用经典模型拟合力压痕曲线（使用经典 L2 进行模型拟合以遵循此协议）。
注意： 模型拟合和接触估计器分别是控制软件如何拟合曲线以及如何在拟合曲线中建立接触点的参数。对于这些测量，使用了经典选项，该选项使用最小二乘回归。这会将曲线上的每个低力点作为试验接触点进行处理，并将多项式拟合到试验接触点之前的区域。然后，它将适当的接触模型拟合到收集的力压痕数据。假定给出最小平方和的点为接触点。可以使用基于力曲线62，63的质量得到其它方法。 - 将模型的 拟合 设置为 “退出” 曲线。
- 将 泊松比 设置为 0.45，建议用于肝脏24 等软组织。
- 使用 基线度 3 和 接触度 1 设置曲线的拟合。根据曲线与模型的偏差尺度更改多项式拟合度。
- 选取用于拟合退曲线的模型。使用 Sneddon 模型，该模型根据公式 （1） 和公式 （2） 计算杨氏模量：
（1）
δ =
（2）
其中 F 是力， E 是杨氏模量， v 是样品的泊松比，δ 是压痕深度， a 是接触半径， R 是球体半径62，63。 - 以微米为单位填写球形尖端的 半径 （本协议中为2.9μm ）。
- 通过启用读入（选中复选框）从数据文件加载弹簧常量和 InvOLS。
- 点击 完成。
注意：分析的数据以垂直挠度、高度、附着力、接触力、变形、粘附力、R2 值、斜率、杨氏模量、过渡压痕、过渡力和为每条力曲线计算的接触位置图的形式呈现（补充图 S3，左上角）。另外两个窗口显示力曲线和原始值（补充图S3，分别是右上方和下图）。
- 排除悬臂错误地接近肝切片表面的力曲线。为了识别这些曲线，请寻找具有高噪声、异常形状和/或不完整方法的曲线，如图 3 所示，并在其他地方详细讨论46。
（1）
（2）
图3：代表性力-位移曲线示例。 （A，B）较硬的代表性可解释力曲线（A;E = 10.5 kPa）和较软（B;E = 1.78 kPa） 适合分析的区域。（C-F）由于 （C-E） 不正确的方法或 （F） 较高噪声而需要从分析中排除的代表性不可解释的图形。如（A）中提供的图例所示，红色曲线表示悬臂的接近，绿色曲线表示悬臂的缩回。黑线表示悬臂退出曲线的拟合。黑线的斜率对应于杨氏模量。红色和蓝色点分别对应于接触点和过渡点。接触点是悬臂和基板在缩回过程中的最后一个接触点，而过渡点描述了悬臂从接近到缩回的过渡。请点击此处查看此图的大图。
Representative Results
如本协议所述，用AFM探测从对照小鼠和轻度或晚期纤维化小鼠（分别通过注射CCl 4 诱导3周或6周，分别为49）获得的轻度固定，30μm厚的肝脏切片。选择靠近中央静脉的胶原纤维进行刚度图的测量。在对照肝脏中分析靠近中央静脉的区域，对应于CCl 4处理动物中通常形成胶原纤维的区域（图4A）。杨氏模量的分布在单个肝切片内的不同对照肝脏和富含胶原蛋白的区域是可重复的（图4B：左小提琴图）。
在CCl 4处理的动物中，与对照小鼠的等效面积相比，对应于胶原蛋白沉积物中心周围区域的硬度图显示杨氏模量值显着更高（图4B：对照组的1.9 kPa vs. 2.6 kPa杨氏模量中位数值与3周CCl 4处理小鼠相比;p = 0.07;对照组的杨氏模量值中位数为1.9 kPa vs. 5.1 kPa 与6周CCl4-处理过的小鼠;p = 0.02）。此外，使用较长的CCl 4处理，杨氏模量值显着增加（图4B;3周与6周CCl4处理小鼠的杨氏模量值中位数为2.6 kPa与5.1 kPa;p = 0.04）。这表明随着纤维化的进展，胶原蛋白沉积物逐渐变硬，并且AFM测量反映了纤维化。
为了评估长时间储存OCT包埋的肝脏切片对胶原纤维机械性能的影响，我们测量了CCl 4处理小鼠切片中胶原纤维的硬度，切割后在载玻片上在-80°C下储存2周或3个月（图5）。AFM 测量显示，与在样品切片后 2 周内测量的切片相比，储存 3 个月的切片在富含胶原蛋白区域的杨氏模量值显着降低（图 5;4.7 kPa 与 3.6 kPa 杨氏模量中位数值相比，2 周与 3 个月存储;p < 0.001）。因此，重要的是在从OCT嵌入的肝叶制备切片后不久测量肝组织的机械性能。
图 4：AFM 测量显示富含胶原蛋白的区域逐渐变硬，与延长的 CCl4 治疗相关。 （A）对照小鼠和用CCl 4处理3周或6周的小鼠的肝脏切片用于测量富含胶原蛋白的区域的机械性能。偏振显微镜图像（左）中显示的肝脏切片的框框区域是用于AFM测量（30μm x 100μm，10像素x 36像素）选择的富含胶原蛋白的扫描区域（或对照肝脏中的相应区域）。右侧显示了杨氏模量图，其色阶对应于这些框形区域，包括这些图中杨氏模量值的直方图;插图散点图显示每个条件的值 >10 kPa。肝脏的僵硬被可视化为直方图分布的逐渐右移和插图散点图中点的频率更高。比例尺 = 20 μm。 （B） 小提琴图显示了针对每种条件测量的三个区域的弹性模量分布（左），并汇总了所有三个地图的弹性模量值（右）。小提琴图显示中位数（红线）、第 25 个百分位数和第 75个百分位数（黑线）;点表示区域 1-3 中各个地图的平均值。所呈现的 p 值是使用对均值执行的学生 t 检验计算的。缩写：AFM = 原子力显微镜;CCl 4 = 四氯化碳。请点击此处查看此图的大图。
图5：延长肝脏切片的储存导致富含胶原蛋白的区域的硬度降低。 肝切片（由用CCl 4 处理2周的小鼠制备）在-80°C下储存2周或3个月用于测量杨氏模量。偏振显微镜图像（左），带有指示用于AFM测量的富含胶原蛋白的区域（30 μm x 100 μm，10像素x 36像素）的框。带有色标的相应杨氏模量图（右）。直方图显示从每个样本的 4-6 个区域收集的杨氏模量值;插图散点图显示每个条件的值 >10 kPa。比例尺 = 20 μm。缩写：AFM = 原子力显微镜;CCl 4 = 四氯化碳。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：用三聚氰胺树脂微珠修饰悬臂的方法。 （A）绘制的示意图说明了球形珠子与悬臂尖端的连接。有关逐步说明，请参阅第 2 节，第 1 部分，将 5.7 μm 磁珠连接到 AFM 悬臂尖端。（B） 从顶部（左）和侧视图（右）显示连接到悬臂尖端的球形 5.7 μm 磁珠的显微镜图像。比例尺 = 20 μm。缩写：AFM = 原子力显微镜;RT = 室温。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：AtomicJ中的数据分析。 （A） 在 AtomicJ 中打开刚度图要遵循的步骤顺序。在加工力曲线和贴图（x）上单击鼠标左键即可打开加工助手。可以通过单击添加 （y） 并选择所需的文件将文件加载到处理助手。单击下一步 （z） 继续下一步。（B） 曲线拟合参数、适当的接触力学模型和测量期间使用的 AFM 设置。步骤 1-11 是指协议步骤 3 第 5 节“数据分析”中详述的相应子点。请点击此处下载此文件。
补充图S3：AtomicJ中分析数据的概述。 分析数据的预览显示刚度图（左上窗口）、力曲线（右上窗口）和原始数据（下窗口）。缩写：AFM = 原子力显微镜。 请点击此处下载此文件。
Discussion
所提出的协议为正常和纤维化小鼠肝组织的AFM测量提供了一种逐步可重复的方法。耦合偏振显微镜提供高空间精度，并且由于其双折射而能够可视化胶原纤维。此外，还提供了对所获得的力曲线的分析的详细描述。AFM硬度测量可以在细胞水平上进行，这允许监测由于发展中的纤维化疾病而导致的肝组织机械性能的局部变化。肝纤维化不是影响整个器官的均质过程。相反，富含胶原蛋白的纤维化隔膜区域散布着胶原蛋白沉积量低或没有胶原蛋白沉积的区域。因此，硬度变化特定于局部微环境，并且仅影响与损伤损伤区域接触的局部细胞。这种刚度异质性的微观尺度在AFM Young模量图的细节中也很明显，其中高刚度点与几乎正常刚度的区域接壤。这种变化表明，即使是胶原蛋白疤痕组织区域也不是机械均匀的，需要在细胞水平上表征AFM测量（图4）。
所提出的协议允许通过AFM独立于肝脏收集测量肝脏硬度，因为嵌入OCT的整个肝叶可以在-80°C下长时间储存。 然而，一旦组织被切片，我们建议在~2周内测量样品，因为我们观察到储存更长时间的组织切片逐渐软化（图5）。
配备偏振显微镜的AFM可以精确定位肝小叶结构内感兴趣的区域。但是，它也有一些限制，在解释结果时需要考虑。此处获得的刚度值是在室温下测量的。我们假设温度对软组织的机械性能的影响很小;然而，这可能是肝组织机械性能的 体内 报告值与本研究中的值之间存在差异的原因之一。
此外，该协议允许对肝组织进行长达3小时的AFM分析，这需要对组织进行轻度固定。组织切片的轻度固定以及冻融循环很可能会影响杨氏模量的绝对值。因此，报告的杨氏模量值可能与 体内 值不同。需要进一步的研究来优化测量肝切片杨氏模量绝对值的方案，这可以通过不同的肝组织固定方法来实现64。
尽管如此，我们观察到用CCl 4 治疗3周的小鼠肝脏中富含胶原蛋白的区域的硬度增加，而不是6周。这些变化对应于长期损伤期间的纤维化进展（图4），并表明可以使用所提出的方案探测不同治疗之间的相对差异。这与Calò等人的观察结果一致，他们表明，轻度固定的肝脏切片在富含胶原蛋白和缺乏胶原蛋白的区域之间的硬度值上显示出与新鲜组织相似的硬度值差异25。
我们使用SD-qp-BioT-TL-10悬臂（理论弹簧常数~0.09 N / m）进行了修改，该悬臂用直径为5.7μm的球形尖端进行了修改，以最大程度地减少测量过程中肝组织的机械破坏。5.7 μm的磁珠能够充分压痕样品，以探测其刚度，同时保持其完整性。经过多次优化后，可以使用直径较小的磁珠在刚度图中获得更高的分辨率，但可能导致进一步高估杨氏模量值（有关更多详细信息，请参阅Crichton等人65）。使用指定的悬臂珠集成，我们能够在从数十单位Pa到~100 kPa的宽范围内表征样品刚度。
Sneddon的模型用于从力曲线推导出杨氏模量，因为它允许使用胶体探针62分析深压痕。与赫兹的模型不同，斯内登的模型不受接触半径必须远小于球体半径的约束。它进一步假设样品厚度比压痕深度30，66大几倍。在本研究中，在富含胶原蛋白的区域，压痕为~2μm，磁珠尺寸为5.7μm，样品厚度为30μm;因此，斯内登的模型是合适的。考虑尖端和基材之间的粘附力的其它型号63 可用于不同类型的组织。
AtomicJ 中的分析实现了对样品有限厚度的校正，以最大限度地减少基底的贡献，同时推导出杨氏模量62，67。在分析获得的力曲线时，我们使用了0.45的单个泊松比，该比以前已被推荐用于软组织器官24。这种近似对杨氏模量的计算值没有显著影响，因为泊松比值从 0.4 到 0.5 的变化只会导致根据 Sneddon 方程计算的杨氏模量值减少 0.893 倍。鉴于CCl 4 处理不同持续时间之间杨氏模量的多倍差异，近似泊松比产生的误差只是微不足道的。
我们使用退缩曲线来计算刚度值，因为我们感兴趣的是组织对悬臂提供的载荷的弹性响应，而不是对压痕68的塑性响应。由于软组织的粘弹性响应，拟合撤回曲线可能会高估杨氏模量，应牢记这一点。此外，我们观察到，使用接近曲线进行数据分析时，纤维化区域和控制区域之间的刚度值趋势相似，尽管绝对值相应较低（数据未显示）。
在优化方案时，我们确定了对测量可重复性至关重要的几个步骤。首先，重要的是要确保珠子在连接到悬臂时大约位于半透明尖端的中心。这可以防止压痕过程中可能的机械不平衡。其次，用PFA固定肝脏时，要严格遵循解冻和固定的时间限制。改变此步骤的时间可能会严重影响组织切片的机械性能。第三，悬臂必须通过连续监测和输入并发温度值进行反复校准，以避免由于温度波动而导致刚度值出现任何伪影。最后，从制备开始测量单个肝切片的时间不应超过3小时，因为覆盖的PBS可能会在更长的时间内蒸发。读者可以参考故障排除表（表3）来解决AFM测量过程中遇到的问题，Norman等人46也详细讨论了这个问题。
表 3：故障排除指南。请按此下载此表格。
所提出的方案允许对肝组织进行可重复的AFM探测。它有可能在微观水平上揭示有关纤维化肝病发展和最终消退的信息，并有助于开发针对慢性肝病进展期间形成的纤维化疤痕区域的疗法。
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了捷克共和国资助机构（18-02699S），捷克科学院机构研究项目（RVO 68378050）和MEYS CR项目NICR EXCELES（LX22NPO05102）的支持。CIISB，Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium，由MEYS CR基础设施项目LM2018127和欧洲区域发展基金项目“UP CIISB”资助（No.CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974）为CF纳米生物技术CEITEC MU的测量提供了资金支持。我们还感谢由MEYS（LM2018129，CZ.02.1.01 / 0.0 / 0.0 / 18_046 / 0016045）和RVO：68378050-KAV-NPUI支持的光学显微镜核心设施，捷克共和国布拉格IMG CAS，感谢他们对本文提供的显微镜成像的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
| Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
| The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
| Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
| Cryotome | Leica | CM1950 | |
| Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
| Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
| Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
| AtomicJ v2.3.1 | |||
| Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
| System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
| Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |
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