Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling af leverstivhed ved hjælp af atomkraftmikroskopi kombineret med polarisationsmikroskopi

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63974
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 1, 1
1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences, 2CEITEC MU, Masaryk University, 3Department of Biochemistry, Faculty of Science, Masaryk University, 4Laboratory of Biomathematics, Czech-BioImaging IPHYS, Institute of Physiology of the Czech Academy of Sciences

Summary

Vi præsenterer en protokol til måling af de elastiske moduler af kollagenrige områder i normal og syg lever ved hjælp af atomkraftmikroskopi. Samtidig brug af polarisationsmikroskopi giver høj rumlig præcision til lokalisering af kollagenrige områder i leverafsnittene.

Abstract

Matrix afstivning er blevet anerkendt som en af de vigtigste drivkræfter for progression af leverfibrose. Det har dybe virkninger på forskellige aspekter af celleadfærd såsom cellefunktion, differentiering og bevægelighed. Men da disse processer ikke er homogene i hele organet, er det blevet stadig vigtigere at forstå ændringer i vævets mekaniske egenskaber på cellulært niveau.

For at kunne overvåge afstivningen af kollagenrige områder i leverloberne præsenterer dette papir en protokol til måling af levervævselastiske moduler med høj rumlig præcision ved atomkraftmikroskopi (AFM). AFM er en følsom metode med potentiale til at karakterisere lokale mekaniske egenskaber, beregnet som Youngs (også kaldet elastiske) modul. AFM kombineret med polarisationsmikroskopi kan bruges til specifikt at lokalisere områderne med fibroseudvikling baseret på birefringensen af kollagenfibre i væv. Ved hjælp af den præsenterede protokol karakteriserede vi stivheden af kollagenrige områder fra fibrotiske muselever og tilsvarende områder i leveren hos kontrolmus.

En fremtrædende stigning i stivheden af kollagenpositive områder blev observeret med fibroseudvikling. Den præsenterede protokol giver mulighed for en meget reproducerbar metode til AFM-måling på grund af brugen af mildt fikseret levervæv, der kan bruges til at fremme forståelsen af sygdomsinitierede ændringer i lokale vævsmekaniske egenskaber og deres virkning på nabocellernes skæbne.

Introduction

Leveren er et vigtigt organ til opretholdelse af homeostase i organismer 1,2. Kroniske leversygdomme tegner sig for ~ 2 millioner dødsfald på verdensplan årligt3. De stammer oftest som virusinfektioner, autoimmune lidelser, metaboliske syndromer eller alkoholmisbrugsrelaterede sygdomme og ledsages af progressiv leverfibrose. Leverskade fremkalder et inflammatorisk respons, hvilket fører til aktivering af celler, der deponerer ekstracellulær matrix (ECM) i et sårhelende respons. I nærvær af en kronisk fornærmelse danner overskydende ECM imidlertid uløst arvæv i leveren, hvilket fører til udvikling af leverfibrose, cirrose, leverkarcinom og i sidste ende til leversvigt4.

Hepatocytskade resulterer straks i øget leverstivhed 5,6. Dette påvirker direkte hepatocytfunktionen, aktiverer leverstellatceller (HSC'er) og portalfibroblaster og resulterer i deres transdifferentiering til kollagenaflejrende myofibroblaster 7,8. Aflejringen af fibrøst ECM øger leverstivheden yderligere, hvilket skaber en selvforstærkende feedback-loop af leverstivning og matrixproducerende celleaktivering.

Leverstivhed er således blevet en vigtig parameter i leversygdomsprognosen. Ændringen i biomekaniske vævsegenskaber kan påvises tidligere end fibrose kan diagnosticeres ved histologisk analyse. Derfor er der udviklet forskellige teknikker til måling af leverstivhed i både forskning og kliniske applikationer. I kliniske omgivelser er forbigående elastografi (TE) 9,10,11,12,13 og magnetisk resonanselastikografi (MRE)14,15,16,17,18 blevet anvendt til ikke-invasivt at diagnosticere tidlige stadier af leverskade ved at undersøge grov leverstivhed 19.

I TE formeres ultralydbølger med mild amplitude og lav frekvens (50 Hz) gennem leveren, og deres hastighed måles, som derefter bruges til at beregne vævselastisk modul13. Denne teknik er imidlertid ikke nyttig for patienter med ascites, fedme eller lavere interkostale rum på grund af ukorrekt transmission af ultralydbølgerne gennem vævene omkring leveren9.

MRE er baseret på magnetisk resonansbilleddannelsesmodalitet og bruger 20-200 Hz mekaniske forskydningsbølger til at målrette leveren. En specifik magnetisk resonansbilleddannelsessekvens bruges derefter til at spore bølgerne inde i vævet og til at beregne vævsstivheden16. Stivhedsværdier rapporteret med både TE- og MRE-teknikker korrelerer godt med graden af leverfibrose opnået fra biopsier af humane leverprøver rangeret ved hjælp af histologiske METAVIR-score20 (tabel 1). TE og MRE er også blevet tilpasset til måling af leverstivhed i gnavermodeller til forskningsformål21,22,23. Men da begge metoder udleder stivhedsværdierne fra vævets respons på de formerende forskydningsbølger, afspejler de opnåede værdier muligvis ikke vævets absolutte mekaniske stivhed.

Til en direkte mekanisk karakterisering af gnaverlever udviklede Barnes et al. et model-gel-vævsassay (MGT-assay), der involverede indlejring af levervæv i polyacrylamidgel 24. Denne gel komprimeres af en pulserende ensartet kraft, hvorfra Youngs modul kan beregnes. MGT-analysen viser en god sammenhæng med et indrykningsassay tilpasset både normale og fibrotiske lever24 (tabel 1).

Tabel 1: Leverstivhedsværdier på bulkniveau. TE og MRE sammenlignet med direkte ex vivo mekaniske målinger af leverelastikmoduler ved hjælp af indrykning og MGT-assays for lever fra forskellige kilder. Forholdet mellem E og G er givet ved E = 2G (1 + v), hvor v er Poissons forhold mellem prøven; F0 til F4 repræsenterer fibrosescoren i METAVIR-scoringssystemet, hvor F0 angiver lav eller ingen fibrose og F4-cirrhotiske lever. Forkortelser: TE = forbigående elastografi; MRE = magnetisk resonanselastikografi; MGT = model-gel-væv; E = elastisk (Youngs) modul; G = forskydningsmodul. Klik her for at downloade denne tabel.

En af de største ulemper ved generiske leverstivhedsmålinger er, at de ikke giver celleopløsning af stivhed heterogenitet i leveren. Under progressionen af fibrose viser kollagenrige områder højere stivhed sammenlignet med det omgivende parenchyma25,26. Denne stivhedsgradient påvirker lokalt de residente celler og spiller en vigtig rolle i at drive HSC heterogenitet27. Således skal ændringer i lokale mekaniske egenskaber under udvikling af leversygdom karakteriseres på mikroskopisk niveau for bedre at forstå fibroseprogression.

AFM gør det muligt at måle vævets mekaniske egenskaber med høj opløsning og høj kraftfølsomhed. AFM bruger spidsen af en cantilever til at indrykke overfladen af en prøve med kræfter så lave som flere piconewtons, hvilket inducerer en deformation på et mikroskopisk eller nanoskopisk niveau baseret på geometrien og størrelsen af den anvendte spids. Prøvens kraftrespons på den påførte stamme måles derefter som afbøjningen i udkragningen28. Kraftforskydningskurve indsamles fra udkragnings- og tilbagetrækningsmetoden af udkragningen, som kan udstyres med passende kontaktmekanikmodeller til evaluering af prøvens lokale stivhed29.

Ud over at måle stivheden af et givet område kan AFM også give topografiske oplysninger om specifikke træk i prøven, såsom strukturen af kollagenfibre30,31,32. Flere undersøgelser har beskrevet anvendelsen af AFM til at måle stivheden af forskellige sunde og syge væv, såsom hud 32,33, lunge 34,35, hjerne36, bryst37,38,39, brusk 40 eller hjerte41,42,43,44 fra både patient- og musemodelprøver. Desuden er AFM også blevet brugt in vitro til at bestemme stivheden af celler og ekstracellulære proteinstilladser45,46,47.

Målingen af de mekaniske egenskaber af biologiske prøver ved hjælp af AFM er ikke-triviel på grund af deres blødhed og skrøbelighed. Således har forskellige undersøgelser standardiseret forskellige forhold og indstillinger, som giver meget svingende værdier af Youngs moduli (gennemgået af Mckee et al.48). I lighed med andre bløde væv viser lever Youngs modulværdier ved forskellige kvaliteter af leverfibrose også omfattende variation (tabel 2). Forskellene i Youngs modulværdier stammer fra forskelle i AFM-driftsmåde, cantilever tip, prøveforberedelsesmetode, prøvetykkelse, indrykningsdybde og kræfter, levervævsmiljø under måling og analysemetode (tabel 2).

Tabel 2: Leverstivhedsværdier på celleniveau. Leverstivhedsværdier opnået ved hjælp af AFM beskriver leverens mekaniske egenskaber på celleniveau. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; E = elastisk (Youngs) modul; PFA = paraformaldehyd; PBS = fosfatbufferet saltvand. Klik her for at downloade denne tabel.

Dette papir beskriver en protokol til reproducerbar måling af Youngs moduler af kollagenrige fibrotiske områder i levervæv af AFM med en præcis lokalisering tilvejebragt ved brug af polarisationsmikroskopi. Vi administrerede carbontetrachlorid (CCl 4) for at inducere kollagenaflejring på en centrilobulær måde49 i en musemodel, der pålideligt efterligner afgørende aspekter af human leverfibrose50. Polariserede mikroskopiske billeder muliggør visualisering af kollagen i leveren på grund af birefringensen af kollagenfibre51, hvilket muliggør nøjagtig positionering af cantileverspidsen over det ønskede interesseområde inden for leverlobulen52.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med en dyreprotokol, der er godkendt af Animal Care Committee of The Institute of Molecular Genetics og i henhold til EU-direktivet 2010/63/EU til dyreforsøg. Et overordnet skematisk diagram over den præsenterede protokol er vist i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Samlet skematisk over AFM-evaluering af Youngs modul fra muselever. (A) Isolering af leveren fra kontrollerede eller behandlede mus efterfulgt af sektionering og opbevaring ved -80 °C (maksimal opbevaring, 2 uger). (B) Fastgørelse af den sfæriske perle til udkragningen med efterfølgende hærdning af lim natten over (til venstre). Cantilever kalibrering efterfulgt af prøvemontering (højre). (C) Justering af polarisatoren og analysatoren for at visualisere lyse kollagenstrukturer efterfulgt af en overlejring af billedet i kameraet med målefeltet under AFM-udkragningen. (D) Erhvervelse af stivhedskort og analyse. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; PBS = fosfatbufferet saltvand; OCT = optimal skæretemperaturforbindelse; CCl 4 = tetrachlormethan. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Forberedelse af prøver I

  1. Fjern leveren fra den åbne mave af en mus, der er aflivet ved cervikal dislokation under anæstesi. Isoler venstre laterallap og indlejr den laterale halvdel af loben i optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse ved hurtig frysning på tøris. Opbevar det OCT-indlejrede væv ved -80 °C.
    BEMÆRK: Tidligere undersøgelser har vist, at stivhedsværdierne er ens mellem frosset og frisk væv25,26.
  2. Sektion 30 μm tykke leversektioner på positivt ladede dias ved hjælp af et kryotomat og opbevares diasene ved -80 ° C indtil dagen for AFM-måling ikke mere end 2 uger derefter.

2. Oprettelse af instrumentet

  1. Fastgørelse af en 5,7 μm perle til AFM cantilever tip (supplerende figur S1, trin 1-5)
    BEMÆRK: Tilbehøret af perlen til cantilever blev også tidligere beskrevet af Norman et al.46.
    1. Suspensionen af melaminharpiksperler med en diameter på 5,7 μm fordeles jævnt på halvdelen af arealet af et glasglas og lufttørres for at fordampe opløsningsmidlet (supplerende figur S1, trin 1).
    2. På den anden halvdel af diaset, ved hjælp af en 10 μL spids, laves en tynd linje af forblandet epoxyharpiks med lang arbejdstid (supplerende figur S1, trin 1).
    3. Læg cantileversonden på AFM-hovedet i henhold til producentens anvisninger.
    4. Monter rutsjebanen og dækslet med AFM-hovedet udstyret med udkragningssonden.
      BEMÆRK: En SD-qp-BioT-TL-10 cantilever blev brugt i undersøgelsen.
    5. Bring den forblandede epoxyharpikslim til midten af diaset, og gå hen til limen med udkragningen med en lav kraft (indstil et sætpunkt til 1 V for at følge denne protokol; Supplerende figur S1, trin 2).
      BEMÆRK: Før du nærmer dig glidefladen, skal du sikre dig, at laseren er justeret i midten af udkragningsspidsen, angivet med en høj sumspænding ved at følge trin 6-8 i afsnit 2, del 3, Kalibrering af fjederkonstanten i AFM-udkragningen.
    6. Når spidsen af cantileversonden kommer i kontakt med limen, skal du flytte den lige over diaset for at fjerne overskydende lim.
    7. Træk nu udkragningsspidsen tilbage fra diaset, og flyt diaset for at bringe en enkelt perle i midten (supplerende figur S1, trin 3). Gå ind til perlen igen med AFM-cantileversonden med en højere kraft (sætpunkt 2 V) for at fastgøre perlen i midten af cantileversonden og lad den stå i mindst 10 s (supplerende figur S1, trin 4).
    8. Uddrag cantileversonden og hold den natten over ved stuetemperatur for at hærde limen eller følg instruktionerne for epoxyharpiksen (supplerende figur S1, trin 5).
  2. Opsætning af polarisator og analysator
    1. For at lokalisere interesseområderne inden for leverafsnittene skal du oprette mikroskopet med polarisatoren og analysatoren. Juster deres vibrationsazimuter i en vinkel mellem 0° og 90° i forhold til hinanden ved at rotere en af dem i forhold til den anden manuelt eller på en automatiseret måde for at minimere transmitteret lys og maksimere ekstraordinære stråler, der passerer gennem målet. Sørg for, at kollagenfibrene ser lyse ud mod en mørk baggrund i det polariserede billede (figur 2), hvilket afspejles af et skift i toppen af billedhistogrammet mod lyse pixels.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative mikroskopibilleder viser udtalt visualisering af kollagenfibre i polariseret mikroskopi sammenlignet med brightfield-billeder. Leverafsnit fra mus behandlet medCCl 4 i 3 uger blev udsat for (A) brightfield og (B) polariseret mikroskopi. Birefringent kollagenfibre er tydeligt synlige i hvidt i polariserede billeder sammenlignet med brightfield-billeder. Den røde boks repræsenterer kollagenrigt område, der bruges til AFM-målingen. Indsatser viser zoomede visninger af området i den røde boks. Skala bar = 100 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl 4 = tetrachlormethan; CV = central vene; PV = portal vene. Klik her for at se en større version af denne figur.

BEMÆRK: Til denne protokol kan AFM-hovedet installeres på ethvert egnet omvendt mikroskop med mulighed for at indsætte en polarisator og en analysator. Systemet skal placeres i en isolationsenhed for at reducere baggrundsstøjen.

  1. Kalibrering af fjederkonstanten i AFM-udkragningen
    1. Læg cantileversonden (forberedt i henhold til trin 1-8 i afsnit 2, del 1, fastgørelse af en 5,7 μm perle til AFM-udkragningsspidsen) på AFM-hovedet i henhold til producentens anvisninger.
    2. Rengør udkragningen med 70% ethanol for at forhindre forurening af udkragningen under målingen. Vask grundigt med destilleret vand for at fjerne resterende ethanol fra spidsen.
    3. Aktivér kontakttilstand , og vælg krafttilknytning som målemetode.
    4. Åbn alle de relevante vinduer (Z Stepper Motors, Motorized Stage Control, Data Viewer, Force Scan Map Oscilloscope, Laser Alignment og Camera window) i softwarefanerne ved at klikke på de tilsvarende knapper.
    5. Monter et rent glasglas indeholdende 1,2 ml 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) i et område på ca. 2 cm x 4 cm afgrænset med en hydrofob markørpen. Monter AFM-hovedet på mikroskoptrinnet, og sørg for, at udkragningen er helt nedsænket i PBS.
    6. Fokuser målet på udkragningsspidsen. Reducer intensiteten af transmitteret lys på mikroskopet for at få et bedre overblik over laserpositionen på skærmen.
    7. Ret laseren mod den gennemskinnelige ende af udkragningen (hvorunder den sfæriske perle er fastgjort), og juster spejlet ved hjælp af knapperne på AFM-hovedet for at maksimere laserstrålens samlede intensitet på detektoren (afbildet af summen i laserjusteringsvinduet ).
    8. Juster fotodiodedetektoren ved hjælp af knapperne på AFM-hovedet for at placere laseren i midten.
    9. Lad udkragningen stabilisere sig i 15 minutter, før du fortsætter med kalibreringen.
    10. Åbn kalibreringsstyringen , og indsæt typen af udkragning, udkragningsdimensioner og miljøforhold. Kalibrer fjederkonstanten og følsomheden (også kendt som invers optisk håndtagsfølsomhed, InvOLS) ved at klikke på Kalibrer. Bekræft nøjagtigheden af fjederkonstanten opnået efter kalibrering med producentens erklæring. Kalibrer udkragningen i kontaktfri tilstand (kalibrering udføres af softwaren ved hjælp af termisk sætning afledt af Sader et al.58).
      BEMÆRK: Udkragningsfjederkonstanten repræsenterer cantileverens stivhed og er givet ved cantileverens modstandskraft, når den deformeres pr. deformationslængde i form af N/m. Cantileverens følsomhed viser værdien af fotodioderespons (i volt) som reaktion på udbøjningen af cantileveren (i nanometer) og præsenteres normalt i form af nm / V59. I en kontaktfri tilstand registreres det termiske støjspektrum og udstyres automatisk med den hydrodynamiske funktion60 af AFM-styringssoftwaren efter kalibrering. Beslaget tilvejebringer kalibreringsparametrene, nemlig fjederkonstanten og InvOLS. Fjederkonstanten for SD-qp-BioT-TL-10 cantilever, der blev anvendt i denne undersøgelse, var 0,09 N / m, som angivet af producenten.

3. Forberedelse af prøver II

  1. Optøning af de frosne sektioner (opbevares ved -80 °C, som beskrevet i afsnit 1, Prøveforberedelse I) ved stuetemperatur i 2 min.
  2. Fastgør sektionerne med iskold 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 10 minutter ved 4 °C efterfulgt af omfattende vask (5x) med 1x PBS. Tør resterende PBS rundt om sektionen med et væv og marker en grænse på ca. 2 cm x 4 cm omkring leversektionen med en hydrofob markørpen. Dæk prøven med 1x PBS (sørg for, at det afgrænsede område indeholder ~1,2 ml 1x PBS). Brug prøven til AFM-målinger.
    OBS: Da PFA er et farligt kemikalie, skal det håndteres med forsigtighed for at forhindre kontakt med hud eller øjne. For at undgå giftige dampe skal alle procedurer, der involverer PFA, udføres i en certificeret kemisk røghætte eller et andet godkendt ventileret område.

4. Måling

  1. Aktivér autosave ved at gå til fanen Opsætning og sætte et kryds ved Autosave. Angiv filnavnet og mappen til lagring af målefilerne ved at gå til fanen Opsætning og derefter klikke på Gem indstillinger.
  2. Prøven indlæses (fremstillet i henhold til afsnit 3, Prøveforberedelse II). Gå til vævsoverfladen med AFM-udkragningen ved at tænde laseren og klikke på Approach-tasten . Når spidsen er i kontakt med vævsoverfladen, skal du trække udkragningsspidsen tilbage, så spidsen forbliver i fokus for målet (ved at klikke på tilbagetrækningstasten , som trækker udkragningen tilbage til den øverste ende af piezoområdet). Juster detektoren igen, hvis laserpositionen flyttes væk fra dens centrum i vinduet Laserjustering .
  3. Sluk for laseren , og overlejr mikroskopets optiske felt med AFM-målekort ved at klikke på fanen Tilbehør og derefter vælge Optisk kalibrering af direkte overlejring. I det efterfølgende vindue skal du klikke på Næste for at tage en række billeder af cantileveren, der scanner et bestemt område. Klik på Næste igen for at gå til det næste vindue.
  4. På det første billede skal du klikke på midten af spidsen af cantilever manuelt for at skildre tippositionen i softwaren. Cirklen, der viser spidspositionen, kan manipuleres i størrelse ved at angive dens radius for at øge nøjagtigheden. Klik på Kalibrer for automatisk at registrere udkragningsspidspositionen i alle billeder. Bekræft nøjagtigheden af tipdetektion ved at gennemgå billederne.
  5. Klik på Næste og derefter på Udfør for at afslutte den optiske overlejring og gemme den række billeder, der er taget under optisk kalibrering.
  6. Træk udkragningen yderligere tilbage for at undgå kollision med højere overflader på rutsjebanen. Flyt scenen for at placere et kollagenrigt område inde i den grønne boks, der er synlig under fanen Datafremviser , ved hjælp af det polariserede billede. Vælg det kollagenrige område ved at lave et rektangel omkring det ved hjælp af et langt tryk på venstre museknap inde i den angivne grønne boks. Definer dimensioner, retning og opløsning for det valgte område under fanen Gitter i venstre side. Klik på Bekræft nyt scanningsområde for at indstille det valgte område som måleområde.
  7. Hold IGain- og PGain-parametrene for feedback-loop-at-standardværdierne, hvis der ikke præsenteres større ustabiliteter i form af systemoverfølsomhed. For at følge denne protokol skal du indstille IGain til 50 Hz og PGain til 0,001.
  8. Indstil sætpunktet til 1 nN.
    BEMÆRK: Setpoint er kraften i tip-overflade-interaktionen under stationær tilstand. For de fleste bløde prøver (celler, geler og væv) er sætpunktværdier i området 0,5-2,0 nN passende.
  9. Vælg den relative setpunktværdi i henhold til det studerede materiales mekaniske egenskaber og cantileverens stivhed. For denne protokol skal du indstille værdien til 5 nN.
    BEMÆRK: Det relative sætpunkt repræsenterer den maksimale interaktionskraft, når toppen af kraftafstandskurven er nået, og spidsbevægelsen vender tilbage til basislinjen. For bløde materialer (1-50 kPa) indstilles denne parameter i enheder af nanonewtoner (nN). For en blød cantilever (med en fjederkonstant fra 0,05 N / m til 0,35 N / m) er den maksimale kraft, der kan påføres, ca. 50 nN. Juster sætpunktsværdierne og de relative sætpunktværdier i overensstemmelse hermed.
    1. Sørg for, at den givne sætpunktsværdi ikke fører til en indrykningsdybde, der er større end radius af den sfæriske indenter, ellers kan indrykningsoverfladen ikke defineres korrekt i beregningen af Youngs modul. Beregn gennemsnitsværdien af indrykningsdybden efter den første kørsel af indrykningerne; se afsnit 5, Dataanalyse, for at lære, hvordan man behandler de registrerede data. Juster sætpunktsværdien , hvis det er nødvendigt.
  10. Indstil Juster grundlinje som 5.
    BEMÆRK: Her henviser baseline til graden af polynomium, der bruges til at tilpasse tilgangen og trække kurver tilbage. Indstilling af basislinjen til 5 passer kurverne til høj opløsning og sikrer således optagelse af baggrundsstøj under målinger.
  11. Vælg længden af udkragningsbevægelsen i Z-aksen (Z-længden) i henhold til prøvens overfladetopografi. For at følge denne protokol skal du indstille Z-længden til 15 μm.
    BEMÆRK: En høj værdi (f.eks. 15 μm) reducerer målefølsomheden, men er normalt påkrævet for prøver med en meget uregelmæssig overflade, såsom fibrotisk levervæv.
  12. Indstil Z-bevægelse til Konstant varighed.
    BEMÆRK: Z-bevægelse kan også indstilles til Konstant hastighed for at se data, der henviser til Z-bevægelse (Forlæng hastighed og Forlæng tid) i en anden tilstand.
  13. Indstil Forlæng tiden til 1 s. Indstil udvidelsesforsinkelse og tilbagetrækningsforsinkelse som 0.
    BEMÆRK: Brug forlængelseshastigheder på >5,0 μm/s til meget bløde materialer61, da lavere indrykningshastigheder vil resultere i en mere tyktflydende og mindre elastisk respons fra bløde overflader. Forlængelsesforsinkelse og tilbagetrækningsforsinkelse er parametre, der kan bruges til at studere specifik interaktion mellem cantileverspidsen og substratet (f.eks. interaktioner mellem et protein, der er immobiliseret på overfladen af udkragningen med proteiner immobiliseret på glidefladen).
  14. Indstil samplingshastighed som 5000 Hz.
    BEMÆRK: Prøvehastigheden refererer til hyppigheden af punkter, der registreres på en komplet tilgangs-tilbagetrækningskurve. Indstil dette til en høj værdi (f.eks. 5000 Hz) for at undgå at gå glip af visse områder af kurverne på grund af deres ekstremt hurtige overgang.
  15. Marker Z Closed Loop med et Tick for at muliggøre et feedback loop-system, der sikrer konstant afstand mellem prøveoverfladen og cantileverspidsen.
  16. Frakobl det motoriserede trin ved at fravælge Engage og Click on Approach for at nærme sig prøven med cantileveren. Klik på Start scanning for at begynde at indsamle kraftdistancekurver i det område, der er indstillet i trin 6; Afsnit 4, Måling.

5. Dataanalyse

  1. Analyser de erhvervede data ved hjælp af open source-softwaren "AtomicJ" (som kan downloades fra https://sourceforge.net/projects/jrobust/).
    BEMÆRK: Det understøtter filer indsamlet fra Agilent Technologies, JPK Instruments eller Bruker atomkraftmikroskoper.
  2. Indlæs kraftkurverne i programmet ved at klikke på proceskraftkurverne og kortikonet i AtomicJ (Supplerende figur S2A, x). I behandlingsassistenten skal du tilføje de kort, der skal analyseres, ved at klikke på knappen Tilføj (supplerende figur S2A, y). Klik på Næste , når kortene er indlæst (supplerende figur S2A, z).
  3. Angiv behandlingsindstillingerne i det næste vindue i henhold til nedenstående trin (svarende til trinene i supplerende figur S2B, trin 1-11):
    1. Anslå kontaktpunktet mellem prøven og udkragningen manuelt ved beregning eller automatisk ved hjælp af et sæt passende kurveparametre. For at følge denne protokol skal du bruge kontaktpunktets automatiske estimering.
    2. Bestem kontaktpunktet mellem udkragningen og prøven ved hjælp af den klassiske fokuserede gittermetode.
    3. Vælg estimeringsmetoden for at give den bedste bestemmelse af kontaktpunktet baseret på kvaliteten af de målte kraftkurver, som skal bestemmes empirisk under optimeringen af dataanalysen. For at følge denne protokol skal du bruge den uafhængige modelmetode.
    4. Tilpas kraftindrykningskurven ved hjælp af en klassisk model (brug klassisk L2 til modeltilpasning for at følge denne protokol).
      BEMÆRK: Model fit og Contact estimator er parametre, der styrer, hvordan kurverne er monteret af softwaren, og hvordan kontaktpunktet er etableret i henholdsvis den monterede kurve. Til disse målinger blev den klassiske indstilling brugt, som bruger mindste kvadraters regression. Dette behandler hvert lavkraftpunkt på kurven som et forsøgskontaktpunkt og passer et polynom til regionen før forsøgskontaktpunktet. Det passer derefter til den relevante kontaktmodel til de indsamlede kraftindrykningsdata. Det punkt, der giver den laveste sum af kvadrater, antages som kontaktpunktet. Andre metoder kan anvendes baseret på kvaliteten af kraftkurver opnået62,63.
    5. Indstil modellens pasform til tilbagetrækningskurven .
    6. Indstil Poissons forhold til 0,45, som anbefalet til blødt væv som lever24.
    7. Indstil kurvens pasform ved hjælp af en basisgrad på 3 og en kontaktgrad på 1. Ændre graden af polynomisk pasform baseret på skalaen af afvigelser af kurverne fra modellen.
    8. Vælg den model, der skal passe til udtagningskurverne. Brug Sneddon-modellen , som beregner Youngs modul baseret på ligning (1) og ligning (2):
      Equation 1(1)
      δ = Equation 2 (2)
      hvor F er kraft, E er Youngs modul, v er prøvens Poissons forhold, δ er dybden af indrykning, a er kontaktradius, og R er kugleradius62,63.
    9. Udfyld radius af den sfæriske spids i mikrometer (2,9 μm i denne protokol).
    10. Indlæs fjederkonstanten og InvOLS fra datafilerne ved at aktivere indlæsning (marker afkrydsningsfelterne).
    11. Klik på Udfør.
      BEMÆRK: De analyserede data præsenteres i form af kort over lodret afbøjning, højde, vedhæftning, kontaktkraft, deformation, vedhæftningskraft, R2-værdier , hældning, Youngs modul, overgangsindrykning, overgangskraft og kontaktposition beregnet for hver kraftkurve (supplerende figur S3, øverst til venstre). To ekstra vinduer viser kraftkurver og råværdier (supplerende figur S3, henholdsvis øverste højre og nederste panel).
  4. Ekskluder kraftkurver, hvor udkragningen nærmede sig overfladen af leversektionen forkert. For at identificere disse skal du kigge efter kurver med høj støj, afvigende former og / eller ufuldstændig tilgang, som vist i figur 3 og diskuteret detaljeret andetsteds46.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på repræsentative kraftforskydningskurver. (A,B) Repræsentative fortolkelige kraftkurver for stivere (A; E = 10,5 kPa) og blødere (B; E = 1,78 kPa) områder, der er egnede til analyse. (C-F) Repræsentative ufortolkelige grafer, der skal udelukkes fra analysen på grund af (C-E) forkert tilgang eller (F) højere støj. Som angivet i forklaringen i (A) viser røde kurver udkragningens tilgang, og grønne kurver viser udkragningens tilbagetrækning. Sorte linjer viser tilpasningen af udkragningskurven for udkragningen. Hældningen af de sorte linjer svarer til Youngs modul. De røde og blå punkter svarer til henholdsvis kontaktpunktet og overgangspunktet. Kontaktpunktet er det sidste kontaktpunkt mellem udkragningen og substratet under tilbagetrækning, mens overgangspunktet beskriver udkragningspunktets overgang fra tilgang til tilbagetrækning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Mildt faste, 30 μm tykke leversektioner opnået fra kontrolmus og fra mus med mild eller fremskreden fibrose (induceret ved injektion afCCl 4 i henholdsvis 3 uger eller 6 uger49) blev undersøgt med AFM som beskrevet i denne protokol. Kollagenfibre tæt på centrale vener blev valgt til måling af stivhedskort. Områder tæt på de centrale vener, som svarer til de områder, hvor kollagenfibre i CCl4-behandlede dyr normalt dannes, blev analyseret i kontrollever (figur 4A). Fordelingen af Youngs moduli var reproducerbar på tværs af forskellige kontrollever og kollagenrige områder inden for en enkelt leversektion (figur 4B: venstre violinplot).

I CCl 4-behandlede dyr viste stivhedskort svarende til de pericentrale områder af kollagenaflejringer signifikant højere værdier af Youngs moduli sammenlignet med tilsvarende områder i kontrolmus (figur 4B: 1,9 kPa vs. 2,6 kPa median Youngs modulværdier for kontrol vs. 3 ugers CCl 4-behandlet mus; p = 0,07; 1,9 kPa vs. 5,1 kPa median Youngs modulværdier for kontrol vs. 6 uger CCl 4 -behandlet mus; p = 0,02). Desuden var der en signifikant stigning i værdierne af Youngs moduli med længere CCl 4-behandling (figur 4B; 2,6 kPa vs. 5,1 kPa median Youngs modulværdier for 3 uger vs. 6 ugers CCl4-behandlet mus; p = 0,04). Dette viser en gradvis afstivning af kollagenaflejringer med fibroseprogression, og at AFM-målinger afspejler fibrogenesen.

For at evaluere effekten af langvarig opbevaring af OCT-indlejrede leverafsnit på kollagenfibrenes mekaniske egenskaber målte vi stivheden af kollagenfibre i sektioner af CCl4-behandlede mus, som blev opbevaret ved -80 ° C i 2 uger eller 3 måneder på diaset efter skæring (figur 5). AFM-målinger viste signifikant lavere værdier af Youngs moduli i kollagenrige områder for sektioner opbevaret i 3 måneder sammenlignet med dem, der blev opnået fra sektioner målt inden for 2 uger efter prøvesektionering (figur 5; 4,7 kPa vs. 3,6 kPa median Youngs modulværdier i 2 uger vs. 3 måneders opbevaring; p < 0,001). Det er således vigtigt at måle levervævets mekaniske egenskaber kort efter, at sektionerne er fremstillet ud fra de OCT-indlejrede leverlober.

Figure 4
Figur 4: AFM-målinger afslører progressiv afstivning af kollagenrige områder, der korrelerer med langvarigCCl 4-behandling. (A) Leverafsnit fra kontrolmus og mus behandlet medCCl 4 i 3 uger eller 6 uger blev brugt til at måle de mekaniske egenskaber i kollagenrige områder. De boksede områder af leverafsnittene, der vises på de polariserede mikroskopibilleder (til venstre), er kollagenrige scanningsområder (eller tilsvarende områder i kontrolleveren) valgt til AFM-målinger (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Youngs modulkort med farveskalaer svarende til disse boksområder er vist til højre, inklusive histogrammer af Youngs modulværdier fra disse kort; indsatte spredningsdiagrammer viser værdier >10 kPa for hver betingelse. Afstivningen af leveren visualiseres som et gradvist højregående skift i histogrammefordelingen og en højere frekvens af punkter i det indsatte spredningsplot. Skalabjælke = 20 μm. (B) Violindiagrammer viser fordelingen af elastiske moduler fra tre områder målt for hver tilstand (venstre) og opsummerede elastiske moduliværdier fra alle tre kort (højre). Violinplots viser medianen (rød linje), 25. percentil og 75. percentil (sorte linjer); Prikker repræsenterer middelværdierne for individuelle kort fra område 1-3. De præsenterede p-værdier blev beregnet ved hjælp af en elevs t-test udført på midler. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl 4 = tetrachlormethan. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Udvidet opbevaring af leverafsnit fører til et fald i stivhed af kollagenrige områder. Leverafsnit (fremstillet af mus behandlet medCCl 4 i 2 uger) opbevaret ved -80 °C i 2 uger eller 3 måneder blev brugt til at måle Youngs modul. Polariserede mikroskopibilleder (til venstre) med kasser, der angiver de kollagenrige områder, der bruges til AFM-måling (30 μm x 100 μm, 10 pixels x 36 pixels). Tilsvarende Youngs modulkort med farveskalaer (til højre). Histogrammer viser Youngs modulværdier indsamlet fra 4-6 områder i hver prøve; indsatte punktgrafer viser værdier >10 kPa for hver betingelse. Skala bar = 20 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; CCl 4 = tetrachlormethan. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Metode til ændring af cantileveren med en melaminharpiks mikroperle. (A) Tegnet skematisk illustrerer fastgørelsen af en sfærisk perle til spidsen af udkraanden. For en trinvis beskrivelse, se afsnit 2, del 1, Fastgørelse af en 5,7 μm perle til AFM cantilever tip. (B) Mikroskopibillede af en sfærisk 5,7 μm perle fastgjort til udkragningsspidsen vist fra toppen (venstre) og siden (højre). Skala søjler = 20 μm. Forkortelser: AFM = atomkraftmikroskopi; RT = stuetemperatur. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Dataanalyse i AtomicJ. (A) Rækkefølgen af trin, der skal følges for at åbne stivhedskort i AtomicJ. Et enkelt venstreklik på proceskraftkurverne og kortene (x) åbner behandlingsassistenten. Filer kan indlæses i behandlingsassistenten ved at klikke på tilføj (y) og vælge de ønskede filer. Klik på næste (z) for at gå videre til næste trin. (B) Parametre til kurvetilpasning, passende kontaktmekanikmodel og AFM-indstillinger, der anvendes under måling. Trin 1-11 henviser til tilsvarende underpunkter, der er beskrevet i protokoltrin 3, afsnit 5, Dataanalyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Oversigt over analyserede data i AtomicJ. Forhåndsvisningen af analyserede data viser stivhedskort (øverste venstre vindue), kraftkurver (øverste højre vindue) og rådata (nederste vindue). Forkortelse: AFM = atomkraftmikroskopi. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den præsenterede protokol giver en trinvis reproducerbar metode til AFM-måling af normalt og fibrotisk muselevervæv. Koblet polarisationsmikroskopi giver høj rumlig præcision og muliggør visualisering af kollagenfibre på grund af deres birefringens. Endvidere gives en detaljeret beskrivelse af analysen af de opnåede kraftkurver. AFM stivhedsmåling kan udføres på celleniveau, hvilket gør det muligt at overvåge lokale ændringer i levervævets mekaniske egenskaber på grund af udvikling af fibrotisk sygdom. Leverfibrose er ikke en homogen proces, der påvirker hele organet. Tværtimod er områder med kollagenrig fibrotisk septa blandet med områder med lave eller ingen kollagenaflejringer. Stivhedsændringer er således specifikke for det lokale mikromiljø og påvirker kun celler lokalt i kontakt med områder, der er beskadiget af skade. Denne mikroskala af stivhed heterogenitet er også tydelig i detaljerne i AFM Youngs modulkort, hvor punkter med høj stivhed grænser op til områder med næsten normal stivhed. Denne variation viser, at selv kollagen arvævsområde ikke er mekanisk homogent og kræver, at AFM-måling karakteriseres på celleniveau (figur 4).

Den præsenterede protokol tillader målinger af leverstivhed ved AFM uafhængigt af leveropsamlingen, da hele leverloberne indlejret i OCT kan opbevares i en længere periode ved -80 ° C. Når vævet er sektioneret, anbefaler vi imidlertid at måle prøverne inden for ~ 2 uger, da vi har observeret en gradvis blødgøring af vævssektioner, der opbevares i længere perioder (figur 5).

AFM udstyret med polarisationsmikroskopi giver mulighed for præcist at lokalisere interesseområdet inden for leverlobulestrukturen. Det har dog også nogle begrænsninger, der skal overvejes, når resultaterne fortolkes. De stivhedsværdier, der blev opnået her, blev målt ved stuetemperatur. Vi antager, at temperaturens virkninger på blødt vævs mekaniske egenskaber vil være små; Dette kan dog være en af grundene til forskelle mellem de rapporterede in vivo-værdier af mekaniske egenskaber af levervæv og værdierne i denne undersøgelse.

Desuden tillader denne protokol AFM-analyse af levervæv i op til 3 timer, hvilket kræver mild fiksering af vævet. Den milde fiksering af vævssektioner såvel som fryse-optøningscyklussen vil sandsynligvis påvirke de absolutte værdier af Youngs modul. Således kan de rapporterede værdier af Youngs moduli afvige fra in vivo-værdier . Yderligere undersøgelser er nødvendige for at optimere protokollen til måling af absolutte værdier af Youngs modul fra leverafsnit, hvilket kan opnås ved en anden metode til fiksering af levervæv64.

Ikke desto mindre observerede vi stigende stivhed af kollagenrige områder i leveren hos mus behandlet medCCl 4 i 3 uger sammenlignet med 6 uger. Sådanne ændringer svarer til fibroseprogression under langvarig skade (figur 4) og viser, at relative forskelle kan undersøges mellem forskellige behandlinger ved hjælp af den præsenterede protokol. Dette er i overensstemmelse med observationerne fra Calò et al., der viste, at mildt faste leverafsnit viser lignende forskelle i stivhedsværdier mellem kollagenrige og kollagen-manglende områder som i frisk væv25.

Vi brugte SD-qp-BioT-TL-10 cantilever (teoretisk fjederkonstant ~ 0,09 N / m) modificeret med en sfærisk spids på 5,7 μm diameter for at minimere mekanisk forstyrrelse af levervævet under målinger. En perle på 5,7 μm gjorde det muligt at foretage tilstrækkelig indrykning af prøven til at undersøge dens stivhed og samtidig bevare dens integritet. En perle med en mindre diameter kan efter flere optimeringer bruges til at opnå højere opløsning i stivhedskortene, men kan føre til yderligere overvurdering af Youngs modulværdier (for flere detaljer, se Crichton et al.65). Ved hjælp af det specificerede cantilever-perle ensemble var vi i stand til at karakterisere prøvestivhed i et bredt område, fra snesevis af enheder af Pa til ~ 100 kPa.

Sneddons model blev brugt til at udlede Youngs modul fra kraftkurver, da den tillader analyse af dybe fordybninger med kolloide sonder62. Sneddons model lider i modsætning til Hertz's model ikke af den begrænsning, at kontaktradius skal være meget mindre end kugleradius. Det antages endvidere, at prøvetykkelsen er flere gange større end indrykningsdybden 30,66. I denne undersøgelse var fordybningen ~ 2 μm med en perlestørrelse på 5,7 μm og en prøvetykkelse på 30 μm i kollagenrige områder; således var Sneddons model passende. Andre modeller63 i betragtning af vedhæftningskraften mellem spids og substrat kan bruges til forskellige typer væv.

Analyse i AtomicJ implementerer korrektioner for prøvernes endelige tykkelse for at minimere bidraget fra et substrat, mens Youngs modul62,67 udledes. I analysen af de opnåede kraftkurver brugte vi et enkelt Poissons forhold på 0,45, som tidligere er blevet anbefalet til bløddelsorganer24. Denne tilnærmelse har ingen signifikant effekt på beregnede værdier af Youngs modul, da ændringen i værdien af Poissons forhold fra 0,4 til 0,5 kun resulterer i et fald på 0,893x i Youngs modulværdier beregnet i henhold til Sneddons ligning. I betragtning af de multifoldige forskelle i Youngs modul mellem de forskellige varigheder afCCl 4-behandlinger er de fejl, der produceres ved at tilnærme Poissons forhold, kun marginale.

Vi brugte tilbagetrækningskurve til at beregne stivhedsværdier, da vi var interesserede i vævets elastiske respons på belastningen fra cantileveren snarere end i plastresponsen på indrykning68. På grund af det bløde vævs viskoelastiske respons kan passende tilbagetrækningskurver overvurdere Youngs modul, hvilket man bør huske på. Desuden har vi observeret, at dataanalyse med tilgangskurve giver lignende tendenser i stivhedsværdier mellem fibrotiske og kontrolområder, selvom de absolutte værdier er tilsvarende lavere (data ikke vist).

Mens vi optimerede protokollen, identificerede vi flere trin, der var kritiske for målingernes reproducerbarhed. For det første er det vigtigt at sikre, at perlen er omtrent i midten af den gennemskinnelige spids, mens den fastgøres til cantileveren. Dette forhindrer mulig mekanisk ubalance under indrykning. For det andet er det under leverfiksering med PFA nødvendigt nøje at følge tidsfristerne for optøning og fiksering. Ændring af tidspunktet for dette trin kan alvorligt påvirke de mekaniske egenskaber ved vævssektioner. For det tredje skal udkragningen kalibreres gentagne gange med kontinuerlig overvågning og input af samtidige temperaturværdier for at undgå, at artefakter forekommer i stivhedsværdier på grund af temperaturudsving. Endelig bør et enkelt leversnit ikke måles i mere end 3 timer fra præparatet, da overlejret PBS kan fordampe over længere perioder. Læsere kan henvise til fejlfindingstabellen (tabel 3) til løsning af problemer, der opstår under AFM-målingen, som også diskuteres udførligt i Norman et al.46.

Tabel 3: Fejlfindingsvejledning. Klik her for at downloade denne tabel.

Den præsenterede protokol giver mulighed for reproducerbar AFM-sondering af levervæv. Det har potentialet til at afsløre information om udvikling og eventuel regression af fibrotisk leversygdom på mikroskopisk niveau og kan bidrage til udviklingen af terapier rettet mod fibrotiske arregioner dannet under progressionen af kronisk leversygdom.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Den Tjekkiske Republiks tilskudsagentur (18-02699S), det institutionelle forskningsprojekt fra det tjekkiske videnskabsakademi (RVO 68378050) og MEYS CR-projektet NICR EXCELES (LX22NPO05102). CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU-konsortium, finansieret af MEYS CR-infrastrukturprojekt LM2018127 og European Regional Development Fund-Project "UP CIISB" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) støttede målingerne på CF Nanobiotechnology, CEITEC MU. Vi anerkender også Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tjekkiet, støttet af MEYS (LM2018129, CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) og RVO: 68378050-KAV-NPUI, for deres støtte med mikroskopibilleddannelsen, der præsenteres heri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM head Bruker JPK nanowizard 3
Cameras Andor Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled)
The Imagingsource  S/N:12310015
Cantilever SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors S/N:73750F05
Cryotome Leica  CM1950
Epoxy resin glue (Long working time ) Bison epoxy universal
Melamine beads; diameter, 5.7 um Microparticles, GmbH MF-R-5.7
Microscope Olympus  IX81
Hydrophobic  slide marker SuperHT PAP PEN
Software JPK nanowizard  v6.1.151
AtomicJ v2.3.1
Superfrost slides Thermoscientific ref no. J1800AMNZ
System Ubuntu 14.04.5 LTS
Vibration isolation control unit Tablestable AVI-200-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vanden Berghe, G. The role of the liver in metabolic homeostasis: Implications for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Dis. 14 (4), 407-420 (1991).
  2. Stanger, B. Z. Cellular homeostasis and repair in the mammalian liver. Annual Reviews of Physiology. 77, 179-200 (2015).
  3. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annual Review of Pathology. 6, 425-456 (2011).
  5. Georges, P. C., et al. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: Implications for fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (6), 1147-1154 (2007).
  6. Perepelyuk, M., et al. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (6), 605-614 (2013).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (5), 1394-1400 (2008).
  8. Olsen, A. L., et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (1), 110-118 (2011).
  9. Sandrin, L., et al. Transient elastography: A new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (12), 1705-1713 (2003).
  10. Ling, W., et al. Effects of vascularity and differentiation of hepatocellular carcinoma on tumor and liver stiffness: In vivo and in vitro studies. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (4), 739-746 (2014).
  11. Wong, V. W. S., et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51 (2), 454-462 (2010).
  12. Cha, S. W., et al. Nondiseased liver stiffness measured by shearwave elastography a pilot study. Journal of Ultrasound in Medicine. 33 (1), 53-60 (2014).
  13. Castera, L., Forns, X., Alberti, A. Non-invasive evaluation of liver fibrosis using transient elastography. Journal of Hepatology. 48 (5), 835-847 (2008).
  14. Chang, W., et al. Liver fibrosis staging with MR elastography: Comparison of diagnostic performance between patients with chronic hepatitis B and those with other etiologic causes. Radiology. 280 (1), 88-97 (2016).
  15. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Clinical applications. Journal of Computer Assisted Tomography. 37 (6), 887-896 (2013).
  16. Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Technique, analysis and clinical applications. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (3), 544-555 (2013).
  17. Venkatesh, S. K., Wang, G., Teo, L. L. S., Ang, B. W. L. Magnetic resonance elastography of liver in healthy Asians: Normal liver stiffness quantification and reproducibility assessment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 1-8 (2014).
  18. Lee, D. H., Lee, J. M., Han, J. K., Choi, B. I. MR elastography of healthy liver parenchyma: Normal value and reliability of the liver stiffness value measurement. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 38 (5), 1215-1223 (2013).
  19. Mueller, S. Liver stiffness: A novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine. Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
  20. Goodman, Z. D. Grading and staging systems for inflammation and fibrosis in chronic liver diseases. Journal of Hepatology. 47 (4), 598-607 (2007).
  21. Salameh, N., et al. Hepatic viscoelastic parameters measured with MR elastography: Correlations with quantitative analysis of liver fibrosis in the rat. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 26 (4), 956-962 (2007).
  22. Yin, M., et al. Quantitative assessment of hepatic fibrosis in an animal model with magnetic resonance elastography. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (2), 346-353 (2007).
  23. Bastard, C., et al. Transient micro-elastography: A novel non-invasive approach to measure liver stiffness in mice. World Journal of Gastroenterology. 17 (8), 968-975 (2011).
  24. Barnes, S. L., Lyshchik, A., Washington, M. K., Gore, J. C., Miga, M. I. Development of a mechanical testing assay for fibrotic murine liver. Medical Physics. 34 (11), 4439-4450 (2007).
  25. Calò, A., et al. Spatial mapping of the collagen distribution in human and mouse tissues by force volume atomic force microscopy. Scientific Reports. 10, 15664 (2020).
  26. Desai, S. S., et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology. 64 (1), 261-275 (2016).
  27. Kostallari, E., et al. Stiffness is associated with hepatic stellate cell heterogeneity during liver fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 322 (2), 234-246 (2022).
  28. Binnig, G., Qaute, C. F., Gerber, C. Atomic force microscope. Physical Review Letters. 56 (9), (1986).
  29. Johnson, K. L. Contact Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1985).
  30. Asgari, M., Latifi, N., Giovanniello, F., Espinosa, H. D., Amabili, M. Revealing layer-specific ultrastructure and nanomechanics of fibrillar collagen in human aorta via atomic force microscopy testing: Implications on tissue mechanics at macroscopic scale. Advanced NanoBiomed Research. 2 (5), 2100159 (2022).
  31. Amabili, M., et al. Microstructural and mechanical characterization of the layers of human descending thoracic aortas. Acta Biomaterialia. 134, 401-421 (2021).
  32. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: Effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomaterialia. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  33. Geerligs, M., et al. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. 44 (6), 1176-1181 (2011).
  34. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
  35. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  36. Babu, P. K. V., Radmacher, M. Mechanics of brain tissues studied by atomic force microscopy: A perspective. Frontiers in Neuroscience. 13, 600 (2019).
  37. del Mar Vivanco, M. Mammary Stem Cells: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
  38. Zanetti-Dällenbach, R., et al. Length scale matters: Real-time elastography versus nanomechanical profiling by atomic force microscopy for the diagnosis of breast lesions. Biomed Research International. 2018, 3840597 (2018).
  39. Lopez, J. I., Kang, I., You, W. -K., McDonald, D. M., Weaver, V. M. In situ force mapping of mammary gland transformation. Integrative Biology. 3 (9), 910-921 (2011).
  40. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnol. 4 (3), 186-192 (2009).
  41. Borin, D., Pecorari, I., Pena, B., Sbaizero, O. Novel insights into cardiomyocytes provided by atomic force microscopy. Seminars in Cell & Developmental Biology. 73, 4-12 (2018).
  42. Lachaize, V., et al. Atomic Force Microscopy: An innovative technology to explore cardiomyocyte cell surface in cardiac physio/pathophysiology. Letters in Applied NanoBioScience. 4 (4), 321-324 (2015).
  43. Lieber, S. C., et al. Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (2), 645-651 (2004).
  44. Guedes, A. F., et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients. Nature Nanotechnology. 11 (8), 687-692 (2016).
  45. Zhu, Y., Dong, Z., Wejinya, U. C., Jin, S., Ye, K. Determination of mechanical properties of soft tissue scaffolds by atomic force microscopy nanoindentation. Journal of Biomechanics. 44 (13), 2356-2361 (2011).
  46. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  47. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
  48. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of Young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  49. Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C., Weiskirchen, R. The carbon tetrachloride model in mice. Laboratory Animals. 49, 4-11 (2015).
  50. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  51. Ribeiro, J. F., dos Anjos, E. H. M., Mello, M. L. S., de Campos Vidal, B. Skin collagen fiber molecular order: A pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. PLoS One. 8 (1), 54724 (2013).
  52. Ozkan, A., et al. The influence of chronic liver diseases on hepatic vasculature: A liver-on-a-chip review. Micromachines. 11 (5), 487 (2020).
  53. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  54. Khajehahmadi, Z., et al. Liver stiffness correlates with serum osteopontin and TAZ expression in human liver cirrhosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 1465 (1), 117-131 (2020).
  55. Tian, M., et al. The nanomechanical signature of liver cancer tissues and its molecular origin. Nanoscale. 7 (30), 12998-13010 (2015).
  56. Zhao, G., et al. Mechanical stiffness of liver tissues in relation to integrin β1 expression may influence the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 102 (5), 482-489 (2010).
  57. Gang, Z., Qi, Q., Jing, C., Wang, C. Measuring microenvironment mechanical stress of rat liver during diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis by atomic force microscope. Microscopy Research and Technique. 72 (9), 672-678 (2009).
  58. Sader, J. E., et al. Spring constant calibration of atomic force microscope cantilevers of arbitrary shape. The Review of Scientific Instruments. 83 (10), 103705 (2012).
  59. JPK Instruments. A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis. JPK Instruments Technical Note. JPK Instruments. , 1-8 (2016).
  60. van Eysden, C. A., Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids. Journal of Applied Physics. 101, 044908 (2015).
  61. Kim, Y., Yang, Y. I., Choi, I., Yi, J. Dependence of approaching velocity on the force-distance curve in AFM analysis. Korean Journal of Chemical Engineering. 27, 324-327 (2010).
  62. Hermanowicz, P., Sarna, M., Burda, K., Gabryś, H. AtomicJ: An open source software for analysis of force curves. The Review of Scientific Instruments. 85 (6), 063703 (2014).
  63. Hermanowicz, P. AtomicJ 2.3.1 User's Manual. , (2021).
  64. Iwashita, M., et al. Comparative Analysis of Brain Stiffness Among Amniotes Using Glyoxal Fixation and Atomic Force Microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  65. Crichton, M. L., et al. The viscoelastic, hyperelastic and scale dependent behaviour of freshly excised individual skin layers. Biomaterials. 32 (20), 4670-4681 (2011).
  66. Puricelli, L., Galluzzi, M., Schulte, C., Podestà, A., Milani, P. Nanomechanical and topographical imaging of living cells by atomic force microscopy with colloidal probes. The Review of Scientific Instruments. 86 (3), 033705 (2015).
  67. Hermanowicz, P. Determination of Young's modulus of samples of arbitrary thickness from force distance curves: Numerical investigations and simple approximate formulae. International Journal of Mechanical Sciences. 193, 106138 (2021).
  68. Han, R., Chen, J. A modified Sneddon model for the contact between conical indenters and spherical samples. Journal of Materials Research. 36, 1762-1771 (2021).

Tags

Biologi udgave 185 leverfibrose kollagenaflejringer leverstivhed elastisk modul atomkraftmikroskopi
Måling af leverstivhed ved hjælp af atomkraftmikroskopi kombineret med polarisationsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S.,… More

Ojha, S., Pribyl, J., Klimovic, S., Hadraba, D., Jirouskova, M., Gregor, M. Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63974, doi:10.3791/63974 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter